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1、专题1基因工程 1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步（二）利用PCR技术扩增目的基因1. 1. 原理原理原理原理 PCR是聚合酶链式反应（是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以
2、又叫做体外外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。扩增技术。2. 2. 过程过程过程过程高温变性高温变性（9095）低温退火低温退火（5560）中温延伸中温延伸（7075） 双链双链DNADNA是在高温条件是在高温条件下解链为单链下解链为单链DNADNA的，因此的，因此整个过程不需要解旋酶。整个过程不需要解旋酶。多次多次重复重复3. 3.特点：指数形式扩增特点：指数形式扩增特点：指数形式扩增特点：指数形式扩增（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪合成仪蛋白质的氨蛋白质的氨蛋白质的氨蛋白质的氨基酸顺序基酸顺序基酸顺序基酸顺序mRANmRAN核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列基因基
3、因基因基因DNADNA的的的的核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列目的目的目的目的基因基因基因基因推推测测推推测测合合成成当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。酸序列已知时，可采用此种方法。酸序列已知时，可采用此种方法。酸序列已知时，可采用此种方法。二、基因表达载体的构建用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的因插入切口处，让目的
4、基因的黏性末端与切口上的黏黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组重组DNADNA分子，即基因表达载体。分子，即基因表达载体。基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序陕陕西西师师大大附附中中质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA（一）构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（二）构建零件及其作用1. 1. 目的基因目的基因2. 2. 启动子启动子 RNA RNA聚合酶
5、识别和聚合酶识别和结合的一段特殊结构的结合的一段特殊结构的DNADNA片段，片段，位于基因的首端，位于基因的首端，RNARNA聚合酶与聚合酶与之结合才能驱动基因转录出之结合才能驱动基因转录出mRNAmRNA，进而获得需要的蛋白质。，进而获得需要的蛋白质。3. 3. 终止子终止子 一段特殊结构一段特殊结构的的DNADNA片段，位于基因的尾片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要端，作用是使转录在所需要的地方停止。的地方停止。4. 4. 标记基因标记基因 鉴别受体细鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛而将含有目的基因的细胞筛选出来。选出来。三、将目的
6、基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。表达的过程称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法主要主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。途径，且因受体细胞的不同而不同。1.1.农杆菌转化法农杆菌转化法（一）导入植物细胞2.2.其他方法（见教材其他方法（见教材P P1212“生物技术资料卡生物技术资料卡”）（1）
7、基因枪法）基因枪法（2）花粉管通道法）花粉管通道法（二）导入动物细胞显微注射技术显微注射技术含目的基因含目的基因的表达载体的表达载体动动物物的的受受精精卵卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵早早期期胚胚胎胎雌性动物输雌性动物输卵管或子宫卵管或子宫转基因转基因动动物物显微显微注射注射分裂分裂分化分化移移植植发发育育问题问题为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？受精卵？（三）导入微生物细胞2. 2. 优点优点 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。简单、价格低廉。3. 3. 常
8、用受体细胞常用受体细胞 大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）1. 1. 过程过程（1 1）制备感受态细胞：用）制备感受态细胞：用CaCa2+2+（CaClCaCl2 2）处理细菌，使）处理细菌，使细菌易于接受外源细菌易于接受外源DNADNA分子。分子。（2 2）重组）重组DNADNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。CaCa2+ 2+ 处理法处理法四、目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的目的基因是否真正插入受体细胞的DNADNA中，中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴
9、定才能得知。只有通过检测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。进行。（一）分子水平1. 1. 检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 提取受体生提取受体生物全部物全部DNA适当限制适当限制酶切割酶切割DNA片段片段用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显出出杂交带杂交带（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）分子杂交技术分子杂交技术2. 2. 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA mRNA 提取受体生提取受体生物的物的mRNA用
10、同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显出出杂交带杂交带（表明目的基因已转录出了（表明目的基因已转录出了mRNA）检测检测DNA利用的是利用的是DNA与与DNA杂交，检测杂交，检测mRNA利用的是利用的是DNA与与mRNA杂交。杂交。3. 3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术提取受体生提取受体生物的蛋白质物的蛋白质与相应抗体杂交与相应抗体杂交显显出出杂交带杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（表明目的基因已形成蛋白质产品）（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃
11、后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？生物体内提取不行吗？提示：提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方方式从含有该基因的生物的式从含有该基因的生物的DNA中，直接获
12、得，也可以通过反转中，直接获得，也可以通过反转录，用录，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序
13、列，往往就需要构建基因文库。一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。寻根问底：寻根问底： 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？这么做，结果会怎样？提示：提示：有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，
14、严格来无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。讲不算基因工程。寻根问底：寻根问底：1.1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网
15、和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：寻根问底：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环
16、素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。2.-2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫成分异
17、常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？寻根问底：寻根问底：思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述
18、元件的主要理由是：上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；增加一些其他调控元件，如增强子
19、等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因）的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。，如绿色荧光蛋白基因等。3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个若将一个抗病基因导入小麦中抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有
20、的农杆菌菌株都要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。寻根问底：寻根问底：1、为为了了培培育育节节水水高高产产品品种种，科科学学家家将将大大麦麦中中与与抗抗旱旱节节水水有有关关的的基基因因导导入入小小麦麦，得得到到转转基基因因小小麦麦，
21、其其水水分分利利用用率提高了率提高了20%。这项技术的遗传学原理是（）。这项技术的遗传学原理是（）A基因重组基因重组 B基因突变基因突变 C基因复制基因复制 D基因分离基因分离巩固练习巩固练习A2、利利用用苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌的的抗抗虫虫基基因因培培育育的的抗抗虫虫棉棉是是否成功，最好检测（）否成功，最好检测（）A是否有抗生素产生是否有抗生素产生 B是否有目的基因表达是否有目的基因表达C是否有抗虫的性状出现是否有抗虫的性状出现 D是否能分离到目的基因是否能分离到目的基因 巩固练习巩固练习C3、水水母母发发光光蛋蛋白白由由236个个氨氨基基酸酸构构成成，其其中中天天冬冬氨氨酸酸、甘甘氨氨
22、酸酸和和丝丝氨氨酸酸构构成成发发光光环环，现现已已将将这这种种蛋蛋白白质质的的基基因因作作为为生生物物转转基基因因的的标标记记，在在转转基基因因技技术术中中，这这种种蛋蛋白质的作用是（）白质的作用是（）A促使目的基因导入受体细胞促使目的基因导入受体细胞 B促使目的基因在受体细胞内复制促使目的基因在受体细胞内复制C使目的基因容易被检测出来使目的基因容易被检测出来 D使目的基因容易成功表达使目的基因容易成功表达巩固练习巩固练习C4 4、根根据据mRNAmRNA的的信信息息推推出出获获取取目目的的基基因因的的方方法法是是（）（）A A、用、用DNADNA探针测出目的基因探针测出目的基因B B、用、用
23、mRNAmRNA探针测出目的基因探针测出目的基因C C、用、用mRNAmRNA反转录形成目的基因反转录形成目的基因D D、用、用PCRPCR技术扩增技术扩增mRNAmRNA巩固练习巩固练习C5 5、PCRPCR技术扩增技术扩增DNA,DNA,需要的条件是需要的条件是( ( ) )目目的的基基因因引引物物四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸DNADNA聚聚合合酶等酶等mRNAmRNA核糖体核糖体A A、B B、C C、 D D、 巩固练习巩固练习A6 6、获获取取目目的的基基因因的的方方法法有有多多种种，下下列列不不属属于于目目的的基基因获取方法的是（）因获取方法的是（）A A、从基因组文库中获取、从基
24、因组文库中获取B B、从、从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中获取、从含目的基因生物细胞中获取D D、利用、利用PCRPCR技术获取技术获取巩固练习巩固练习D7 7、下下列列高高科科技技成成果果中中，根根据据基基因因重重组组原原理理进进行行的是的是（ ） A A、我我国国科科学学家家袁袁隆隆平平利利用用杂杂交交技技术术培培育育出出超超级级水稻。水稻。 B B、我我国国科科学学家家将将苏苏云云金金杆杆菌菌的的某某些些基基因因转转移移到棉花体内，培育出抗虫棉。到棉花体内，培育出抗虫棉。 C C、我我国国科科学学家家通通过过返返回回式式卫卫星星搭搭载载种种子子培培育
25、育出太空椒。出太空椒。 D D、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛。隆牛。 巩固练习巩固练习AB8、有关基因工程的叙述正确的是（、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制性内切酶只在获得目的基因时才使用、限制性内切酶只在获得目的基因时才使用B、DNA连接酶可以切断磷酸二酯键连接酶可以切断磷酸二酯键C、质粒都可以做载体、质粒都可以做载体D、基因工程都能定向改变生物的性状、基因工程都能定向改变生物的性状巩固练习巩固练习D9、科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来、科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的亨鸡胚胎细胞的DNA中中,发育
26、后的雌鸡就能产出含该药发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋物蛋白的鸡蛋,在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋白物蛋白;而且这些鸡蛋孵出的鸡而且这些鸡蛋孵出的鸡,仍能产出含该药物蛋仍能产出含该药物蛋白的鸡蛋白的鸡蛋.据此分析据此分析()A.这些鸡是转基因工程的产物这些鸡是转基因工程的产物B.这种变异属于可遗传的变异这种变异属于可遗传的变异C.该过程运用了胚胎移植技术该过程运用了胚胎移植技术D.该种变异属于定向变异该种变异属于定向变异巩固练习巩固练习ABD1010、下下图图是是利利用用基基因因工工程程办办法法生生产产人人白白细细胞胞干干扰扰素素的的基基本本过程图，据图回答：过程图，据图回答：（1 1）过过程程需需要要_酶酶的的参参与与。（2 2）物物质质是是从从大大肠肠杆杆菌菌分分离离出出的的_。其其化化学学本本质质 是是 _， 它它 必必 须须 能能 在在 宿宿 主主 细细 胞胞 中中_。(3)(3)过程表明目的基因过程表明目的基因_。限制性内切酶限制性内切酶质粒质粒DNA复制并稳定地保存复制并稳定地保存在大肠杆菌内表达在大肠杆菌内表达结束放映结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！44
