《Hela细胞传代培养.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Hela细胞传代培养.ppt（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Hela细胞传代培养实验目的：掌握动物细胞实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。培养的基本原理和方法。实验用具：离心管（实验用具：离心管（2 2支），支），移液枪（每个台面一把），移液枪（每个台面一把），枪头（每个台面一盒），枪头（每个台面一盒），吸管（吸管（4 4根），培养皿（每根），培养皿（每组组2 2个）个）实验药品：实验药品：0.250.25胰酶，胰酶，D DHanksHanks，16401640培养基培养基培 养 板 常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗浸泡（自来水）、刷洗浸泡（自来水）、刷洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（洗衣粉）、酸泡（洗衣粉）、酸泡（
2、洗衣粉）、酸泡（2424小小小小时）、时）、时）、时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和流水冲洗、蒸溜水浸泡和流水冲洗、蒸溜水浸泡和流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、冲洗、冲洗、冲洗、5050烘干烘干烘干烘干清洁液的配制HeLa HeLa 是是Henrietta Henrietta LacksLacks的简称，的简称，Henrietta Lacks Henrietta Lacks 是是一位患有子宫颈癌的一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖构，并无限次地繁殖分裂下去。分裂下去。细胞培养的甚本概念传代传代传
3、代传代 细胞在培养器皿中细胞在培养器皿中生长一定时间后，被生长一定时间后，被分开接种到新的培养分开接种到新的培养器皿中。器皿中。 原代培养原代培养原代培养原代培养 取自体内新鲜组织取自体内新鲜组织并置于体外条件下生并置于体外条件下生长的细胞在传代之前长的细胞在传代之前称为原代培养。称为原代培养。 培养细胞的特性贴附生长：必须贴附贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤长。见于各种实体瘤细胞。细胞。悬浮生长：悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物不需要贴附于支持物表面。见于各种造血表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。系统肿瘤细胞。每
4、代贴附生长细胞的生长过程游离期游离期贴壁期贴壁期潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期停止期（平台期）停止期（平台期）游离期 细胞接种后在培养细胞接种后在培养液中呈悬浮液中呈悬浮 状态也状态也称悬浮期。此时细胞称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球质回缩，胞体呈圆球形。形。 1010分钟一分钟一4 4小时小时 贴壁期贴壁期细胞附着于底物上，游离期细胞附着于底物上，游离期 结结束。细胞株平均在束。细胞株平均在1010分钟一分钟一4 4小小时贴壁。时贴壁。 血清中有促使细胞贴壁的冷析血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电白（生长基质），这些
5、带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）（化学合成的功能基团） 潜伏期潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为株潜伏期一般为6 62424小时。小时。 对数生长期：对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。进行实验研究。 停止期（平台停止期（平台期）期） 细胞长满瓶壁细胞长满瓶壁后，细
6、胞虽有活力但后，细胞虽有活力但不再分裂不再分裂 机制：接触抑机制：接触抑制、密度依赖性制、密度依赖性培养细胞生长的条件1 1 细胞的营养需要细胞的营养需要2 2 细胞的生存环境细胞的生存环境 温度温度: 37 : 37 O O2 2 CO CO2 2: 5% CO: 5% CO2 2 +H+H2 2O HO H2 2COCO3 3 H H+ + + HCO3+ HCO3- - pH: 7.2-7.4 pH: 7.2-7.4 渗透压渗透压 3 3 无污染无污染 4 4 无毒无毒 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细
7、胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。n箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种种 1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/ /分分）去上清，沉淀物加新培）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l l2 2一一2 23 3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，用吸管直
8、接吹打形成细胞悬液再传代。 2. 2.悬浮生长细胞传代（悬浮生长细胞传代（HelaHela细胞）细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3. 3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。2 细胞培养用液的配制D-Hanks原液试剂配方 氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（ Na HPO 2H O ） 0.6g 氯化钾 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三蒸水
9、 1000ml D D- -H Ha an nk ks s工工作作液液试试剂剂配配方方D D- -H Ha an nk ks s原原液液 1 10 00 0m ml l 三三蒸蒸水水 8 89 96 6m ml l 0 0. .5 5% % 酚酚红红液液 4 4m ml lD-HanksD-Hanks工作液试剂配工作液试剂配方方D-HanksD-Hanks原液原液 100ml 100ml 三蒸水三蒸水 896ml 896ml 0.5% 0.5% 酚红液酚红液 4ml 4ml 消化液：消化液： 胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞间
10、粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰胰蛋蛋白白酶酶液液浓浓度度越越高高，作作用用越越强强，但但超超过过一一定定限限度度会会损损伤伤细胞。细胞。 胰胰蛋蛋白白酶酶是是一一种种黄黄白白色色粉粉末末，用用无无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓缓冲冲液液配制常用的胰蛋白酶液浓度是配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25 。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基培养基（培养液）是维
11、持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。成培养基。天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。缺点：来源受限。 成分复杂，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，合成培养基是根据细
12、胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-1640RPMI-1640、 DMEM DMEM等。等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低成本低 缺点：缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。长需要。 人人工工合合成成培培养
13、养基基只只能能维维持持细细胞胞生生存存，要要想想使使细细胞胞生生长长和和繁繁殖殖，还还需需补补充充一一定定量量的的天天然然培培养养基基（如如血血清清）。 血清中含有：血清中含有：多多种种蛋蛋白白质质（白白蛋蛋白白、球球蛋蛋白白、铁蛋白等）铁蛋白等）多种金属离子多种金属离子 激素；激素； 促促贴贴附附物物质质，如如纤纤粘粘蛋蛋白白、冷冷析球蛋白、胶原等。析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分一般说来含一般说来含5 5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加但支持细胞生长一般需加 10 10血
14、清血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞无
15、血清培养基培养细胞无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如子，如激素激素、生长因子、生长因子 、结合蛋白结合蛋白 、贴壁和扩展因子贴壁和扩展因子 等。等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。19751975年年，SatoSato首首次次成成功功地地用用无无血血清清培培养养基基培培养养了了垂垂体体细细胞胞株株，近近2020多多年年来来已已报报道道了了几几十十种种细细胞胞系系在在无无血血清清培培养养基基中中成成功功地地生生长长和和增殖。增殖。无无血血清清细细
16、胞胞培培养养基基的的使使用用保保证证了了实实验验结结果果的的准准确确性性、可可重重复复性性和和稳稳定定性性，减减少少了了细细胞胞污污染染，简简化化了了提提纯纯和和鉴鉴定定各各种种细细胞胞产产物物的的程序。程序。向向无无清清培培养养液液中中能能促促进进细细胞胞系系生生长长的的补补加加物物都都是是独独特特的的。适适用用于于某某种种细细胞胞株株的的培培养养液液，很很可可能能不不适适合合另另一一种种细细胞胞株株的的生生长。即使长。即使同源组织的不同细胞株，所需同源组织的不同细胞株，所需补加物补加物也不同。也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大
17、多数人工合成培养基使用时还需添加血清目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 56 ，30 30 分钟分钟血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用：抗菌素的使用
18、： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100100单位。单位。 庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升100100单位单位方便、广谱、方便、广谱、稳定稳定完全培养基的组成基础培养基基础培养基 80 80一一9595血清血清 5 5一一2020（一般（一般加加1010）碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L 2.0 g/L青、链霉素青、链霉素 各各100100卑位
19、毫升卑位毫升实验前的准备培养基的配置培养基的配置培养基的配置培养基的配置RPMI-1640RPMI-1640培养粉培养粉 1 1袋袋 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g 2.0 g 青、链霉素青、链霉素 各各100100单位毫升单位毫升加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 1000ml, 过滤除菌。调节过滤除菌。调节pHpH值至值至7.27.2 加血清（终浓度加血清（终浓度 10 10）消化液的配置消化液的配置胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D Dhankshanks配置。配置。 配制常用的胰蛋白酶液浓度是配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25 。用滤。用滤器过滤除菌器
20、过滤除菌实验步骤1.1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。2 2从冰箱中取出从冰箱中取出0.250.25胰酶、胰酶、D DHanksHanks、培养基。、培养基。可以把胰酶和可以把胰酶和D DHanksHanks的瓶盖打开或者拧松。的瓶盖打开或者拧松。3.3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入入D DHanksHanks。轻轻摇动后将。轻轻摇动后将HanksHanks弃掉。弃掉。4.4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇
21、动。个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2 25 5分钟后迅速将分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。化适宜。5 5取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞
22、均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。以免损伤细胞。6 6至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。1000 1000 rpmrpm离心离心5 5分钟。（无需准确计数时离心可略）分钟。（无需准确计数时离心可略）7 7细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀
23、。（无需准确计数时离心可略）将细胞重悬、吹匀。（无需准确计数时离心可略）8 8吸量管吸取适量培养基吸量管吸取适量培养基1.5ml1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液加入新的培养皿中。细胞悬液0.5ml0.5ml加入新的培养皿中，培养密度为加入新的培养皿中，培养密度为1 1105105106/ML106/ML。显微镜下观察，。显微镜下观察，摇匀，放入摇匀，放入3737度度C02C02培养箱孵育。培养箱孵育。9 9待培养基（本身为红色），当待培养基（本身为红色），当pHpH值降低，培养基呈偏淡红色时，值降低，培养基呈偏淡红色时，一般一般2 2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。
