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1、专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用 了解有关微生物及培养基的基础知识，了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。 一、知识目标：一、知识目标： 掌握掌握培养基的制备培养基的制备、高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌和和平平板划线法板划线法等基本操作技术，熟练、规范地等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。进行无菌操作，成功地培养微生物。 无菌技术的操作。无菌技术的操作。三、课题重点和难点：三、课题重点和难点：二、技能目标：二、技能目标：一、基础知识：一、基础知识：（一）培养基（一）培养基 人们按照
2、微生物对营养物质的不同需求，人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质配制出供其生长繁殖的营养基质。（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基和和液体培养液体培养基基。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数等，液体培养基常用于发酵定菌落、活菌计数等，液体培养基常用于发酵工业。工业。（2 2）按功能分：）按功能分：选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分分：）按成分分：天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途液体培养基与固体培养基选择
3、培养基:从微生物群中选择具有特定表型的细胞.使之进行繁殖所用的培养基,称为选择培养基. 加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物分离自养型微生物天然培养基有血清、天然培养基有血清、血浆、和组织提取液血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，营养成分丰富，培养效果好培养效果好缺点：缺点：来源
4、受限来源受限; ;成分成分复杂，影响对某些实复杂，影响对某些实验产物的提取和实验验产物的提取和实验结果的分析结果的分析; ;易发生支易发生支原体污染原体污染; ; 根据细胞生存所需物质的根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模种类和数量，用人工方法模拟合成的。拟合成的。 合成培养基主要成分是合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物、无机盐和其它一些辅助物质。物质。 优点：优点：标准化生产，组分标准化生产，组分和含量相对固定和含量相对固定; ;成本低成本低 缺点：缺点： 缺少某些成分，不缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需能完全满足
5、体外细胞生长需要。要。 合成培养基合成培养基: :天然培养基：天然培养基：2.2.不同的微生物往往需要采用不同的培养不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方基配方 (参考教材附录内容参考教材附录内容) 3. 3.不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和和氮源氮源、 无机盐无机盐、等等营养物质，营养物质， 另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pHpH、特殊营特殊营养物质养物质, ,例如例如: :生长因子生长因子(即细菌生长必需，而即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶酸、嘌呤、嘧
6、啶) )以及以及氧气氧气等的要求。等的要求。 营养物质 定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：CO2、NaHCO3有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等营养物质定义作用主要来源氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等二、无菌技术二、无菌技术1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，在培养微生物的操作中，所有防
7、止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要无论是随后将要学到的学到的倒平板倒平板、平板划线平板划线操作，还是操作，还是稀释涂稀释涂布平板法布平板法，其操作中的每一步都需要做到，其操作中的每一步都需要做到“无菌无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。 （）（）消毒定义：消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物微生物。（不包括芽孢和孢子）不包括芽孢和孢子）2.2.消
8、毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休休眠体眠体，叫做，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌. .孢子在生
9、物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞生殖细胞叫孢子。孢子的特点是能直接长成新个体。 （2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的所有的微生物微生物，包括芽孢，包括芽孢和孢子和孢子，而达，而达到到完全无菌完全无菌之过程。之过程。 灭菌消毒技术是微生物有关工作中最灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。普通也是最重要的技术。1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min
10、3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法: :用用75%75%酒精进行皮肤酒精进行皮肤消毒消毒; ;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(1)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌(2)灭菌的方法：灭菌的方法：2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下下维持维持15-30min. 最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可以杀，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，灭所有的生物，包括最耐热的某些微
11、生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为了防。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的可采用硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。其他微生物不能通过。 1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么
12、目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。三、实验操作三、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）制备
13、牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，调节PH为7.07.2。在肉汤培养基中加入1520g的琼脂，即制成牛肉膏蛋白胨固体培养基。1 1计算计算2 2称量称量3 3溶化溶化4 4灭菌灭菌5 5倒平板倒平板操作步骤操作步骤倒平板技术倒平板技术倒平板技术倒平板技术 1. 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？度？ 答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，
14、感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？还能用来培养微生物吗？为什么？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝
15、固答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。培养微生物。2 2、纯化大肠杆菌、纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法平板划线法: :
16、通过接种环在琼脂固体培通过接种环在琼脂固体培养基表面连续养基表面连续划划线的操作线的操作, ,将聚集的菌将聚集的菌种种逐步稀释分散到培养基的表面逐步稀释分散到培养基的表面. . 在数次在数次划划线后线后, ,可以分离到由一个细胞可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体, ,这就这就是菌落是菌落. .微生物的接种技术微生物的接种技术微生物的接种技术微生物的接种技术平板划线操作平板划线操作菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌个肉眼可见的，具
17、有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌细菌的菌落特征因落特征因种而异种而异平板划线时不能划破培养基的原因平板划线时不能划破培养基的原因一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。破处生长，会形成一个条状的菌落。 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束
18、时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
19、划线结束后灼烧目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。免细菌污染环境和感染操作者。 2. 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3. 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处
20、要少，每次从上一次划线的末端开始，能始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法稀释涂布平板法涂布平板操作涂布平板操作 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第想一想，第2 2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，。例如，酒精灯与培养皿的距
21、离要合适、吸管头不要接酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。等。四、课题成果评价四、课题成果评价 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求如果
22、培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录菌种的保存菌种的保存菌种的保存菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于
23、置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法本课题知识小结本课题知识小结: :【典例解析典例解析】 例例1 1关微生物营养物质的叙述中，正确的关微生物营养物质的叙述中，正确的A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量 解析：解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于针对微生物的具体情况分析。对于A A、
24、B B选项，它的表达是选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如同时是氮源，如NHNH4 4HCOHCO3 3；有的碳源同时是能源，如葡萄；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C C选选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；可作为自养型微生物的碳源；NaHCONaHCO3 3，可作为自养型微生，可作为自养型微生物的碳源和无机
25、盐；而物的碳源和无机盐；而NaClNaCl则只能提供无机盐。对于则只能提供无机盐。对于DD选选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NHNH3 3可为硝化可为硝化细菌提供能量和氮源。细菌提供能量和氮源。答案：答案：D例例2 2下面对发酵工程中灭菌的理解下面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确不正确不正确的是的是A.A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.消灭杂菌消灭杂菌C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前答案：答案：B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。解析：灭菌是微生物发酵过程的一
26、个重要环节。A A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；所以是正确的；B B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。全部微生物。C C是正确的，因为与发酵有关的所有设备是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。所接菌种也杀死。
