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1、第七章基因定位和图位克隆一、主要分子标记分类分分子子标标记记的的类类型型随机引物特异引物DNA杂交为基础PCR扩增为基础单核苷酸多态性RAPD、AFLPAPPCR、ISSRSSR、STS、SCAR、CAPSSSCP、TGGE、DGGESNPRFLP1.广泛使用的分子标记技术比较2.理想的分子标记的界定理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(5)选择中性（即无基因多效性）；(6)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(7)开
2、发成本和使用成本尽量低廉；(8)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。2.1限制片段长度多态性(RFLP，RestrictionFragmentLengthPolymorphism)RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染
3、色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是Hind，BamH,EcoR,EcoRV,Xba,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。vRFLPRFLP
4、标记的特点标记的特点1)RFLP标记稳定可靠，检测不受环境条件和发育阶段的影响。2)RFLP标记在等位基因间是共显性的 。3)在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应 。4)RFLP标记源于基因组DNA自身的变异，在数量上几乎不受限制。v由于目前RFPL技术仍然昂贵而费力，操作复杂，而且所需DNA样品量大，对于涉及许多个体（200以上）的鉴定研究并不可取。2.2随机扩增的多态性DNA(RAPD,RandomamplifiedpolymorphicDNA)RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增的多态性DNA)RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系
5、列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能
6、导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。vRAPDRAPD的特点：的特点：RAPD技术比RFLP简单，容易掌握。它既克服了同工酶位点偏少的缺点，又避免了RFLP操作复杂的弊端，更因其不需使用同位素进行分子杂交，从而使得一般的实验室亦能操作。 vRAPD分子
7、标记多为显性标记，只有少数可发展成为共显性标记，提供的信息量有限，且掩盖了显性纯合体与杂合体的区别，标记本身也大多是完全显性遗传；vRAPD技术假阳性率高，在实验条件不很严格的实验室，假阳性出现的机率更高；vRAPD技术要求DNA纯度较高，对反应条件敏感，重复性差；v对于实验已取得的标记，必须转化成其它类型的标记，才能实现基因定位与丰富遗传图谱。2.3扩增片段长度多态性(AFLP，Amplifiedrestrictionfragmentpolymorphism)是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限
8、制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同,基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。vAFLPAFLP的特点的特点多态性水平相当高，且稳定可靠，但需DNA模板量大，操作步骤复杂，成本太高，同时，它还是专利技术。2.4简单重复序列间扩增标记
9、(ISSR，intersimplesequencerepeat)ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在SSR的5或3端加锚14个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，因此，ISSR标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。 vISSR的特点操作简单、 成本低、检测多态性能力强、所需DNA模板的量少已成功地运用于居群生物学的研究、品种鉴定、物种的分类系统学比较，并作为构
10、建遗传图谱的工具。但ISSR标记一般是显性遗传的，每个引物可以扩增出6条左右的带，因而不能用于杂交水稻种子纯度鉴定。2.5微卫星(microsatellite)或称简单序列重复(SSR，simplesequencerepeat)微卫星DNA，指的是基因组中由16个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。v SSRSSR标记的特点SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点有设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验
11、室重复并共享。vSSRSSR 标记的优点标记的优点1)SSR不需要使用同位素，减少了对工作人员的危害；2)SSR实验中DNA的用量很少，减少了大量的提取工作，实验过程中不需要Southern转移、分子杂交等一系列繁琐程序，因此省工、省力；3)SSR所用的实验材料，不需经过有性世代，可以采用任何单一亲本，任何部位的材料，在线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用。2.6特定序列位点(STS，sequence-taggedsite)特定序列位点(sequence-taggedsite，缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAP
12、D、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性（如难以鉴别片段的来源）。2.7EST(expressedsequencetags)EST(expressedsequencetags)为分子标记的开发提供了宝贵的资源.与来自于基因组DNA开发的传统标记相比,以EST为基础的分子标记是一种新型分子标记,具有其显著的优势,如开发简便、信息量高和通用性好等,在多方面都有重要的利用价值.2.8序列特异性扩增区（ SCAR，Sequence-characterized Amplified Region）序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region
13、，SCAR）标记通常是由RAPD标记转化而来的。为了提高所找到的某一RAPD标记在应用上的稳定性，可将该RAPD标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物（18-24碱基左右）。也可只对该RAPD标记片段的末端进行测序，根据其末端序列，在原来RAPD 所用的10碱基引物上增加相邻的14个左右碱基，成为与原RAPD片段末端互补的特异引物。以此特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增，便可扩增出与克隆片段同样大小的特异带。这种经过转化的特异DNA分子标记称为SCAR标记。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。若待检
14、DNA间的差异表现为扩增片段的有无，可直接在PCR反应管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，从而检测DNA间的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体。相对于RAPD标记，SCAR标记由于所用引物较长及引物序列与模板DNA完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好、可重复性强。随着研究工作的发展，会有越来越多重要作物农艺性状的SCAR标记被开发出来，它们将在分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。3.3.分子标记在分子生物学研究中的应用分子标记在分子生物学研究中的应用1 用于种属特异性鉴定，新品种的保护2 确定进化关系 3 外源
15、导入基因的追踪4 鉴定染色体上特异的DNA片段，寻找与靶基因连锁的分子标记，进行基因定位和基因分离5 遗传作图6.杂交种子纯度鉴定 二、基因定位的方法二、基因定位的方法1体细胞杂交法 体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学（somatic genetics）。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件，并可建立细胞株，长期保存，进行各种正常和病理研究。与基因定位有关的是体细胞杂交（somatic cell hybridization）。细胞杂交又称细胞融合（cell fusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞
16、杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞（hybrid cell）进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybrid cell)，含有双亲不同的染色体。杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号
17、染色体上。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。2克隆嵌板法（clonepanelmethod）克隆嵌板法（clonepanelmethod）是应用杂种细胞保留或丢失染色体有时有重叠现象而设计的一种简便有用的基因定位方法。在体细胞杂交基础上还发展了微细胞（microcell）技术3原位杂交和荧光原位杂交重组DNA技术的建立与分子杂交相结合，从分子水平研究基因定位，发展了一系列有效方法。例如原位杂交（insituhybridization）就是分子杂交技术在基因定位中的应用，也是一种直接进行基因
18、定位的方法。分子杂交的基本原理是碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链或DNA-RNA链在一定条件下能结合成双链，用放射性或非放射性物质标记的DNA或RNA分子作为探针，可探测到细胞基因组中的同源部分。1970-1978年首次将分子杂交法应用于基因定位，即用及珠蛋白基因的cDNA为探针，与各种不同的人/鼠杂种细胞进行杂交，再对DNA杂交情况进行分析，找出cDNA探针与人染色DNA顺序间的同源互补关系，从而将人及珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上。4连锁分析基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗
19、传标记相连锁的特点进行定位。生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两个相邻的基因座位，距离较远，发生交换的机会较多，则出现基因重组；若两者较近，重组机会较少。重组DNA和分子克隆技术的出现，发现了许多遗传标记多态位点，利用某个拟定位的基因是否与某个遗传存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位，使经典连锁方法获得新的广阔用途，成为人类基因定位的重要手段。染色体上两个位点从亲代传给子代时，若相距1cM，就有1%的重组机会。整个人类基因组含3.2109bp，相应约有3300cM，每个染色体平均约有150cM，1cM约为1000kb。因此，一个致病基因和标记位点
20、紧密连锁，二者不须在同一条染色体的同一区段，一条染色体可以产生大量的DNA多态，只要提供足够的家系，按孟德尔方式遗传的疾病都可将其基因定位。三、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记通过建立分子遗传图谱，可同时对许多重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上已构建了以分子标记为基础的遗传图谱。这些图谱在重要农艺性状基因的标记和定位、基因的图位克隆、比较作图以及MAS育种等方面都是非常有意义的。但是由于分子标记数目的限制，目前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割裂开来。因此，根据育种目标选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作
21、物的品种品种图谱，将作物图谱构建和寻找与农艺性状基因紧密连锁的分子标记有机结合起来。遗传作图的原理与经典连锁测验一致，即基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组。用重组率来表示基因间的遗传距离，图距单位用厘摩(centiMorgan，cM)表示，一个cM的大小大致符合1的重组率。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映DNA的实际长度。1.遗传图谱构建的主要环节：1.1根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；1.2群体中不同植株的标记基因型分析；1.3借
22、助计算机程序构建连锁群。因此，要构建好的遗传图谱，首先应选择合适的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度，遗传图谱的准确性及所建图谱的适用性。亲本间的差异不宜过大，否则会降低后代的结实率及所建图谱的准确度。而亲本间适度的差异范围因不同物种而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。如玉米的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记作图群体，而番茄的多态性较差，因而选用不同种间的后代构建分子标记作图群体。用于分子标记的遗传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分离群体，包括F2群体、BC等；另一类为加倍
23、单倍体(doubledhapd，DHL)和重组近交系(recombinantlnbredLines，RIL)等永久性群体。自花授粉作物与异花授粉作物作图群体的构建方法如图175所示。F2群体构建比较省时。但由于每个F2单株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了该群体的作图能力。BC群体是由F1与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较为简单，但提供的信息量少于F2群体，且可供作图的材料有限，不能多代使用。若通过远缘杂交构建的F2作图群体，易发生向两极疯狂分离，标记比例易偏离3：1或1：2：1。第二类为永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。RIL群体
24、是由F2经多代自交一粒传(Singleseeddescendant，简称SSD)使后代基因组相对纯合的群体。RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协同研究，而且作图的准确度更高。缺点是建立RIL群体相当费时，而且有的物种很难产生RIL群体。DH群体是通过对Fl进行花药离体培养或通过特殊技术(如棉花的半配生殖材料)得到单倍体植株后代，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体。因此DH群体也能够长期保存。但构建DH群体需深厚的组织培养基础和染色体加倍技术。与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面长处：群体中各品系的遗传组成相对固定，可以通过种子繁殖代代相传，不断地增加新的遗传标
25、记，并可在不同的研究小组之间共享信息；可以对性状的鉴定进行重复试验以得到可靠的结果。这对于某些病害的抗性鉴定以及受多基因控制且易受环境影响的数量性状的分析尤为重要。许多重要的农艺性状，如抗病性、抗虫性、育性、一些抗逆性(抗盐、抗旱)等都表现为质量性状遗传的特点。由于这些性状只受单基因或少数几个主基因控制，一般均有显隐性，在分离世代无法通过表型来识别目的基因位点是纯合还是杂合，在几对基因作用相同时(如一些抗病基因对病菌的不同生理小种反应不同)，无法识别哪些基因在起作用。特别是一些质量性状虽然受少数主基因控制，但其中许多性状的表现还受遗传背景，微效基因以及环境条件的影响。所以利用分子标记技术来定位
26、、识别质量性状基因，特别是利用分子标记对一些易受环境影响的抗性基因的选择就变得相对简单。四、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记近等基因系(NIL)是Young等人最早提出来的。近等基因系的培育主要是通过多次的定向回交，它与原来的轮回亲本就构成了一对近等基因系。在回交导人目标性状基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交子代中(图176)。NIL作图的基本思路是鉴别位于导人的目标基因附近连锁区内的分子标记，借助于分子标记定位目标基因。利用这样的品系可在不需要完整遗传图谱的情况下，先用一对近等基因系筛选与目标基因连锁的分子标记，再用近等基因系间的杂交分离群体进行标记与目的基因连锁的
27、验证，从而筛选出与目标基因连锁的分子标记。Param等1991年运用212个随机引物对莴苣抗感霜霉病(Dm)的近等基因系进行了RAPD分析，将4个RAPD标记定位在Dml和Dm3连锁区域，6个定位在Dmll连锁区。用近等基因系方法，还筛选出燕麦锈病，大麦茎锈斑病，小麦的腥黑穗病，番茄的线虫、花叶病毒，烟草的黑根瘤等抗性基因以及很多其他的目标基因的分子标记。五、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记近等基因系的基因作图效率很高，但一个近等基因系的培育耗费时间长，既费工又费时，另外，许多植物很难建造其近等基因系，如一些林木植物既无可利用的遗传图谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能创造近等基因系。19
28、91年，Michelmore等提出了群体分离分析法(Bulkedsegregantanalysis，BSA)，为快速、高效筛选重要农艺性状基因的分子标记打下了基础。下面以某一抗病基因为例说明构建BSA群体的方法。用某一作物的抗病品种与感病品种杂交，F2抗病基因发生分离。依抗病性表现将分离群体植株分为2组，1组为抗病的，另1组为感病的。然后分别从两组中选出510株抗、感极端类型的植株提取DNA，等量混合构成抗、感DNA池。对这两个混合DNA池进行多态性分析，筛选出有多态性差异的标记，再分析F2所有的分离单株，以验证该标记与目标性状基因的连锁关系以及连锁的紧密程度。NIL和BSA分析方法见图176
29、。利用BSA法，Michelmore等(1991)从100个随机引物中筛选到3个与莴苣Dm58基因连锁，且遗传距离在15cM内的分子标记。Giovannoni等通过已知的RFLP遗传图谱，选择不同的RFLP基因型建立DNA混合库，筛选出与西红柿果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的RAPD标记。目前，利用该法已广泛用于主要农作物重要农艺性状基因连锁的分子标记筛选。六、数量性状基因的定位产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点。影响这类性状的表型差异由多个基因位点(数量性状位点，QTL)和环境共同决定，子代常常发生超亲分离。筛选与多基因控制的数量性状基因连锁的分子标记要比
30、筛选主基因控制的质量性状复杂得多。用于QTL分析的群体最好是永久性群体，如重组近交系和加倍单倍体群体。永久性群体中各品系的遗传组成相对稳定，可通过种子繁殖代代相传，并可对目标性状或易受环境因素影响的性状进行重复鉴定以得到更为可靠的结果。从数量性状遗传分析的角度讲，永久性群体中各品系基因纯合，排除了基因间的显性效应，不仅是研究控制数量性状基因的加性、上位性及连锁关系的理想材料，同时也可在多个环境和季节中研究数量性状的基因型与环境互作关系。永久性群体培育费用高，因此QTL的标记与定位也有用暂时性分离群体。开始时，分离群体用单标记分析方法进行QTL的定位。例如，在一个P2群体，给予任何一个特定的标记
31、M，如果所有MiMl同质个体的表型平均值高于M2M2同质个体，那么就可以推断存在一个QTL与这个标记连锁。如果显著水平设置太低，这种方法的假阳性高。此外，QTl不一定与任一给定的标记等位，尽管它与最近的标记之间具有很强的联系，但它的准确位置和它的效应还不能确定。区间作图的引入，克服了上述许多问题。它沿着染色体对相邻标记区间逐个进行扫描，确定每个区间任一特定位置的QTL的似然轮廓。更准确地说，是确定是否存在一个QTL的似然比的对数(LanderBostien，1989)。在似然轮廓图中，那些超过特定显著水平的最大值处，表明是存在QTL的可能位置。显著水平必须调整到避免来自多重测验的假阳性，置信区
32、间为相对于顶峰两边各1个LOD值的距离。它一直是应用最广的一种方法，特别是它应用于自交衍生的群体。其软件MapmakerQTL(Whiteheadlnstitute，1993)是免费提供的。尽管已对该方法进行过许多精度和效率的研究，但都没有产生重要的修改。第2种方法是HaleyKnott(1992)发展的多元回归分析法。该方法相对LOD作图而言，在精度和准确度上与区间作图产生非常相似的结果，它具有程序简单、计算快速的优点，适合于处理复杂的后代和模型中包含广泛的固定效应的情形。例如，性别的不同和环境的不同。显著性测验和置信区间估计可利用Bootstrapping抽样方法。第3种方法是同时用一个给
33、定的染色体上的所有标记进行回归模型分析，利用加权最小平方和法或者模拟进行显著性测验(KearseyHyne，1994)。它具有计算速度快和在一个测验中利用所有标记信息的优点。如果一条染色体上只有一个QTL，所有定位和测定标记两侧之间的QTL效应的必要信息都可以利用。尽管你确实不知道哪些标记在QTL两侧或者每条染色体上只有一个QTL，不论QTL怎样在染色体上分布，多重标记方法确实提供了模型的整个测定。七、作物MAS育种MAS育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，同时，也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。目标基因的标记筛选(genetaggmg)是进行MA
34、S育种的基础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件：分子标记与目标基因紧密连锁(最好lcM或更小，或共分离)；标记适用性强，重复性好，而且能经济简便地检测大量个体(当前以PCR为基础)；不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。1、作物MAS育种需具备的条件利用分子标记进行MAS育种可显著提高育种效率。但是要开展MAS育种，必须具备如下条件：分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM，最好lcM或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，目前，主要应用自动化程度高，相对易于分析，且成本较小的PCR技术。筛选技术在不同
35、实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。由单基因或寡基因控制的质量性状的分子标记，易于用于MAS育种。对大多数数量性状遗传的重要农艺性状，若想利用MAS育种则必须具有精确的QTL图谱。这不仅需要将复杂的性状利用合适软件分成多个QTLs，并将各个QTL标记定位于合适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量性状表型进行准确检测的方法，用于作图的群体大小、可重复性、环境影响和不同遗传背景的影响，以及是否有合适的数量遗传分析方法等有关。这为筛选某一复杂农艺性状的QTL标记提出了更高要求，也增加了MAS付诸育种实践的难度。2、MAS育种方法筛选
36、与质量性状基因紧密连锁的分子标记用于辅助育种，可免受环境条件影响。Deal等(1995)将普通小麦4D长臂上的抗盐基因转移到硬粒小麦4B染色体上，利用与该抗盐基因连锁的分子标记进行选择，大大提高了选择效率。研究表明，在一个有100个个体数的回交后代群体中，借助100个RFLP标记选择，只需3代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的992，而随机挑选则需要7代才能达到。利用MAS技术在快速基因垒集方面也表现出其巨大优越性，国际水稻所(1RRl)Mackill等(1992)已将抗稻瘟病基因Pi1、PiZ5、Pita精确定位，并建立了分别具有这三个基因的等基因系。通过MAS聚合杂交获得3个抗稻瘟病基因垒
37、集到一个材料中的个体。在水稻Rfl基因的MAS育种方面也已有成功报道。2.1回交育种由单基因或寡基因等质量性状基因控制的主要农艺性状，若利用分子标记辅助选择，主要应用回交育种分析方法。针对每一回交世代结合分子标记辅助选择，筛选出含目标基因的优异品系，进一步培育成新品种。若利用分子标记跟踪选择回交后代中的QTIj，常由于该数量性状在后代中处于分离状态的QTL数目增加，需扩大回交群体，以增加所有QTL的有利基因同时整合在一个个体中的机会。另一方面，对多个QTLs进行回交转育，可能会将较大比例的与这些QTL连锁的供体基因组片段同时转移到轮回亲本中去。因此，该法不是利用分子标记辅助育种选择QTL性状的
38、最优方法。在回交育种过程中，尤其是野生种做供体时，尽管一些有利基因成功导人，但同时也带来一些与目标基因连锁的一些不利基因，成为连锁累赘(Linkagedrag)。利用与目标基因紧密连锁的分子标记可直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而避免了或显著减少了连锁累赘，加快了回交育种的进程。Young等研究发现，利用番茄高密度RFLP图谱对通过回交育种育成的抗病品种所含Lperu抗TMV的Tmv2渗入片段大小检测，最小4cM，最大超过51cM，可见常规育种对抗性基因附近的DNA大小选择效果不大；模拟结果显示，利用分子标记通过二次回交所缩短的渗入区段，在不用标记辅助时需100次回交才可达到同样效果。
39、1996年Tanksley提出了QTL定位和利用的AB分析方法(Advancedbackcrossanalysis)策略，即利用野生种或远缘的材料与优良的品种杂交，再回交23代，利用分子标记同时发现和定位一些对产量或其他性状有重要贡献的主效QTLs，这种方法已在番茄和水稻中被证实是行之有效的。例如，通过AB分析方法，发现Orufipogon水稻野生种中有2个可显著提高我国杂交稻产量的QTLs。和原杂交稻相比，每个QTL可提高产量大约17。而且这2个QTLs没有与不良性状连锁，因此，他们有很大的利用潜力。2.2MAS聚合育种在实际育种工作中，通过聚合杂交将多个有利目标基因垒集到同一品种材料中，培
40、育成一个具多种有利性状的品种，如多个抗性基因的品种，在作物抗病虫育种中保证品种对病虫害的持久抗性将有十分重要的作用。但是，由于导人的新基因表现常被预先存在的基因所掩盖或者许多基因的表型相似难以区分、隐性基因需要测交检测、或接种条件要求很高等，导致许多抗性基因不一定在特定环境下表现出抗性，造成基于表型的抗性选择将无法进行。MAS可利用分子标记跟踪新的有利基因导人，将超过观测阈值外的有利基因高效地累积起来，为培育含有多抗、优质基因的品种提供了重要的途径。利用MAS技术在快速垒集基因方面表现出巨大的优越性。农作物有许多基因的表现型是相同的，通过经典遗传育种研究无法区分不同基因效应，从而也就不易鉴定一
41、个性状的产生是由于一个基因还是多个具有相同表型的基因的共同作用。借助分子标记，可以先在不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中去，通过检测与不同基因连锁的分子标记有无来推断该个体是否含有相应的基因，以达到聚合选择的目的。南京农业大学细胞遗传所与扬州农科所合作，借助于MAS完成了Pm4a+Pm2+Pm6、Pm2+Pm6+Pm21、Pm4a+Pm21等小麦白粉病抗性基因的聚合，从而拓宽了现有育种材料对白粉病的抗谱，提高了抗性的持久性。利用具有单个不同抗性基因的4个亲本，通过MAS三个世代即可获得同时具有四个抗性基因的个体。国际水稻所Mackill利用MAS对水稻稻瘟病抗
42、性基因Pi1、pi-z5、pi-ta进行累集，获得了抗两种或三种小种的品系。利用RAPD与RFLP标记，Yoshimura等已将水稻白叶枯抗性基因Xal、Xa3、Xa4、Xa5与Xa10等基因进行了不同方式的聚合。在水稻中已将含有抗白叶枯基因Xa21的材料与抗虫基因材料杂交，利用Xa21的STS标记获得了同时具有Xa2，和抗虫基因的材料旷通常应用MAS聚合不同基因时，F2分离群体大小应以200500株为宜，先对易操作的分子标记进行初选，再进行复杂的RFLP验证，可提高聚合效率。随着育种目标的多样性，为了选育出集高产、优质、抗病虫等优良性状于一身的作物新品种，应考虑目标性状标记筛选时亲本选择的代
43、表性，即最好选择与育种直接有关的亲本材料，所构建群体也最好既是遗传研究群体，又是育种群体，在此基础上，多个目标性状的聚合需通过群体改良的方法实现。不容置疑，分子标记技术赋予了群体改良新的内涵，借助于分子标记技术可快速获得集多个目标农艺性状于一身的作物新品种。南京农业大学棉花研究所在多目标性状聚合的修饰回交方法育种的基础上，提出了MAS的修饰回交聚合育种方法。修饰回交是将杂种品系间杂交和回交相结合的一种方法，即回交品系间的杂交法。将各具不同优良性状的杂交组合分别和同一轮回亲本进行回交，获得各具特点的回交品系，再把不同回交品系进行杂交聚合。目前利用分子标记技术可对目标性状进行前景选择，对轮回亲本的
44、遗传背景进行背景选择，就可以达到快速打破目标性状间的负相关，获得聚合多个目标性状新品系的目的。2.3SISMAS(singlelargescaleMAS)这是Ribant等(1999)提出的。基本原理是在一个随机杂交的混合大群体中，尽可能保证选择群体足够大，保证中选的植株在目标位点纯合，而在目标位点以外的其他基因位点上保持大的遗传多样性，最好仍呈孟德尔式分离。这样，分子标记筛选后，仍有很大遗传变异供育种家通过传统育种方法选择，产生新的品种和杂交种。这种方法对于质量性状或数量性状基因的MAS均适用。本方法可分为三步：第1步：利用传统育种方法结合DNA指纹图谱选择，用于MAS的优异亲本，特别对于数
45、量性状而言，不同亲本针对同一目标性状要具有不同的重要的QTL，即具有更多的等位基因多样性。第2步：确定该重要农艺性状QTL标记。利用中选亲本与测验系杂交，将Fl自交产生分离群体，一般200300株，结合F2：3单株株行田间调查结果，以确定主要QTL的分子标记。表型数据必须是在不同地区种植获得，以消除环境互作对目标基因表达的影响。标记的QTL不受环境改变的影响，且占表型方差的最大值(即要求该数量性状位点必须对该目标性状贡献值大)。确定QTL标记的同时将中选的亲本间杂交，其后代再自交12次产生一个很大分离群体。第3步：结合QTL标记的筛选，对上述分离群体中单株进行SLSMAS。第4步：根据中选位点
46、选择目标材料，由于连锁累赘，除中选QTL标记附近外，其他位点保持很大的遗传多样性，通过中选单株自交，基于本地生态需要进行系统选择，育成新的优异品系，或将此与测验系杂交产生新杂种。若目标性状位点两边均有QTL标记，则可降低连锁累赘。3、提高分子标记的筛选效率3.1多重PCR方法为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应，这称为多重扩增。利用这种方法时需注意，设计或选择引物时，必须考虑各引物复性温度是否相匹配，且在扩增产物的大小上无重叠。研究表明，多重扩增使用Taq酶
47、量与一个引物扩增用量相同。这显著地降低了选择成本费用和筛选时间。如Ribaut等将筛选到的与热带玉米抗旱基因QTL连锁的1个STS，2个SSR标记使用多重扩增方法用于MAS选择，以改良其耐旱性，两人仅用了一个月就从BC2F1的2300个单株中选出300个目标单株。3.2用相斥相分子标记进行育种选择所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。这些选择特别在一些显性标记如RAPD标记中，效果较为显著。Haley等(1994)找到与菜豆普通花叶病毒隐性抗病基因bc3连锁的两个RAPD标记，其中标记1与bc3相引，距离为19cM；标
48、记2与bc3相斥，距离为71cM。用标记1选择的纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占263，725和12。而用标记2选择的结果分别是818，182和0。当将两个标记同时使用时，即相当于一个共显性标记。其选择效果与单独使用标记2的选择效果一致。一般认为，在育种早代选择中，利用相斥相的RAPD标记，与共显性的RFLP标记具有相似的选择效果。3.3克服连锁累赘回交育种是作物育种常用的育种方法，但回交育种中长期存在的问题是在回交过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导人受体，这种现象称为连锁累赘(Linkagedrag)。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以显著地减轻连锁累赘的
49、程度。如在大约150个回交后代中，至少有一个植株在其目的基因左侧或右侧lcM范围内发生一次交换的可能性为95，利用RFLP标记可以精确地选择出这些个体；在另一个有300个植株的回交群体中，有95的可能在被选择基因另一侧lcM范围内发生一次交换，从而产生目的基因大于2cM的片段。这个结果用RFLP选择只需2个世代就能够得到；而传统的方法可能平均需要100代。随着分子标记图谱的更加密集，选择重组个体的效率将进一步提高。因此，高密度的作物分子遗传图谱的构建是加速作物育种进程所必需的。4.降低MAS育种的成本进行MAS，首先是需把与目标基因(性状)紧密连锁(或共分离)的分子标记如RFLP、RAPD等转
50、化为PCR检测的标记。然后设法降低PCR筛选成本。可从以下几方面考虑：样品DNA提取。采用微量提取法如利用小量组织或半粒种子且不需液氮处理的DNA提取技术。且在提取过程中不利用特殊化学药品，降低提取缓冲液成本。减少PCR反应时的体积。如反应时的体积从251减到101。琼脂糖(Agrose)凝胶：实验表明同一Agrose胶可以多次电泳载样，而不会造成样品间互相干扰。扩增产物检测：通常PCR扩增产物用EB染色，LTV观测，使用Polaroidfilm照相系统。利用这种观测方法，不仅有致癌诱导剂，而且UV射线对眼睛损害很大，照相系统花费也很高。通过改造染色系统，利用美蓝又称亚甲蓝、甲烯蓝(Methy
51、leneblue)琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测。甚至若PCR扩增产物仅一种，则无需电泳，只需在反应管中加入EB，紫外灯下直接根据反应即可鉴定出目标基因型，大大降低了标记辅助选择成本，非常有利于大规模育种。这在中国春小麦Phlb基因的SCAR标记筛选上已有成功尝试。近十年多来，分子标记的研究已经得到快速发展，在许多作物中已定位了很多重要性状的基因，但育成品系或品种的报道还相对较少。究其原因主要有：标记信息的丢失。标记仍然存在，但由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向；QTL定位和效应估算的不精确性；上位性的存在，由于QTL与环境、QTL与QTL间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率
52、发生偏差；标记鉴定技术有待进一步提高。尽管近年来标记鉴定技术在实用性及降低成本方面都得到了很大发展，但对于大多数实验室来说，MAS还是一项费时耗资的工作。尽管目前MAS的成功应用还存在诸多困难，但MAS在未来作物育种中的作用是毋庸置疑的。相信在不久的将来，随着分子生物技术的进一步发展以及各种作物图谱的日趋饱和，MAS会发挥它应有的作用。5.定位水稻矮杆基因定位定位水稻矮杆基因定位用潇湘矮，湘早143（早籼）及两亲本杂交产生的116个F2代高秆株与116个F2代矮秆株构建成一个高秆基因池与一个矮秆基因池。以分布于水稻染色体1-12的359对微卫星引物对两亲本及两个DNA集群进行DNA多态性分析。
53、 用快速提取法提取每个水稻植株叶片DNA，采用PCR扩增进行分析，应用已筛选出的位于染色体上的多态性引物RM249对116个矮秆个体进一步验证RM249与矮秆基因的连锁关系，根据分离比例，初步判定目标基因与RM249标记的遗传距离为1个图距单位（1cM）。是一个新的矮杆基因高杆高杆高杆高杆矮杆矮杆矮杆矮杆高杆基因池高杆基因池高杆基因池高杆基因池矮杆基因池矮杆基因池矮杆基因池矮杆基因池利用微卫星分子标记，以水稻品种二九青和日本北利用微卫星分子标记，以水稻品种二九青和日本北海道地区的栽培品种海道地区的栽培品种Yukihikari杂交得到的重组自杂交得到的重组自交系为材料，用交系为材料，用89个微卫
54、星分子标记构建了该群体个微卫星分子标记构建了该群体的分子连锁图谱，对的分子连锁图谱，对水稻苗期耐冷性数量性状基因水稻苗期耐冷性数量性状基因进行了定位。进行了定位。 6. 定位水稻耐冷基因定位水稻耐冷基因定位了两个稳定的促进低温下幼苗生定位了两个稳定的促进低温下幼苗生长的长的QTLS，它们位于染色体，它们位于染色体1上的上的RM104位点和染色体位点和染色体9上的上的RM160位位点，这两个位点控制的表型变异分别点，这两个位点控制的表型变异分别为为23.51%和和15.25%。 水水水水 稻稻稻稻 苗苗苗苗期期期期耐耐耐耐冷冷冷冷性性性性有有有有关关关关的的的的QTLsQTLs（低低低低温温温温
55、下下下下幼幼幼幼苗苗苗苗高高高高度度度度在在在在分分分分子子子子图图图图谱谱谱谱上上上上的位置的位置的位置的位置 I I：二九青：二九青：二九青：二九青基因型增加低基因型增加低基因型增加低基因型增加低温下幼苗高度温下幼苗高度温下幼苗高度温下幼苗高度图1v利用典型粳稻品种利用典型粳稻品种北海北海289和典型籼稻品种和典型籼稻品种Dular杂交的杂交的118个个F2分离群体为材料，构建了分离群体为材料，构建了一张包含一张包含79个微卫星标记的水稻分子连锁图谱。个微卫星标记的水稻分子连锁图谱。定位了一个位于定位了一个位于染色体染色体9上的上的RM160位点，它是位点，它是一个同时具有抵抗低温下幼苗生
56、长迟钝，缺绿，一个同时具有抵抗低温下幼苗生长迟钝，缺绿，枯萎和死苗的多效枯萎和死苗的多效QTL基因位点。它引起三者基因位点。它引起三者表型变异分别为表型变异分别为17.19%、33.27%和和7.47%。 v定定位位了了一一个个控控制制致致死死温温度度下下枯枯萎萎和和死死苗苗的的主主效效QTL，位位于于染染色色体体11上上的的RM244位位点点，控控制制的表型变异达的表型变异达49.34%。水稻苗水稻苗期耐冷性有关期耐冷性有关的的QTLsQTLs（低温（低温下叶绿素含量，下叶绿素含量，致死温度下的致死温度下的枯萎和死苗）枯萎和死苗）在分子图谱上在分子图谱上的位置的位置C C：缺缺绿绿抗抗性性
57、D D：低低温温致致死死抗抗性性 I I：二二九九青青基基因因型型增增加加抗性抗性图27 7、分子标记辅助选择育种、分子标记辅助选择育种vDNA分分子子标标记记辅辅助助育育种种技技术术，是是利利用用与与目目标标性性状状紧紧密密连连锁锁的的DNA分分子子标标记记对对目目标标性性状状进进行行间间接接选选择择的的现现代代育育种种技技术术。该该技技术术不不仅仅可可在在早早代代进进行行准准确确、稳稳定定的的选选择择，而而且且可可克克服服再再度度利利用用隐隐性性基基因因时时识识别别难难的的问问题题，从从而而加加速速育育种种进进程程，提高育种效率。提高育种效率。 研究方法研究方法 分子标记辅助育种技术图解：
58、分子标记辅助育种技术图解：优质晚籼品种PL5（如湘晚籼11号）F1优质晚籼品种（轮回亲本）BC1F1(CAPS标记筛选)优质晚籼品种BC2F1(CAPS标记筛选)优质晚籼品种BC3F1(CAPS标记筛选)BC3F2抗冷新品种QTL分析及精确定位技术图解：分析及精确定位技术图解：籼稻P1（耐冷）粳稻P2（不耐冷）F1P1（轮回亲本）F2BC1F1耐冷性鉴定，SSR标记进行耐冷基因定位定位的SSR标记附近的BC1F2YAC克隆筛选STS标记、CAPS标记。BC1F3耐冷性鉴定（CAPS、STS标记筛选）抗纹枯病基因连锁的分子标记筛选及在染色体上的定位：（1）建立水稻抗纹枯病的F2分离群体，分析测定
59、F2各单株的抗性，进行抗纹枯病的遗传分析；（2）制备亲本、F2各单株（100株以上）的核DNA，取15株抗病株的DNA（B1）和15株感病植株的DNA（B2），建成两个DNA集群(B1和B2)，然后对两个亲本（P1和P2）及两个集群（B1和B2）进行DNA多态性分析（RAPD、AFLP和SSR等），寻找与抗性基因连锁的分子标记；（3）用100个F2个体进一步验证，得到连锁标记与抗性基因的连锁关系；（4）将连锁标记克隆，转变成RFLP标记，然后对F2单株进行共分离分析，验证得到的连锁标记与抗性基因的连锁关系，并测定连锁标记与抗性基因之间的遗传距离；（5）把表现为共分离的克隆进行测序，再合成新的常
60、规PCR引物，最终将其转变成SCAR标记，用于分子标记辅助选择育种。6.据已发表的抗病基因保守区域的特异序列，设计几套PCR引物，对抗病水稻材料（中间桥梁材料）和对照材料进行特异PCR扩增，找出抗病材料和对照材料的多态性产物；7.在扩增出的产物中，判断出哪一条可能与抗病基因有关的特异片段；8.将特异片段克隆、测序；9.用图位克隆进行染色体精确定位；10与已知的十几种抗病基因进行同源性比较和结构分析，确证抗病基因。v利用已定位的孕穗期耐冷性基因紧密连锁的SCAR标记Y2668L和R251正在进行分子聚合育种。图图1 染色体染色体11上上G181附近重组体物理图谱附近重组体物理图谱图2水稻染色体1
61、1上耐冷基因高密度物理和分子图谱湘晚31/北海PL5群体S13316A、G389A标记选择结果湘晚31/北海PL5群体的S13316A标记选择结果M：100bpDNA分子量标记；1：北海PL5；2：湘晚31；310：湘晚31/北海PL5单株图8湘晚31/北海PL5群体的G389A标记选择结果注：M：100bpDNA分子量标记；1：北海PL5；2：湘晚31；310：湘晚31/北海PL5单株 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M湘晚29/北海PL5群体的S1
62、3316A、G389A标记选择结果湘晚29/北海PL5群体的S13316A标记选择结果M：100bpDNA分子量标记；1：北海PL5；2：湘晚29；310：湘晚29/北海PL5单株湘晚29/北海PL5群体的G389A标记选择结果M：100bpDNA分子量标记；1：北海PL5；2：湘晚29；310：湘晚29/北海PL5单株图位克隆基因原理与方法从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指的是以欲克隆基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或表型突变来进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径则着眼于基因本身，根据被克隆的目的基因在染色
63、体上都有稳定的位置来实现。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。图位克隆(map-basedcloning)又称为定位克隆(positionalcloning)，1986年首先由剑桥大学的Coulson等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA
64、序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着模式物种（以拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和种数据库的完善。图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。1.图位克隆相关技术的发展大片段DNA克隆载体的发展和高密度的DNA分子连锁图谱的构建为图位克隆技术的实际应用成为了可能，而一些模式生物基因组测序的完成，则使在这些生物及同料属生物间图位克隆一个目的基因的时间大为缩短。2. 分子标记技术的发展分子标记技术的发展实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的
65、分子标记。实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选。3、图位克隆的策略自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到AB13基因(Giraudatetal.,1992)和FAD3基因(Arondeletal.,1992)以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域
66、的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因。高质量、容易操作的基因组文库的构建高质量、容易操作的基因组文库的构建基因组大片段插入文库的发展主要经历了噬菌体和Cosmid文库和人工染色体文库。作为第一代发展的代表噬菌体和Cosmid文库虽然比较稳定、易分离及转化率高等优点，但插入的片段较小，都在2545Kb之间。图位克隆理论上可以适用于任何生物，但主要还是用于真核生物。真核生物一般含有大量的内含子，只有容纳大片段插入子的克隆载体，才能携带完整的基因。人工染色体的出现基本上克服了DNA容载的问题
67、，最早发展的人工染色体是YAC。1983年Murray和Szostak首次构建了总长度为55Kb的YAC。1987年Burke得到了能够克隆大片段DNA的YAC载体。证明YAC可以构建高等生物的完整基因组文库。酵母人工染色体（YAC）具有着丝粒（CEN）、端粒（TEL）及复制起始点（ARS），能够在酵母细胞中自主复制。YAC尽管有较大的容量，但也存在着一些缺陷：嵌合现象(chimericphenotype)的存在（占全部克隆的40%60%）。在同一YAC克隆中嵌合两个不连续的大片段，来自不同染色体或同一染色体的不连续的区域，这些克隆很不适合测序和作图工作；稳定性差(unstability)，在
68、一些克隆中存在序列重排(sequencerearrangement)和插入丢失(insertdeletion)现象；插入DNA分离与纯化困难；转化效率低。这些缺点限制了YAC的应用。后来陆续发展了P1，BAC，PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。值得提及的是进展一直缓慢的哺乳动物人工染色体（MAC）和人类人工染色体（HAC）也已取得突破性进展。其中常用的有限制性内切酶酶切片段长度多态性标记(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、测定序列标签位点(s
69、equencetaggedsite,STS)、表达序列标签(expressedsequencetag,EST)、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisim,SNP)、简单顺序长度多态性(simplesequcucelengthpolymorphism,SSLP)、简单重复顺序即微卫星DNA标记(simplesequencerepeat,SSR)、扩增的限制性内切片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)等。这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记，一般表现出稳定、可靠的特点，有的使用成本也相对较低
70、，特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记，尤其是与目标基因共分离的标记。因此能够加快克隆基因的进程，研究者可依据不同的研究目标、对象、目的、条件等，选择使用这些技术。另外随着分子标记技术的发展，一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也取得了很大的进步，现在已经建图的植物达十几种物，其中包括了所有重要的农作物。水稻、玉米、蕃茄、小麦、马铃薯、拟南芥等重要经济作物和模式植物的遗传图谱已相当精细，含有数百甚至数千个标记。如Harushima等（1998）将水稻图谱的分子标记加密到2275个，总遗传距离达到1521.cM；到2001年定位到该图谱上的分子标记已达3000多个，这为克隆基因和研究基因表
71、达及调控奠定了基础。随着比较基因组学的兴起，可以利用同科异种间染色体的共线性以模式植物为种间图位克隆中介来克隆基它植物基因。Kilian等（1997）曾以水稻为图位克隆中介来克隆大麦杆锈病抗性基因Rpg1和Rpg，并建立了3.6个分子标记/0.1cM的区域高密度分子标记连锁图，而且鉴定了一个覆盖Rpg1区域的水稻BAC克隆，精细作图证明一个20Kb水稻基因组片段包含Rpg1两侧的分子标记。4.图位克隆的一般步骤4.1 筛选与目标基因连锁的分子标记筛选与目标基因连锁的分子标记 这一步相当于对目的基因在染色体上进行初步定位，利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于一定的染色体区域
72、内。笼统的说，我们是通过验证分子标记的多态性来确立目标基因与分子标记的遗传连锁关系。目前，初定位目的基因常用近等基因系法（Nearisogeniclines，NILs）和群组分离分析法（Bulksegregantanalysis,BSA）。近等基因系是一系列回交过程的产物，理论上近等基因系间除了目的基因及邻近区不同外，其它区段应完全一致。因此，如果在近等基因系中检测出多态性，差异就必定在目的基因及其邻近区域中。利用这一方法，Liang等（1994）定位了一个水稻半矮秆基因Sdy。但近等基因系法由于基因连锁的结果，在回交导入目标性状基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段也随之进入子代中，出现连锁
73、累赘现象，且构建NILs周期过长，而限制了该法的广泛应用。群组分离分析法（BSA）是由Michelmore等（1991）提出的。其原理是将分离群体（F2、BC1、DH系等）中的个体依据研究的目标性状（如抗病、感病）分成两组，在每一组群体中将各个体DNA等量混合，形成两个DNA池（如抗病池和感病池）。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。通过初步定位我们一般可以筛选出距目的基因的遗传距离一般为510cM的两个侧面连锁的分子标记，这样就可以进行下一步的精细定位工作。4.2.目的基因部位的精细定位和作图目的基因部位的精细定位和作图精细定位最终目标是将包含突
74、变基因的遗传间隔缩小到0.5cM甚至更小，显然用于作图的定位群体越大，就越能精确地定位突变基因。一般需要包含30004000个生物个体的定位群体来精解地定位目的基因就可以了。但如果目的基因在着丝粒附近，1cM相当于1000Kb左右，再加上着丝粒附近染色体重组率低，要想获得与目标基因紧密连锁的分子标记就必须建立更大的定位群体，这样可以为后面的染色体步行节省时力。因此，精细定位工作是图位克隆一个基因过程中最为耗时耗力的步骤，也是限速的一步。增加一个已知区域内的分子标记的方法一般有，首先整合已有的遗传图谱，将各种不同遗传图谱中的分子标记整合到一块，可以提高分子标记的密度；再次可以增加新的分子标记，如
75、在水稻、拟南芥这些已经测序的生物上，我们就可以利用目的基因两侧的DNA序列和分子标记设计软件（SSRhunter、PrimerPremier5.0等）来大量设计新的分子标记；另外，也可以利用比较基因组的共线性从其它同科属的生物上获得分子标记。用这些分子标记对建图群体进行精细定位，以期找到与目的基因更紧密连锁的分子标记甚至共分离的分子标记。对定位群体较大需要对单株进行分析、提取大量DNA的问题，可根据Churchill等（1993）提出DNA混合样品作图的方法进行实验设计。DNA混合样品作图是指把大群体整中所需进行分子标记多态鉴定的单株（个）分成若干组（可520个单株一组），根据所有池中的分子标
76、记与目的基因发生的重组来确定目的基因附近分子标记的顺序。以组为单位提取DNA，形成一个组内混合的DNA提取的工作量，利用扩大群体，加速克隆进程。4.3 染色体步行和登陆染色体步行和登陆染色体步移(chromosomewalking)是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重复的序列，而慢慢的靠近目的基因，开始步移的克隆可以是已知的基因、RFLP、RAPD或其它已鉴定的分子标记，用它来杂交筛选大片段DNA文库中的阳性克隆，找出与目的基因两侧连锁最紧密的分子标记所在的大片段克隆，接着分别从两侧分子标记所在的克隆为起点进行染色体步行，逐步靠近目的基因。以大片段克隆的末端为探针，筛选基因组文库因组文
77、库，鉴定和分离邻近的基因组片段的克隆，再将这个克隆的远端末端作为探针重新筛选基因组文，继续这一过程，直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段克隆或跨叠群。当遗传连锁图谱指出基因所在的特定区域时，即可取回需要的克隆，获得目标基因。染色体步行在实际运用中的主要困难是当在克隆的一端遇到大量重复的DNA序列时，步行的方向会被打乱；另外如果步行必须经过一个间隙时，步行的过程就会把打断。这样都会造成图位克隆的失败。为了克服这些困难，人们相继提出了染色体登陆、眺步和连接等方法。染色体登陆是找出与目标基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记，一般找到与目的基因共分离的分子标记，通过这样的分
78、子标记筛选文库可直接获得含有目标基因的克隆，完全避开染色体步行的过程。染色体跳步-连接是使用一个识别位点很少的酶和一个识别位点很多的酶构建跳步文库和连接文库。跳步文库的插入片段是大片段克隆末端经过双每切的部分，由同样的文进行克隆。连接文库的插入片段是由切点较少的酶产生的，具有切点较少的那个酶的识别位点。在染色体步行的过程中，交替应用两个文库进行跳步和连接，最终逼近目标基因。4.4 目标基因的鉴定目标基因的鉴定我们得到的目的基因所在的小片段克隆有可能含有多个ORF(openreadingframe)，从这些ORF中鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节，常用的方法是用含有目标基因的大片段克
79、隆，如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：精细定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的RNA干找(RNAi)也可有效地确定目标基因。5.作物数量性状基因图位克隆技术的发展近年来植物基因组研究进展非常迅速，尤其拟南芥、水稻等模式植物高密度
80、遗传图谱和物理图谱的构建、全基因组序列的公布、数以万计EST、全长cDNA等序列及功能分析数据的释放以及新型植物分子标记及其高效检测技术的发展等，为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。Jander等对拟南芥基因的图位克隆效率进行了分析，对比结果，1995年克隆1个基因大约需要35人年，而2002年后则不到1人年(拟南芥年繁殖56代)。同时这些新的进展也能够使QTL的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化，因此同样可促使QTL的图位克隆向更加简便、快速的方向发展。传统图位克隆中的关键限制步骤是QTL的精细定位和通过染色体步移获得目的QTL区域的物理图谱，这一过程相当费时、费力。现在公共数据库中
81、大量的序列资料为这一工作的顺利完成提供了便利。比如，当水稻某一QTL初步定位在2个标记之间后，就可以从国际水稻基因组测序计划(IRGSP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分PAC/BAC克隆序列，利用软件SSRIT搜索克隆序列中的微卫星序列，然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR引物的设计；也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较，如寻找RGP数据库(粳稻)与中国华大数据库(籼稻)的序列差异，设计单核苷酸多态性(SNP)标记和缺失/插入多态(Del/In)标记等，利用这些标记对大群体进行分析，可以迅速地将目标QTL范围缩小到一个很小的基因组区域。在完成精细定位后，可以根据已有的与目标QTL紧
82、密连锁的分子标记在已公布RGP物理图谱上的位置，通过序列的拼接，实现目标QTL区域遗传图谱和物理图谱的电子整合，很快得到该区域的基因组序列，从而可以减少文库构建、筛选等繁重的工作，加速QTL的克隆进程。近来还有些学者提出一种更加简单的“高尔夫球逼近法”(Genegolfing)进行基因克隆，其做法是从与目标性状松散连锁的分子标记出发，把标记与基因间的遗传距离换算成物理距离，“一杆”即能到达可能包括目标基因的重叠群，再从该连锁群中分离单拷贝序列作为探针或设计引物，对目标基因重新定位，如果发现目标基因不在该重叠群上，则可继续“第二杆”，反复如此，直至分离到含有目标基因的克隆为止。不过这种方法能否用
83、于QTL克隆，还需实践验证。6.作物QTL图位克隆的作图群体在作图群体方面，近等基因系、染色体片段替换系或导入系是植物QTL克隆的关键基础材料。目前，水稻、番茄和油菜等作物已建立了多个染色体代换系群体，但大多数代换系群体的供体较少，且每个代换系含有多个片段，有些覆盖率也不高，因此QTL鉴定效率不高。由于单片段代换系是用分子标记辅助选择技术建立的近等基因系，在每个单片段代换系的基因组内都只有来自供体亲本的一个纯合染色体片段，而基因组的其余部分与受体亲本相同，所有在单片段代换系与其受体亲本之间的差异以及在单片段代换系之间所有可遗传的变异都只与代换片段相联系。单片段代换系在QTL的鉴定与定位、克隆及
84、功能研究方面具有重要的利用价值。第一，利用覆盖全基因组的单片段代换系群体可以实现对目标性状进行全基因组的QTL鉴定，全面了解重要农艺性状的遗传基础，席章营用326个单片段代换系在两季共检出24个农艺性状的701个QTL，平均每个性状检出了29.21个QTL；第二，由于消除了遗传背景的干扰，QTL的效应被相对“放大”，如在常规分离群体中，fw2.2对番茄果重变异的贡献为530，而在NILs发展的F2群体中其作用达到47，这样就从遗传和统计两个方面保证了QTL定位的准确性和稳定性；第三，在鉴定出QTL后可以立即通过相关的单片段代换系与受体杂交发展大样本的分离群体进行QTL精细定位，也可以通过进一步
85、的回交和分子标记辅助选择选育次级单片段代换系，并通过重叠作图的方法进一步缩小QTL区域；第四，在候选基因确定后，还可设计引物扩增候选基因区域，测序后通过对不同供体来源的单片段代换系在同一基因组区域的序列和表型差异进行比较，寻找变异位点，并对候选基因功能进行验证，拟南芥中一些基因的功能就是通过这种方法研究的。此外，单片段代换系之间的相互杂交还可以研究QTL之间的遗传互作；单片段代换系与其他品种杂交可以研究QTL与不同遗传背景的互作。7.作物QTL图位克隆方法的不足目前所有作物QTL的克隆基本上都是按照以上的方法和步骤进行的，整个过程涉及遗传图谱、物理图谱的构建；基因组文库或cDNA文库的建立与筛
86、选；近等基因系等群体的选育以及DNA测序、基因表达分析和互补测验等。这些环节的工作是比较复杂的，所花费的人力、物力和时间也是很多。Tanksley实验室从20世纪80年代末开始研究番茄果实重量的数量遗传规律，1996年把fw2.2定位到第2染色体的约150kb的区域，在2000年完成了克隆工作，前后花了10多年的时间；以色列的Zamir研究小组在1995年把1个控制番茄糖度的QTLBrix9-2-5定位在第9染色体上大约9cM区域，2000年最终将其鉴定为Lin5基因(细胞质外蔗糖转化酶)，也经历了6年的时间。由于传统QTL图位克隆工作的难度，目前这方面虽然取得了突破，但无论是涉及到的作物种类
87、、性状类型还是QTL的数量都是很有限的，尤其一些效应较小的QTL还没有被克隆出来。采用图位克隆法克隆Hd1。第一步，Hd1的精细定位与覆盖目标区域重叠群的构建：首先从籼稻品种Nipponbare和粳稻品种Kassalath构建的BC3F2(Nipponbare作轮回亲本)群体中选择携带杂合Hd1区域，其遗传背景主要为Nipponbare的植株进行自交，发展一个由9000个个体组成的分离群体(BC3F3)；根据表型选择1505个早熟极端个体(在Hd1区域带有纯合的Kassalath等位基因)组成301个基因池，检测到Hd1与2个侧翼标记R1679和P130间的重组株分别为9个和2个，进一步对这1
88、1个重组株用2个RFLP标记(C235和S2539)和一个CAPS标记(S20481)进行分析，将Hd1定位在S20481和P130之间；用Hd1两侧标记筛选YAC库(RGP用于构建物理图谱的基因组文库)，发现2个克隆Y4836和Y3955包含3个侧翼标记(C235、S20481和S2539)，对Y4836克隆进行末端克隆，RFLP分析表明，其右末端Y4836R与P130共分离；继续用S20481、S2539和Y4836R筛选Nipponbare基因组PAC文库，获得2个PAC克隆，其中P0038C5包括了S20481、S2539和Y4836R三个标记序列，因此覆盖了Hd1区域；进一步对P00
89、38C5测序，根据S20481和Y4836R的位置，确定一个26kb的范围为Hd1的候选基因区域；利用候选基因区域序列资料设计了9个CAPS标记，并对这些标记间及与Hd1之间的重组情况进行分析，最终将Hd1限定在一个12kb的区域。第二步，Hd1候选基因的序列分析和功能预测：用Genscan软件分析候选基因区域的基因组序列，预测该区域有2个可能的候选基因。BLAST搜索非富余DNA(NonredundantDNA)数据库显示，其中第一个与拟南芥的CONSTANS(CO)基因有很高相似性，而第二个就是S2539，一种过氧化物酶的序列，考虑到CO与拟南芥的光周期反应有关，因此初步选择第一个基因为候
90、选基因进行下一步序列分析；与Nipponbare相比，Kassalath在候选基因序列的第一个外显子中存在4个单碱基替换、1个双碱基替换、1个36bp碱基插入和1个33bp碱基缺失，而在第二个外显子中有2个单碱基替换和1个双碱基缺失；对se1(水稻控制光周期反应的1个主基因)突变体HS66和HS110及其原始野生型品种Ginbouzu在Hd1第一候选基因区域的序列进行比较，也发现突变体HS66第一外显子中有1个43个碱基的缺失，突变体HS110内含子中有1个433bp的碱基插入，这些结果表明Hd1与Se1是等位的。对水稻的Hd1和拟南芥的CO进行序列比对，发现在锌指域有59的一致性，而C端区一
91、致性达79；从序列分析可知，水稻Hd1由2个外显子组成，编码一个395个氨基酸组成的蛋白质，是拟南芥CO基因家族的成员之一。Kassalath等位基因由于第二个外显子中的缺失形成提早终止密码子，结果形成没有C端的蛋白产物，导致功能的缺失。第三步，Hd1候选基因的功能验证：关键的实验是转基因功能互补测定。将来自Nipponbare的一个包括Hd1候选基因的7.1kbDNA片段转移到一个Nipponbare的近等基因系中，该受体在Hd1、Hd2座位含有纯合的Kassalath等位基因，表现对光周期钝感，结果带有7.1kbDNA片段的转化植株在短日照条件下较携带载体序列的转化植株和受体提早抽穗，对转
92、化植株后代表型分析也证明了包括Hd1候选基因的7.1kbDNA片段具有光周期反应敏感的功能。RT-PCR分析显示，Hd1的表达受光周期转换的影响并不大，这说明该基因的作用可能是通过影响那些受光周期直接调控的基因的表达来实现的。自Peterson等首次对QTL进行全基因组扫描以来，已有许多学者用不同的作图群体，采用不同的统计分析方法定位了许多作物QTL，但其中只有很少几种作物的几个效应较大的QTL被克隆。原因主要有二，一是数量性状基因表达非常复杂，用现有作图方法(包括遗传模型、作图群体等)对QTL的定位能力有限，难以获得QTL的正确位置；二是传统的克隆方法过于复杂和困难。近年来在植物基因组学研究
93、领域所取得的成果无疑将大大促进QTL的克隆研究。QTL的鉴定和分离已成为21世纪遗传学研究的主要方向之一，同时也是后基因组学的重要任务，相信随着相关研究的不断深入，在不久的将来，主要农作物会有更多新的QTL被克隆。图位克隆技术的局限利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，而且还要进行大量的测序工作，所以对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大，而且效率低。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、蕃茄等图谱饱和生物上。此外，在分析发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状由不止一个的基因位点控
94、制的。例如，在拟南芥Kashunir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的。对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性。例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。因此，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，如第二位点修饰成分干扰这些分析而使图位克隆此类基因变的非常困难；关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响(Copenhaveretal.,1998)，但如果要定位的基因位于重组被严格限制的着丝
95、粒附近，精细定位的努力就有可能无效，且对常染色体序列1%重组的遗传距离相当于100400Kb的物理距离，然而着丝粒区域1%重组的遗传距离相当于10002500Kb，在现存的物理图谱中很少有着丝粒区域被覆盖等这一切都使图位克隆的染色体步移变的不可能（Janderetal.,2002）。展望进入21世纪，生命科学取得了前所未有的发展，一系列模式生物的全基因组序列被测出，与生物研究相关理论方法日新月异。图位克隆是较为通用的基因获得技术，其在理论上适用于一切基因。基因组研究产生了很多便但功能强大的工具，同时也有大量的信息被收集在免费的数据库中（高精度遗传图谱、大尺度物理图谱、大片段基因组文库甚至基因组
96、全序列），这为图位克隆的广泛应用提供了前提条件。现在，图位克隆已经成为分离基因的常规方法。有越来越多的生物利用图位克隆技术克隆到了基因，拟南芥、水稻、蕃茄等都已应用此法成功地克隆到了基因。图位基因克隆不仅适合于单基因克隆，对于那些由多基因控制的数量性状（quantitativetraitlocis,QTLs）的定位也同样适用，农作物中许多重要的农艺性状都是数量性状，受多个基因的控制（如花时、籽粒大小、生理节律、次生代谢等）。目前，利用图位克隆分离此类基因主要是通过不断的回交，构建QTL近等基因系以减少分离群体的遗传背景来实现对单个QTL遗传效应的分析，并对QTL进行精细定位。随着越来越多的QTL被定位到分子标记连锁图上，利用图位克隆技术克隆单个贡献率较大的基因用来改良作物已成为可能。
