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1、（Fluorescence in situ hybridization,FISH）主讲：张奎学院：生物技术学院学号：222007331212003原位杂交（原位杂交（ISH）v原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。v原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。v使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。基本原理基本原理v根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。
2、用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。v3H、35S、125I、32P等 放射性同位素12荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质2v同位素原位杂交的不足之处：v1、不稳定v2、高背景v3、曝光时间长v4、结果统计处理繁琐v5、同位素的使用和处理几种原位几种原位杂交技交技术v1 基因组原位杂交技术v2 荧光原位杂交技术v3 多彩色荧光原位杂交技术v4 原位PCR荧光原位光原位杂交交v荧光原位杂交（Fluoresce
3、nce in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理的基本原理vFISH基本原理是利用同源互补的待检染色体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针,经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。发展展
4、历史史v1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。v20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。v1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。v1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位杂交技术。v他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。v1974 年，Evans
5、第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。v1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生物素与RNA 分子连接起来。v1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。v1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。v1985 年，原位杂交技术被引进到植物。v1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间
6、期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。v20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。FISH样本的样本的制备制备探针的制备探针的制备探针标记探针标记杂杂 交交（染色体显带）（染色体显带）荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析结果分析DNADNARNARNAPNAPNA将探针置于载玻片上杂交加盖玻片加盖玻片变性变性检测检测在荧光显微镜下观察在荧光显微镜下观察探针的制备v探针（probe)是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列。v杂交实验所选择的核酸探针可以分为三种：化
7、学合成、克隆和PCR。探针的分类探针的分类v根据化学组成，可以将探针分为DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探针。vDNA探针 这类探针应用最广，可以通过化学合成、克隆或PCR技术获得。vRNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。v肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺）。PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则v与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温
8、度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成，而且合成费用高，因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。v寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。探探针标记v为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部
9、位获得可识别的信号。v荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进行标记。v探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方法。v对探针进行标记时，可复制合成一段新探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。v均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。均匀标记均匀标记切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。该方法使用时应注意：A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎
10、，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口 C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行 v1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记v2、操作简单v3、标记率高末端标记末端标记v直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。v经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记引物。染色体染色体显带v显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一
11、个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析v每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。v染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效的方法。v染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。奥芬奥芬兰海水硝化海水硝化细菌菌荧光原位光原位杂交交全菌（采用EUB MIX型探针）氨氧化细菌（采用NSO1225型探针）全菌（采用EUB MIX型探针）亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针） 荧光原位光原位杂交交特点特点
12、v 优点v1、荧光试剂和探针经济、安全；v2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；v3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；v4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；v5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；v6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。v 缺点v1、不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。v2、必须在已知探针的情况下方可进行。FISH技术新进展技术新进展v随着FISH的广泛应用，FISH本身也得到长足进步。这主要表现在以下几个方面：v
13、探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂交用多种探针，即由单色荧光原位杂交发展为多色荧光原位杂交v标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种v杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到10步、2hv v一、基因定位v二、物理图谱的构建v三、染色体结构分析与数目测定v四、物种起源、进化和亲缘关系研究v五、转基因的细胞学鉴定v六、基因表达分析和临床病毒学检测荧光原位杂交荧光原位杂交的的应用应用荧光原位光原位杂交的交的发展展前景前景vFISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩，但是其深度与广度还不够，尤其与生产实践、经济效益的联系不够紧密。v随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发展,FISH 技术的应用范围在不断扩展, 今后该技术在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。
