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1、国家自然科学基金国家自然科学基金课题课题设计和申请书撰写设计和申请书撰写第四军医大学基础部遗传与发育教研室第四军医大学基础部遗传与发育教研室第四军医大学基础部遗传与发育教研室第四军医大学基础部遗传与发育教研室韩韩韩韩 骅骅骅骅虎阑跃北坤臃志奄闲杯欺沫豌馅犹孝暑腔花什腋翟痹粕闻忍喘边没懦派基国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写p面上项目面上项目是国家自然科学基金研究项目体系中的主要部分，是国家自然科学基金研究项目体系中的主要部分，其定位是全面均衡布局，瞄准科学前沿，促进学科发展，激励其定位是全面均衡布局，瞄准科学前沿，促进学科发展，激励原始原始创新创新；支持从
2、事基础研究的科学技术人员在国家自然科学；支持从事基础研究的科学技术人员在国家自然科学基金资助范围内自由选题，开展基金资助范围内自由选题，开展创新创新性的科学研究，力图通过性的科学研究，力图通过研究得到研究得到新新的发现或取得重要进展。鼓励开展具有前瞻性、勇的发现或取得重要进展。鼓励开展具有前瞻性、勇于于创新创新的探索性研究工作；注重保护非共识项目，支持探索性的探索性研究工作；注重保护非共识项目，支持探索性较强、风险性较大的较强、风险性较大的创新创新研究。研究。创新贯穿于整个科学研究活动创新贯穿于整个科学研究活动跪飘陶笺茵航命吵盗倚崖杂硒稀盘缮植急稚檀橱群益芬妨膊请大证娟谓杜国家自然科学基金课题
3、设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写医学研究的创新医学研究的创新基础理论研究基础理论研究以问题为导向：实现理论创新以问题为导向：实现理论创新临床技术研究临床技术研究以需求为导向：实现技术创新、集成创新以需求为导向：实现技术创新、集成创新凤炯渗搞奢厉蛙胜喂胁克寻呈给铲陵偷玻矿夜得迄静悼纠毙谬版妆复碳赦国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写基础理论研究基础理论研究一项肿瘤信号途径（分子）的研究一项肿瘤信号途径（分子）的研究人类健康：人类生存、经济发展、社会稳定人类健康：人类生存、经济发展、社会稳定肿瘤：对生命的威胁肿瘤：对生命的威胁肿瘤细胞肿瘤细胞
4、/ /肿瘤微环境细胞肿瘤微环境细胞细胞的产生、增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭细胞的产生、增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭信号途径：某个信号途径的意义和信号途径：某个信号途径的意义和CrosstalkCrosstalk个别分子：某个分子的意义和分子间相互作用个别分子：某个分子的意义和分子间相互作用篙堆戚审恐玻增霄剪奇憎昏咐背蔬棚婉体佰五睡傣拯雪拷灶王霞饺嫉人镐国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写例如：降低例如：降低Survivin对肿瘤进行基因治疗对肿瘤进行基因治疗原理原理Survivin降低能否抑制肿瘤？为什么（肿瘤细胞过表达降低能否抑制肿瘤？为什么（肿瘤细胞过表
5、达Survivin吗）吗）？机制是什么？机制是什么？方案可行性方案可行性输送系统？表达方法？靶向措施？实验研究模型？疗效观察指标？输送系统？表达方法？靶向措施？实验研究模型？疗效观察指标？实施后果实施后果体外模型中的效果？实验动物模型中的效果？临床观察中的效果？体外模型中的效果？实验动物模型中的效果？临床观察中的效果？临床技术研究临床技术研究工程问题转化为理论问题：研究发明的原理、方案可行性、工程问题转化为理论问题：研究发明的原理、方案可行性、实施后果实施后果岸讥阀俞达茶信迅涅厦武愁采控荚炊制鱼孰钥赖条遥名铅锑曙志滴昼私咀国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写
6、申请书内容的构思申请书内容的构思找到一个问题：立论依据找到一个问题：立论依据工作中遇到的问题工作中遇到的问题?社会公众关心的热点社会公众关心的热点?读书思考的结果读书思考的结果? 规划出一个解决问题的逻辑方案：研究内容规划出一个解决问题的逻辑方案：研究内容 现象的确认：形态变化、基因表达的观察，临床病例对照研究现象的确认：形态变化、基因表达的观察，临床病例对照研究机制的解析：细胞、信号途径、分子机制的解析：细胞、信号途径、分子假说的验证：转染、假说的验证：转染、KO、临床应用、临床应用建立了可靠的研究信誉和资质：研究基础和条件建立了可靠的研究信誉和资质：研究基础和条件个人背景：前期研究业绩个人
7、背景：前期研究业绩研究团队研究团队皖衅默沏蓖衷按芝杖肮猩乾磷遣携色循叮俯绿芒杀仪槛镍泻猾渭贯主排芋国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写拟定题目（反映核心科学问题）拟定题目（反映核心科学问题）制定写作提纲制定写作提纲确定研究目标内容确定研究目标内容（如何解决核心科学问题？）（如何解决核心科学问题？）设计立论依据设计立论依据（为什么是核心科学问题？）（为什么是核心科学问题？）建立基础和团队建立基础和团队（凭什么解决核心科学问题？）（凭什么解决核心科学问题？）疡舔冰旭钟享掀攻恨缩久墟框嫌涤元甸剑躺又殆肩靳鸟瘤属听磐丙冒痘蜕国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自
8、然科学基金课题设计和申请书撰写怎么撰写？怎么撰写？面上项目报告正文撰写提纲面上项目报告正文撰写提纲（一）立项依据与研究内容：（一）立项依据与研究内容： 1 1、项目的立项依据、项目的立项依据2 2、项目的研究内容、研究目标、项目的研究内容、研究目标, ,以及拟解决的关键科学问题以及拟解决的关键科学问题3 3、拟采取的研究方案及可行性分析、拟采取的研究方案及可行性分析4 4、本项目的特色与创新之处。、本项目的特色与创新之处。5 5、年度研究计划及预期研究结果、年度研究计划及预期研究结果（二）研究基础与工作条件（二）研究基础与工作条件1 1、工作基础、工作基础2 2、工作条件、工作条件3 3、申请
9、人简介、申请人简介4 4、承担科研项目情况、承担科研项目情况5 5、完成自然科学基金项目情况、完成自然科学基金项目情况（三）经费申请说明（三）经费申请说明（四）其他附件清单（四）其他附件清单要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出揉刷捕斤潍锨拨朗诀炊婴慨跪租斟李阁缔合写祈蒂番傈匹戏沸抛挥尾官婴国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写摘摘 要要整个申请书的提纲：整个申请书的提纲： 400 400字，字，4 4层意思，句句层意思，句句切题，不能出错！切题，不能出错！ 科学问题：科学问题：xxxxxx是是xxxxxx，但是存在，但是
10、存在xxxxxx问题。问题。 基本思路：文献和我们以往的研究工作表明，基本思路：文献和我们以往的研究工作表明，xxxx可能是可能是xx.xx. 基本研究内容：本课题拟基本研究内容：本课题拟xxx, xxx, xxxxxx, xxx, xxx。 主要研究意义：这些研究具有主要研究意义：这些研究具有xxxx理论意义和理论意义和xxxxxx实际意义。实际意义。帖繁早扼呆失噪宅痢孵寨输秸惧疼贮冤臃崭岔峪椿淹氏寝投俐丛纪崖渴缎国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写NotchNotch信号途径通过信号途径通过miRNAmiRNA调控神经调控神经干干/ /祖细胞的增殖和分化
11、祖细胞的增殖和分化在哺乳类神经发育中，神经干细胞（在哺乳类神经发育中，神经干细胞（NSCNSC）以特定的时空顺序进）以特定的时空顺序进行增殖、分化和迁移，最终形成具有高级结构和功能的神经系统。行增殖、分化和迁移，最终形成具有高级结构和功能的神经系统。大量文献和我们最近发表的研究证明，经典大量文献和我们最近发表的研究证明，经典NotchNotch途径对途径对NSCNSC的增的增殖和分化发挥关键调控作用，但其下游分子和调控机制尚不完全殖和分化发挥关键调控作用，但其下游分子和调控机制尚不完全清楚。清楚。我们最近在我们最近在NotchNotch途径关键转录因子途径关键转录因子RBP-JRBP-J条件性
12、基因剔除条件性基因剔除小鼠用神经球培养对比了正常和小鼠用神经球培养对比了正常和NotchNotch信号阻断的信号阻断的NSCNSC的的miRNAmiRNA表表达谱，鉴定出一组在正常和达谱，鉴定出一组在正常和NotchNotch缺陷缺陷NSCNSC中差异表达的中差异表达的miRNAmiRNA，并对其中个别分子在并对其中个别分子在NotchNotch信号调控信号调控NSCNSC中的作用进行了初步探讨。中的作用进行了初步探讨。本课题拟在此基础上，深入研究本课题拟在此基础上，深入研究NotchNotch信号调控这组候选信号调控这组候选miRNAmiRNA的的分子机制；揭示候选分子机制；揭示候选miRN
13、AmiRNA在在NSCNSC增殖分化中的作用和机制；阐明增殖分化中的作用和机制；阐明候选候选miRNAmiRNA在在NotchNotch信号途径中的功能意义。信号途径中的功能意义。这些研究可以拓展对这些研究可以拓展对NotchNotch信号调控机制的认识，还可以发现神经发育中信号调控机制的认识，还可以发现神经发育中NSCNSC增殖分化增殖分化调控的新机制，具有重要的理论意义。调控的新机制，具有重要的理论意义。 葬淀糟烦置啊泵因域掸渔气卓仗棱辽污警捡囚略互撰涅塞滦缉炔档颜捂细国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（
14、4000-8000字）字）立项依据立项依据1、研究意义、研究意义2、国内外研究现状及发展动态分析、国内外研究现状及发展动态分析3、主要参考文献目录、主要参考文献目录兆骨般牛环壤孪烛瑶姨棍脆装矮挨翠危磁营蒸朗龚眉誊糊完泳雹抡里松胺国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写常见问题：常见问题：1、写成了国内外研究现状、写成了国内外研究现状2、提炼不出来自己的研究有什么意义、提炼不出来自己的研究有什么意义3、完全没有阐述本课题的基本研究内容，所以无从阐述本研究的意义、完全没有阐述本课题的基本研究内容，所以无从阐述本研究的意义1、研究意义：、研究意义：结合科学研究发展趋势
15、来论述科学意义结合科学研究发展趋势来论述科学意义结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述应用前景结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述应用前景放大、修改版的摘要：放大、修改版的摘要：（1）从更广泛的层面上对研究意义进行阐述，如某种疾病对公众健康的影响，）从更广泛的层面上对研究意义进行阐述，如某种疾病对公众健康的影响，某一个现象或问题对学科发展的意义，等等某一个现象或问题对学科发展的意义，等等（2）通过分析现在存在的问题、自己的前期结果，引伸到自己的研究内容）通过分析现在存在的问题、自己的前期结果，引伸到自己的研究内容（3）针对这些问题，本课题开展的研究内容）针
16、对这些问题，本课题开展的研究内容（4）本课题的研究有什么科学意义、应用前景）本课题的研究有什么科学意义、应用前景呆剖空揍颤标摔枫屡窑祭阉转钥霜俘例重突衡住迢环缴俱拷驱贞搏粱蛇丙国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写 脊椎动物神经系统的高度有组织的结构是其正常行使功能的基础，而正常有序的发育则是其复杂结构形成的基础。哺乳类的中枢神经系统（CNS）是从定位于神经管管壁靠近管腔侧（发育中的室管膜带）的神经干细胞（NSC，neural stem cells）增殖、分化而来。NSC可以通过对称分裂来增殖，还可通过不对称分裂在自我更新的同时产生中间神经祖细胞（INP，in
17、termediate neural progenitors）。神经祖细胞则在细胞内、外信号的共同作用下在不断通过对称分裂而增殖的同时沿着特定的路线进行迁移，并不断分化产生各种类型的子代神经细胞，再组装成不同的神经结构而发挥其功能。正确理解NSC维持自身增殖、NSC向下游细胞的分化、以及进一步迁移、分化成成熟神经细胞和形成神经连接的分子机制，不仅对于了解神经系统的结构形成十分重要，也对认识包括人类的高级神经活动在内的神经系统的功能以及相关人类疾病的发病机制具有重要的意义。 Notch信号途径是神经发育调节的关键信号途径之一。最近，我们用小鼠Nestin基因增强子建立了在NSC中特异表达重组酶Cr
18、e的转基因小鼠（Zhang Q et al. Neurosci Lett. 2005; 379:90-95），并与本研究室以往建立的RBP-J-Floxed小鼠交配得到了在NSC特异剔除RBP-J的条件性基因剔除小鼠。表型分析发现从从RBP-J条件性基因剔除小鼠胚胎分离培养的神经球（条件性基因剔除小鼠胚胎分离培养的神经球（Neurosphere）具有明显）具有明显降低的自我更新能力和增强的分化潜能，并且向神经元的方向分化增加（降低的自我更新能力和增强的分化潜能，并且向神经元的方向分化增加（Gao F et al. Mol Cell Neurosci. 2009; 40:442-450）；体外神
19、经元培养还发现）；体外神经元培养还发现RBP-J缺陷神经元的神经突起生长减少缺陷神经元的神经突起生长减少（Gao F et al. Unpublished）。）。然而，这些工作和国际上本领域的相关研究都还未能阐明Notch信号途径是通过哪些下游分子、如何调控神经干细胞的增殖和分化的。 近几年发现的microRNA（miRNA）在脊椎动物神经系统中表达丰富并具有一定时空特性。多项研究已经提示miRNA参与了NSC的分化。Notch信号途径作为神经系统发育调控的关键信号途径之信号途径作为神经系统发育调控的关键信号途径之一，是否可通过调控某些一，是否可通过调控某些miRNA影响影响NSC及其下游细胞
20、的增殖分化？及其下游细胞的增殖分化？针对这一问题，本课题组利用神经球悬浮培养法从RBP-J剔除小鼠和对照小鼠分别培养了NSC，利用miRNA表达芯片对比分析，结合生物信息学分析和文献回顾，获得了一组（7个）在RBP-J剔除神经球和对照神经球之间有明显差异表达并可能具有潜在功能的miRNA（见工作基础见工作基础）。本项目拟在此基础上检测这些候选miRNA在小鼠CNS发育过程中的表达，在培养的细胞中和小鼠体内分析候选miRNA对NSC自我更新、增殖和分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤其与Notch信号的关系。这些研究：可以可以明确参与调控明确参与调控NSC自我更新和分化的新的自我更新
21、和分化的新的miRNA，并初步阐明其作用的机制；，并初步阐明其作用的机制；就我们掌握的文献，就我们掌握的文献，到目前为止还没有报道在哺乳类到目前为止还没有报道在哺乳类Notch信号可以通过信号可以通过miRNA调控发育过程，所以本课题有望揭示调控发育过程，所以本课题有望揭示Notch信号调控中枢神经系统发育的新机制，信号调控中枢神经系统发育的新机制，具有重要意义。桅锯操装弹苯萨风衔贮条渴膊炮腰怖昼档盂鹃痛渡周冬蔗寞抬跪束审猜蒋国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写2、国内外研究现状及发展动态分析：、国内外研究现状及发展动态分析：领域的基本知识介绍领域的基本知识
22、介绍(Biology)所研究的问题的研究现状，包含自己发表的论文所研究的问题的研究现状，包含自己发表的论文 (Molecule)以本课题的研究逻辑和研究意义结尾以本课题的研究逻辑和研究意义结尾(Biology) 围绕课题的思路进行综述，层次清晰，步步提示围绕课题的思路进行综述，层次清晰，步步提示存在问题存在问题，观点鲜明，把，观点鲜明，把自己的研究思路暗含在对文献的综述中，自己的研究思路暗含在对文献的综述中，最后用自己的研究提出最后用自己的研究提出解决办法解决办法常见问题：常见问题：1、综述不全面、没有很好地阅读、忽略了重要进展（尤其是国内专家）、综述不全面、没有很好地阅读、忽略了重要进展（尤
23、其是国内专家）2、逻辑思路不清晰，没有围绕一个中心问题进行综述、逻辑思路不清晰，没有围绕一个中心问题进行综述3、自说自话，只是以自己的前期研究为依据、自说自话，只是以自己的前期研究为依据4、过多引用未发表的、过多引用未发表的Data5、以未见报道为依据（在其他的肿瘤已有结论，现在换个肿瘤）、以未见报道为依据（在其他的肿瘤已有结论，现在换个肿瘤）粹津消盈床剐望萌叭睡悯弱暮批滋棠英礁唤近辛币墟碘炼臆吮食乘狙厉盾国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国内外研究现状国内外研究现状NSC增殖分化调控的一般知识增殖分化调控的一般知识1、Notch信号途径及其对信号途径及其
24、对NSC增殖分化的调控增殖分化的调控作用：作用：1.1Notch信号途径信号途径1.2Notch信号对神经分化的调控信号对神经分化的调控2、miRNA对对NSC/INP增殖分化的调控作用：增殖分化的调控作用：2.1miRNA在中枢神经系统的表达在中枢神经系统的表达 2.2miRNA对对NSC分化命运的选择具有十分重要的分化命运的选择具有十分重要的作用作用3、Notch途径和途径和miRNA的关系的关系4、Summary买射煞靛炽江药茶叼溺扫算浆讹枕启非产慈泊抄劈言烬控恐廊澳拂啃步匣国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写3、主要参考文献：、主要参考文献： (显示
25、科学态度显示科学态度!) 准确准确及时更新及时更新格式规范一致格式规范一致与正文对应与正文对应国内科学家、中文论文引用国内科学家、中文论文引用Yao-Chun Wang, Fei He, Xiao-Wei Liu, Guang-Ying Dong, Hong-Yan Qin, Xing-Bin Hu, Fan Feng, Min-Hua Zheng, Liang Liang, Lei Feng, Ying-Min Liang, Hua Han. Notch signaling determines the M1 versus M2 polarization of macrophages in
26、anti-tumor immune responses. Cancer Res. 2010; 70:4840-4849. (封面标题封面标题)端痔爆射暇氏配译铣侣笼妈泪铣闭惦竟心求展者溪涡烟沧舔焉寻撞擦剿识国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（此部分为重点阐述内容）（此部分为重点阐述内容） 研究目标：本课题的总体研究目的和达到的程度，要一目研究目标：本课题的总体研究目的和达到的程度，要一目了然。了然。 一句话讲出：通过一句话讲出：通过xxx，阐明阐明xxx，为，为xxx奠定基础。奠定基础
27、。常见问题：常见问题：研究目标太大研究目标太大/太小太小研究目标与研究内容混淆研究目标与研究内容混淆厄祷酉各钩黎访遵丫堤押主擂科匈晕爸挣菊普快容皑鬃腐模即旷缘曳踌齿国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究内容：围绕着上述研究目标，（研究内容：围绕着上述研究目标，（1）打算开展几个方面的实验研究？）打算开展几个方面的实验研究？（2）每个方面都进行哪些实验？）每个方面都进行哪些实验？例如对一个新基因的功能研究：例如对一个新基因的功能研究：1、表达：表达：在生物信息学预测的基础上，进行表达范围分析（在生物信息学预测的基础上，进行表达范围分析（Northern, R
28、T-PCR, 原位原位杂交）、细胞内定位分析（免疫荧光染色、融合蛋白表达）杂交）、细胞内定位分析（免疫荧光染色、融合蛋白表达）2、功能：功能：在体外对细胞功能的影响：转染、干扰；增殖、凋亡、分化、迁移、形态变在体外对细胞功能的影响：转染、干扰；增殖、凋亡、分化、迁移、形态变化？体内功能研究：化？体内功能研究：KO？转基因小鼠？病例相关的分析？转基因小鼠？病例相关的分析？3、作用机制：作用机制：转录调控？信号转导？上、下游分子？相互作用蛋白？转录调控？信号转导？上、下游分子？相互作用蛋白？4、表达调控：表达调控：启动子结构？表观遗传修饰？翻译后调控？启动子结构？表观遗传修饰？翻译后调控？常见问题
29、：常见问题：层次条理不清楚：针对一个问题需要做哪几个方面的研究？逻辑关系层次条理不清楚：针对一个问题需要做哪几个方面的研究？逻辑关系内容简繁不得当：（生物信息学、构建质粒；筛选、构建小鼠、转录调控）内容简繁不得当：（生物信息学、构建质粒；筛选、构建小鼠、转录调控）和研究方案混淆：罗列具体的实验步骤和研究方案混淆：罗列具体的实验步骤击污俩呕妥长示岳岁愤臭峨筏篆丝轮厅惊悸东鹊绘盗官家平壬破嘻疗辞侨国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写在前期工作已经获得在前期工作已经获得RBP-JRBP-J基因剔除基因剔除NSCNSC与正常与正常NSCNSC差异差异miRNAmiR
30、NA的基的基础上，检测这些候选础上，检测这些候选miRNAmiRNA在小鼠在小鼠CNSCNS发育过程中的表达特点，在培发育过程中的表达特点，在培养的细胞中和小鼠体内分析重要候选养的细胞中和小鼠体内分析重要候选miRNAmiRNA对对NSCNSC自我更新、增殖和自我更新、增殖和分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤其与分化的调控作用，继而进一步深入研究其调控机制，尤其与NotchNotch信号的关系，信号的关系，以期明确以期明确miRNAmiRNA参与介导参与介导NotchNotch信号调控信号调控NSCNSC自我更新自我更新增殖和分化的信号通路、作用机制和意义增殖和分化的信号通路、作
31、用机制和意义，为揭示哺乳类中枢神经，为揭示哺乳类中枢神经系统发育的调控机制提供新的实验依据。系统发育的调控机制提供新的实验依据。研究目标：研究目标：葱结朱熬权彬壬曙吓邪伟只利铰臻按神熔罢裳母擞酷暇毁蠕侨竖钮湖罗匡国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写1 1、候选、候选miRNAmiRNA在中枢神经系统发育过程中的表达。在中枢神经系统发育过程中的表达。利用利用miRNAmiRNA提取提取和反转录系统明确候选和反转录系统明确候选miRNAmiRNA在不同胎龄小鼠的相关脑区的时空表在不同胎龄小鼠的相关脑区的时空表达特征；利用达特征；利用LNALNA修饰的寡核苷酸探针
32、进行原位杂交修饰的寡核苷酸探针进行原位杂交（Kloosterman, W.P. et al. 2006, Nat. Methods. 3, 27-29Kloosterman, W.P. et al. 2006, Nat. Methods. 3, 27-29），），在体检测候选在体检测候选miRNAmiRNA在中枢神经系统内的时空表达情况。在中枢神经系统内的时空表达情况。2 2、候选、候选miRNAmiRNA对对NSCNSC增殖分化的调控作用。增殖分化的调控作用。利用生物合成的利用生物合成的miRNA miRNA mimicsmimics和和inhibitsinhibits分别转染神经细胞系细胞
33、和培养的原代神经球分别转染神经细胞系细胞和培养的原代神经球（Sathyan, P. et al. 2007, J. Neurosci. 27, 8546-8557Sathyan, P. et al. 2007, J. Neurosci. 27, 8546-8557），），初步观察候选初步观察候选miRNAmiRNA对对NSCNSC增殖分化等生物学行为的影响；利用病毒增殖分化等生物学行为的影响；利用病毒感染体系构建含有感染体系构建含有EGFPEGFP的针对候选的针对候选miRNAmiRNA的过表达载体，以及反义的过表达载体，以及反义序列的表达载体，感染原代培养的神经球，观察序列的表达载体，感染原
34、代培养的神经球，观察NSCNSC增殖分化等细增殖分化等细胞生物学行为的变化；用胚胎电转染的方法将上述过表达载体和反胞生物学行为的变化；用胚胎电转染的方法将上述过表达载体和反义载体转染至不同阶段小鼠胚胎的室管膜（下）带，结合义载体转染至不同阶段小鼠胚胎的室管膜（下）带，结合NSCNSC增殖增殖分化相关的标记物的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察被转分化相关的标记物的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察被转染的染的NSCNSC的变化。的变化。研究内容：研究内容：筹圭啸蟹徒梢氯渝叮部痘鹊膏颤晦豺荫略楼母厦缀苇矛队焉铅熟涪怒纂诈国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写
35、3 3、候选、候选miRNAmiRNA调控调控NSCNSC增殖分化的分子机制。增殖分化的分子机制。首先探讨差异表达的首先探讨差异表达的miRNAmiRNA与与NotchNotch信号的关系，主要研究这些差异信号的关系，主要研究这些差异miRNAmiRNA是否是是否是NotchNotch信信号途径的下游分子，包括其启动子区的生物信息学分析（号途径的下游分子，包括其启动子区的生物信息学分析（RBP-JRBP-J或或HesHes家族识别序列的存在与否），以及用体外和体内实验方法证实家族识别序列的存在与否），以及用体外和体内实验方法证实这些这些miRNAmiRNA的表达是否受的表达是否受Notch/R
36、BP-JNotch/RBP-J信号的调控。其次是借助生物信号的调控。其次是借助生物信息学方法分析信息学方法分析miRNAmiRNA靶分子，并综合使用靶分子，并综合使用LuciferaseLuciferase报告基因实报告基因实验、基因转染和定量验、基因转染和定量RT-PCRRT-PCR、定位突变等方法分析、定位突变等方法分析miRNAmiRNA对靶分子对靶分子的调控作用，再根据靶分子的特征进行更加深入的分子机制的研究。的调控作用，再根据靶分子的特征进行更加深入的分子机制的研究。4 4、体内验证、体内验证NotchNotch途径和候选途径和候选miRNAmiRNA之间的调控关系。之间的调控关系。
37、对于经过分对于经过分子水平验证的子水平验证的miRNAmiRNA，用过表达或是抑制表达的病毒载体来感染，用过表达或是抑制表达的病毒载体来感染RBP-JRBP-J剔除胚胎小鼠，观察我们前期观察到的剔除胚胎小鼠，观察我们前期观察到的NSCNSC增殖分化异常增殖分化异常(Gao (Gao F, et al. Mol Cell Neurosci. 2009, 40: 442-450)F, et al. Mol Cell Neurosci. 2009, 40: 442-450)是否能够被是否能够被挽救，以验证挽救，以验证NotchNotch途径和候选途径和候选miRNAmiRNA两者在体内的调节关系。两
38、者在体内的调节关系。 研究内容：研究内容：龟授至含捻澎豢璃幅需眼弘忿绞拿胡刘昌买鹅恒躁鸟聂峭栅安黑捏澜帮券国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写拟解决的关键科学问题：拟解决的关键科学问题：（1）什么是自己研究的领域的关键科学问题？为）什么是自己研究的领域的关键科学问题？为什么？什么？（2）本研究解决这个问题的逻辑思路是什么？解）本研究解决这个问题的逻辑思路是什么？解决这个问题有何意义？决这个问题有何意义？咆科凰壤息矛涛豪妒遥炼辗缮仑榴仙宠郭锚痊亿骸谁预醛蹲仲叹十勿住喻国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写本课题拟回答的关键科学
39、问题：本课题拟回答的关键科学问题：本课题拟回答的根本科学问题是本课题拟回答的根本科学问题是Notch信号调控信号调控NSC增殖分化的分子机制问题。文献报道和我们的增殖分化的分子机制问题。文献报道和我们的前期工作得出了前期工作得出了Notch信号调控信号调控NSC的一致结论，但进一步的分子的一致结论，但进一步的分子机制是有待回答的进一步问题。而机制是有待回答的进一步问题。而Notch通路和通路和miRNA分子在分子在NSC发育过程中都发挥着重要的作用，但是他们之间是否存在发育过程中都发挥着重要的作用，但是他们之间是否存在cross-talk？如果有，各自在调控网络中又分别扮演着什么角色？两者之？
40、如果有，各自在调控网络中又分别扮演着什么角色？两者之间是如何相互影响相互调控的？这种相互调控最终对间是如何相互影响相互调控的？这种相互调控最终对NSC的增殖分的增殖分化又会是怎样的影响？这些调控和调控间的相互作用可能贯穿着神化又会是怎样的影响？这些调控和调控间的相互作用可能贯穿着神经系统发育的全过程。阐明这些调控因素之间的相互作用，不仅对经系统发育的全过程。阐明这些调控因素之间的相互作用，不仅对于我们理解于我们理解NSC发育的基本过程有着重要的意义，而且对于我们将发育的基本过程有着重要的意义，而且对于我们将来利用来利用NSC进行疾病治疗也具有至关重要的意义。本课题前期通过进行疾病治疗也具有至关
41、重要的意义。本课题前期通过miRNA芯片在芯片在Notch途径阻断的小鼠中检测到一组发生改变的途径阻断的小鼠中检测到一组发生改变的miRNA分子，我们拟在此基础上重点观察分子，我们拟在此基础上重点观察Notch途径对途径对miRNA的的调控，以明确这两个在调控，以明确这两个在NSC发育过程中都十分重要的因素之间的相发育过程中都十分重要的因素之间的相互作用，以及他们的相互作用对于互作用，以及他们的相互作用对于NSC增殖分化的调控。增殖分化的调控。功冰估姚焰额主判派桌坛挛兵焕借雕汤陷雏虾躬味刘芥歉荚坝袱钦跃币抬国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写课题设计的原则课
42、题设计的原则对照原则：对照原则：医学研究主要是通过对比实验组和对照组的差别来回医学研究主要是通过对比实验组和对照组的差别来回答干预因素的效应，所以完美的对照组设计十分重要答干预因素的效应，所以完美的对照组设计十分重要重复原则：重复原则：医学研究是设计的实验，差别的真实性需要经过统计医学研究是设计的实验，差别的真实性需要经过统计学检验，所以保质保量的重复实验是发现真理的保证学检验，所以保质保量的重复实验是发现真理的保证拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明） 冉摧吊乐射蹿炼碑窃
43、桐磷驯寸币参广酷拳香氢宴越磊敲蔫拖羡龋瞒牌音寞国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究方法：用研究方法：用xxx观察分析观察分析xxx；用；用xxx观察分析观察分析xxx；技术路线：最好图示一个总体技术路线技术路线：最好图示一个总体技术路线实验研究方案：结合技术路线，把研究内容里的各项实验具体化（步骤、实验研究方案：结合技术路线，把研究内容里的各项实验具体化（步骤、分组、分组、对照、重复）对照、重复）关键技术说明：课题可能遇到的技术难点，需加以说明关键技术说明：课题可能遇到的技术难点，需加以说明常见问题：常见问题：（1）技术路线图太复杂）技术路线图太复杂（2
44、）研究方案与研究内容不吻合，只是简单地罗列方法和）研究方案与研究内容不吻合，只是简单地罗列方法和Protocol（3）研究方案过于繁琐或过于简单，尤其是过分简单）研究方案过于繁琐或过于简单，尤其是过分简单（4）方案不完善甚至出错：该做的实验没有写；用人组织样品杂交小鼠芯片；）方案不完善甚至出错：该做的实验没有写；用人组织样品杂交小鼠芯片；购买某公司的试剂，而该公司已倒闭；写的是别的课题的方案；购买某公司的试剂，而该公司已倒闭；写的是别的课题的方案；（5）关键技术需要说明：基因剔除小鼠；关键抗体；）关键技术需要说明：基因剔除小鼠；关键抗体；萌哥撒襟芝恒视蜗多敖五澡藏黍烦样圭小匡钨鲤喷决绝叮钩掖黎
45、乃刷雇惕国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写妇脉惕纯匀遇钒蜡规摊州玻茎镍剁绝店纽了盖憎惶枷抢惨闲卧现故凄罕懂国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写可行性分析：可行性分析：（1）理论可行性）理论可行性（2）条件可行性）条件可行性（3）研究基础可行性、）研究基础可行性、1）miRNA靶基因的筛选将可能是本课题面临的重要的技术问题。靶基因的筛选将可能是本课题面临的重要的技术问题。miRNA的靶分子预测的靶分子预测显示动物全部基因中有多于显示动物全部基因中有多于1/3的基因都可能受到的基因都可能受到miRNA的调控（的调控（Lewi
46、s BP et al. 2005, Cell. 120, 1520）。而且一个）。而且一个miRNA可能抑制多个靶分子可能抑制多个靶分子mRNA的翻译，一个的翻译，一个mRNA又又会受到多个会受到多个miRNA的调节（的调节（Bartel DP. 2004, Cell. 116, 281297）。这为候选）。这为候选miRNA靶靶基因的筛选带来很大的困难。因此，充分利用生物信息学分析方法，并结合已知的调节基因的筛选带来很大的困难。因此，充分利用生物信息学分析方法，并结合已知的调节NSC增殖分化的分子信息知识，在本课题中显得十分重要。增殖分化的分子信息知识，在本课题中显得十分重要。2）对候选）对
47、候选miRNA进行体内的进行体内的功能研究也将有一定难度。主要是如何提高特定功能研究也将有一定难度。主要是如何提高特定miRNA在原代培养神经细胞和在体转染在原代培养神经细胞和在体转染的效率。这一点我们拟通过构建病毒载体，来进行原代培养细胞的转染；而在体的转染，的效率。这一点我们拟通过构建病毒载体，来进行原代培养细胞的转染；而在体的转染，我们拟通过构建病毒载体结合胚胎电转染的方法进行。课题组成员郑敏化博士在中国科学我们拟通过构建病毒载体结合胚胎电转染的方法进行。课题组成员郑敏化博士在中国科学院上海神经科学研究所工作期间已经针对本技术接受了专门训练，并已将此方法成功应用院上海神经科学研究所工作期
48、间已经针对本技术接受了专门训练，并已将此方法成功应用于关于视网膜发育的研究（于关于视网膜发育的研究（Zheng et al. 2009, Mol Brain 2:38）。）。关键技术说明：容易让人怀疑的研究内容和方案，需关键技术说明：容易让人怀疑的研究内容和方案，需要特别说明要特别说明阐纹闪剃偶工沮恬卤盂竹敦做玄右剁萎缆捅算小滞艰港豌辅挥反斜类配印国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写项目特色与创新之处项目特色与创新之处项目特色：项目特色：研究过程中的研究思路、目标、内容、方案、关键问题、可行研究过程中的研究思路、目标、内容、方案、关键问题、可行性与现有研究相
49、比有哪些性与现有研究相比有哪些不一样不一样（特色）（特色） 具有具有不一样不一样的研究意义？的研究意义？ 抓住了抓住了不一样不一样的研究问题？的研究问题？ 从从不一样不一样的角度研究问题？的角度研究问题？ 采用了采用了不一样不一样的实验平台和方法？的实验平台和方法？ 创新之处：创新之处：研究结束后会产生哪些研究结束后会产生哪些新知识新知识（创新）（创新） 新新理论、理论、新新机制、机制、新新解释、解释、新新功能功能新新分子、分子、新新通路、通路、新新靶点、靶点、新新型相互作用型相互作用新新方法、方法、新新技术、技术、新新疗法、疗法、新新研究平台研究平台滴淮噶导帽悬余憾筒翰绩麓殖普微订代斤垄琅器
50、痊檀棘圆樟裸甩报耿凶盘国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写特色与创新特色与创新本课题在以往工作的基础上提出本课题在以往工作的基础上提出“Notch信号通过信号通过miRNA调控哺乳类调控哺乳类NSC增殖增殖分化分化”，并在前期工作中筛选到一组在，并在前期工作中筛选到一组在Notch信号途径关键转录因子信号途径关键转录因子RBP-J基因基因剔除后差异表达的剔除后差异表达的miRNA。在此基础上进一步阐明其在。在此基础上进一步阐明其在NSC中的作用及其与中的作用及其与Notch信号的关系。这些研究：信号的关系。这些研究：可以明确参与调控可以明确参与调控NSC自我
51、更新和分化的自我更新和分化的新新的的miRNA，并初步阐明其，并初步阐明其作用的新机制作用的新机制；就我们掌握的文献，虽然已知多就我们掌握的文献，虽然已知多种种miRNA可以调控可以调控Notch信号某些分子的表达，但到目前为止还没有报道在哺信号某些分子的表达，但到目前为止还没有报道在哺乳类乳类Notch信号可以通过信号可以通过miRNA调控发育过程，所以本课题的研究有望揭示调控发育过程，所以本课题的研究有望揭示Notch信号调控中枢神经系统发育的信号调控中枢神经系统发育的新机制新机制，具有明显的理论创新性。，具有明显的理论创新性。本课题组研究本课题组研究Notch信号途径功能的突出特色在于课
52、题组建立的信号途径功能的突出特色在于课题组建立的RBP-J条件性条件性基基因剔除小鼠平台因剔除小鼠平台。由于。由于RBP-J是是Notch四种受体的共同下游分子，较之以往四种受体的共同下游分子，较之以往Notch1剔除等模型，剔除等模型，RBP-J条件性剔除的最大优势在于实现经典条件性剔除的最大优势在于实现经典Notch信号的条信号的条件性件性完全阻断完全阻断，全面反映经典，全面反映经典Notch信号途径的调控作用。在此基础上获得候信号途径的调控作用。在此基础上获得候选选miRNA，在本研究中经过细胞和分子水平的研究后再在，在本研究中经过细胞和分子水平的研究后再在RBP-J条件性剔除小条件性剔
53、除小鼠上证实其作用，可以最大限度地获得鼠上证实其作用，可以最大限度地获得Notch-miRNA相互关系的体内证据，有相互关系的体内证据，有明显特色。明显特色。揍银绞武悟绕美描由手愁善夯衅纹渠慨叠侥咸恋琴辰倾俏的扎堪刺师陕置国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写年度研究计划和预期结果年度研究计划和预期结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等） 年度计划：年度计划： 合理划分：合理划分：四年四年 研究内容：分散在四年，不能只写题目研究内容：分散在四年，不能只写题目国际合作与交流计划国际合作与交流
54、计划预期结果：预期结果： 1、理论成果：阐明、理论成果：阐明xxx，解决，解决xxx问题问题 2、发表论文、发表论文 3、可能产生的专利、可能产生的专利 4、人才培养、人才培养痕袄赶佬沙凋海见霜谢坏彩晰郁体学捍嘉几茅驰湾幸渊朵居七肠耪歉妊绪国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写工工 作作 基基 础础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩） 相关研究工作积累：相关研究工作积累： 项目相关项目相关 已经发表的工作的核心内容已经发表的工作的核心内容 没有发表的实验结果：要有没有发表的实验结果：要有Leg
55、end!已取得的研究工作成绩：已取得的研究工作成绩： 1、理论成果：获奖、理论成果：获奖 2、发表论文、发表论文 3、已经产生的专利、已经产生的专利 4、人才培养、人才培养按照研究内容的按照研究内容的“故事故事”逻辑归纳总结，突出重点避免罗列逻辑归纳总结，突出重点避免罗列睛扦填适倾皋昧榷表威净馁垂真矢谜许剧泽坷谗震律浅樟鸽响屁拧陨喻狭国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写工工 作作 条条 件件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。包
56、括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。） 1、已经具备的实验条件：全校都可写，注意与研究方法吻合、已经具备的实验条件：全校都可写，注意与研究方法吻合2、尚缺少的实验条件：动物、仪器设备、尚缺少的实验条件：动物、仪器设备解决途径：动物购买合同、仪器设备使用协议、合作协议解决途径：动物购买合同、仪器设备使用协议、合作协议3、国家重点实验室和部门开放实验室、国家重点实验室和部门开放实验室肿瘤生物学国家重点实验室肿瘤生物学国家重点实验室教育部教育部XX重点实验室重点实验室军队军队XX重点实验室重点实验室篙堰最及疗帐竭滇随锌便微夯各柱廉地身泅抚饱九耀腕叶童刺佳宇楞逝赶国家自然科学基金课题
57、设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写申请人简历申请人简历包括申请人和项目组主要参与者的学历和研究工作简历，近期已包括申请人和项目组主要参与者的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、
58、授奖年等申请人和主要参与者：申请人和主要参与者：（1）学历和研究工作简历：主要学历和简历，强调与本课题相关的）学历和研究工作简历：主要学历和简历，强调与本课题相关的（2）论著：）论著：Yao-Chun Wang, Fei He, Xiao-Wei Liu, Guang-Ying Dong, Hong-Yan Qin, Xing-Bin Hu, Fan Feng, Min-Hua Zheng, Liang Liang, Lei Feng, Ying-Min Liang, Hua Han. Notch signaling determines the M1 versus M2 polarizati
59、on of macrophages in anti-tumor immune responses. Cancer Res. 2010; 70:4840-4849. (封面文章封面文章) （3）奖励：）奖励：韩骅，秦鸿雁，王冀姝，杨曦，梁英民，孙强，李军林，李军锋：韩骅，秦鸿雁，王冀姝，杨曦，梁英民，孙强，李军林，李军锋：Notch信号途信号途径对细胞分化的调控及其机理的研究，陕西省科学技术奖一等奖，径对细胞分化的调控及其机理的研究，陕西省科学技术奖一等奖，2006年年课题组：真实性、职称均衡、合理分工、研究生参与课题组：真实性、职称均衡、合理分工、研究生参与针肩笨酬腻箕灸弹爬插芳班滑臻难擂疡璃
60、旋言蝶赡方断斯独酵嫁污瞒烤弧国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写承担科研项目情况承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。）止年月、负责的内容等。）强调与本课题的关系和区别强调与本课题的关系和区别评委可以随时查阅评委可以随时查阅! 完成国家自然科学基金情况完成国家自然科学基金情况桔断乍街醚嵌瘦谬质掣鲸济齐槐镊额僳舱哆期载秧缨赚低助工矢缄债伟弊国家自然
61、科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写重点项目立项的思考重点项目立项的思考核心科学问题（题目与依据）重大学科前沿问题、国家发展重大问题（遵照指南）有足够的普遍性和代表性解决问题的思路（目标与内容）全面：分子、细胞、动物、人体具有内在的逻辑关系凝练好特色和创新研究工作基础（基础和团队）前期的创新性发现：负责人的5篇代表作，至少1篇发表在学科主流以上的杂志必须与本课题相关：可以作为本课题的直接工作基础/条件好的研究平台同一方向完成同一方向完成3 3项左右的面上项左右的面上项目后可考虑项目后可考虑剧钮蛆鸭彝借剐峦邪播执寝朱耗躺焰殴庐砒挪枢茶挑半纪劫础莎鄂抽怂扑国家自然科学基
62、金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写新生血管形态形成及其分子调控机理的研究新生血管形态形成及其分子调控机理的研究血管的形态发生是胚胎和成年个体新生血管网形成的核心步骤，血管的形态发生是胚胎和成年个体新生血管网形成的核心步骤，形态完整的血管网不仅是胚胎发育的需要，还参与成年个体创伤形态完整的血管网不仅是胚胎发育的需要，还参与成年个体创伤修复及组织再生等生理过程，而形态异常的血管结构与肿瘤、糖修复及组织再生等生理过程，而形态异常的血管结构与肿瘤、糖尿病眼底损害等疾病密切相关。尿病眼底损害等疾病密切相关。我们发现，在成年小鼠条件性剔我们发现，在成年小鼠条件性剔除除Notch信号
63、途径的关键转录因子信号途径的关键转录因子RBP-J，可以引起动物广泛而严，可以引起动物广泛而严重的自发新生血管形成，但形成的新生血管不具有正常的血管形重的自发新生血管形成，但形成的新生血管不具有正常的血管形态和功能。结合文献报道，这些结果提示态和功能。结合文献报道，这些结果提示Notch信号途径是正常信号途径是正常血管形态形成的必需信号。血管形态形成的必需信号。本课题拟在此基础上，深入探讨本课题拟在此基础上，深入探讨Notch信号途径在血管形态形成中对血管内皮细胞、血管平滑肌信号途径在血管形态形成中对血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及内皮祖细胞的调控作用；明确细胞以及内皮祖细胞的调控作用；明确N
64、otch信号途径阻断引起信号途径阻断引起自发新生血管形态形成异常的细胞基础；阐明自发新生血管形态形成异常的细胞基础；阐明Notch信号途径调信号途径调控新生血管形成的分子机理及其与其他信号途径的相互作用。控新生血管形成的分子机理及其与其他信号途径的相互作用。这这些研究对于深入了解血管形态形成的分子调控机理，以及在此基些研究对于深入了解血管形态形成的分子调控机理，以及在此基础上开发血管靶向药物，具有重要的理论和实际意义。础上开发血管靶向药物，具有重要的理论和实际意义。2008年招标方向：形态发育的调控机制年招标方向：形态发育的调控机制韶庚笨煮闰炕叼炸纤哺撤稍删踪议贸驰但剩威乃追攘敖政锥靠脚粥芥季
65、梆国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写立论依据立论依据血管发育及其调控血管发生血管形成动脉形成Notch与血管发育Notch信号途径Notch与血管发育Notch与血管形态形成的关系不明确，机制不清楚调控机制不完全清楚；调控机制不完全清楚；都与都与NotchNotch有关（下文）有关（下文）融入自己的工作融入自己的工作砍沸田篱抬娃耗栈会笋细虚荤叠刷食廉仪堆仟谴趴氢地挺淋砂爆壳裹巳斥国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究目标研究目标以Notch/RBP-J信号途径为核心，阐明血管形态形成过程中的分子调控网络及其作用机理，为
66、血管靶向药物的研发奠定基础。恳斧囊搓匙贺掏纷日黑皮坪崇拌慧腊达乍芒车者钮犹丽篙井锻绰助拌寐猛国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究内容研究内容Notch信号途径在血管形态形成中对内皮细胞的作用：信号途径在血管形态形成中对内皮细胞的作用：利利用血管内皮细胞特异性可诱导用血管内皮细胞特异性可诱导Cre转基因小鼠（转基因小鼠（Tie2-ERTCre，见工作基础），与，见工作基础），与RBP-Jfloxed小鼠交配后，诱导在小鼠交配后，诱导在血管内皮细胞条件性剔除血管内皮细胞条件性剔除RBP-J基因。观察体内自发新生基因。观察体内自发新生血管形成和创伤、肿瘤等诱导
67、的新生血管形成。通过体内血管形成和创伤、肿瘤等诱导的新生血管形成。通过体内的组织学分析和免疫组织化学染色分析，观察血管内皮细的组织学分析和免疫组织化学染色分析，观察血管内皮细胞在胞在Notch/RBP-J信号阻断后的增殖、凋亡、伪足生长、以信号阻断后的增殖、凋亡、伪足生长、以及动及动-静脉标志表达等的变化，以全面了解静脉标志表达等的变化，以全面了解RBP-J基因剔除基因剔除引起的血管内皮细胞的形态和功能变化。通过体外血管内引起的血管内皮细胞的形态和功能变化。通过体外血管内皮细胞培养，分析皮细胞培养，分析RBP-J剔除后小鼠内皮细胞增殖和凋亡剔除后小鼠内皮细胞增殖和凋亡的改变以及细胞周期时相和调
68、控分子的改变；观察血管内的改变以及细胞周期时相和调控分子的改变；观察血管内皮细胞伪足生长和迁移黏附的改变；通过体外三维培养分皮细胞伪足生长和迁移黏附的改变；通过体外三维培养分析析RBP-J基因剔除后小鼠内皮细胞形成血管网的能力的变基因剔除后小鼠内皮细胞形成血管网的能力的变化。化。东卖奴促陇术醚寇将泡汉踪套匆翱特阀雨紫精喷虱卸沂悄琅旭铬达尔白钱国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究内容研究内容Notch信号对血管平滑肌细胞的影响信号对血管平滑肌细胞的影响：利用Mx-Cre转基因小鼠和RBP-Jfloxed小鼠在血管平滑肌中剔除RBP-J以阻断Notch信号途
69、径。在上述新生血管形成模型中观察新生血管形态形成中血管平滑肌细胞的募集和迁移黏附等细胞生物学变化，观察其与血管内皮细胞的相互作用。建立体外血管内皮细胞-血管平滑肌细胞的共培养，然后分别以RBP-J剔除的内皮细胞与野生型平滑肌细胞共培养、或RBP-J剔除的平滑肌细胞与野生型内皮细胞共培养，判断Notch信号途径在内皮细胞-平滑肌细胞相互作用中的意义。 Notch信号途径对内皮祖细胞的影响信号途径对内皮祖细胞的影响：利用Mx-Cre转基因小鼠和RBP-Jfloxed小鼠在骨髓中剔除RBP-J以阻断Notch信号途径。用流式细胞仪分析骨髓和外周血中内皮祖细胞的水平的变化。在MxCre-RBPflox
70、ed小鼠中进一步引入GFP转基因，然后将GFP+RBP-J剔除的骨髓细胞移植到正常受体小鼠，观察GFP+内皮祖细胞在受体小鼠中的分化以及参与新生血管形态形成的变化。绩躺少深蜕逞锐盐剔哲岳慰尹石狡雏兑彦纳悬拓膳吾己搬郝甥裹计七障铝国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究内容研究内容Notch信号调节血管形态形成的下游分子信号调节血管形态形成的下游分子：利用小鼠基因芯片，分析RBP-J剔除的内皮细胞和正常对照内皮细胞之间基因表达的差异，寻找RBP-J调控内皮细胞增殖分化的下游分子；利用Western blot分析培养的内皮细胞中MAPK信号途径和PI-3-K/A
71、kt信号途径主要分子的水平和磷酸化水平的改变；利用相应信号途径的特异抑制剂分析其在Notch信号阻断引起的内皮细胞变化中的意义。Notch信号途径调节血管形态形成中与其他信号途径的相信号途径调节血管形态形成中与其他信号途径的相互作用互作用：利用报告基因实验、蛋白质相互作用实验、染色质免疫共沉淀实验等分子生物学方法，重点研究Notch信号途径与VEGFR信号途径、EphrinB2/EphB4信号的相互调控关系及其在新生血管形态形成中的意义。江鲸豹缀尹跃棠票伺颠垫匠获廓耶倍醇曹蕉辊他倪谗葫哑滓届肛习媳唆零国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写拟解决的关键问题拟解决
72、的关键问题拟解决的关键科学问题：本项目拟解决的关键科学问题是血管形态形成的分子调控机理。与其他器官的形态形成一样，血管的形态形成受到多个信号途径的多阶段调控。大量的文献和我们的研究结果都提示Notch信号途径在血管形态形成的分子调控网络中可能发挥核心作用，但其作用的细胞和分子机理并不清楚。本课题拟在以往工作的基础上，利用已经建立的条件性基因剔除小鼠模型，结合其他细胞和分子生物学手段进行深入研究，可望以Notch信号途径为核心，阐明血管形态形成的分子调控机理。锗非鉴阉捣植惯得峭禾锻泳程寻璃胳澎膛婉弱庞廓癣经比堑赛盘象捡脆皑国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写拟
73、解决的关键问题拟解决的关键问题拟解决的拟解决的关键技术问题关键技术问题：形态发育的研究离不开动物模型。既往对：形态发育的研究离不开动物模型。既往对Notch在哺在哺乳类血管形态发育中的作用的研究主要使用乳类血管形态发育中的作用的研究主要使用Notch信号途径的主要分子的常规信号途径的主要分子的常规基因剔除模型，观察早期胚胎中血管的形态形成缺陷和细胞改变。此外，基因剔除模型，观察早期胚胎中血管的形态形成缺陷和细胞改变。此外，Dll4基因剔除的杂合子小鼠或部分非纯系纯合子小鼠可发育到出生，观察这些小基因剔除的杂合子小鼠或部分非纯系纯合子小鼠可发育到出生，观察这些小鼠的视网膜血管网也能更好地反映血管
74、网的生长和鼠的视网膜血管网也能更好地反映血管网的生长和EC的变化。但这些小鼠模的变化。但这些小鼠模型存在不同的缺陷。比如，型存在不同的缺陷。比如，Notch信号的主要分子的基因剔除往往引起早期胚信号的主要分子的基因剔除往往引起早期胚胎死亡，限制了对其形态变化的深入研究尤其是在成体动物研究中的应用；胎死亡，限制了对其形态变化的深入研究尤其是在成体动物研究中的应用；其次，哺乳动物有四种其次，哺乳动物有四种Notch受体，分布重叠而且有功能代偿。单纯剔除一种受体，分布重叠而且有功能代偿。单纯剔除一种受体或配体难以反映整个信号途径作用的全貌。申请人建立的转录因子受体或配体难以反映整个信号途径作用的全貌
75、。申请人建立的转录因子RBP-J条件性基因剔除小鼠模型可以基本解决这些问题。我们的前期研究证实，利条件性基因剔除小鼠模型可以基本解决这些问题。我们的前期研究证实，利用这一系统可以在成年动物内皮细胞剔除用这一系统可以在成年动物内皮细胞剔除RBP-J，同时由于，同时由于RBP-J介导全部四种介导全部四种Notch受体的转录激活作用，所以这一系统可以在成年动物内皮细胞中完全阻受体的转录激活作用，所以这一系统可以在成年动物内皮细胞中完全阻断断Notch信号，从而反映出信号，从而反映出Notch信号在小鼠血管形态生成中的作用。信号在小鼠血管形态生成中的作用。利用利用Cre-LoxP系统进行条件性基因剔除
76、，关键是系统进行条件性基因剔除，关键是Cre转基因小鼠的建立。我们转基因小鼠的建立。我们在前期研究中采用了在前期研究中采用了MxCre。虽然可以在内皮细胞中进行有效的剔除，但该系。虽然可以在内皮细胞中进行有效的剔除，但该系统同时可在其他组织如骨髓中表达统同时可在其他组织如骨髓中表达Cre。为了提高在内皮细胞中表达。为了提高在内皮细胞中表达Cre的专一的专一性，我们进一步构建了性，我们进一步构建了Tie2-ERTCre，已经得到，已经得到Founder小鼠。该小鼠可以在小鼠。该小鼠可以在Tamoxifen诱导后，可以特异地在血管内皮细胞中特异性表达诱导后，可以特异地在血管内皮细胞中特异性表达Cr
77、e，实现组织特，实现组织特异性可诱导剔除。异性可诱导剔除。卑适真射颐咱查猫粹耽慢氛汗锐盆向爬侧决坊象竟谗愧扛颓毗去转丰甸藩国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写匹充添坛鸟关慎每沿录芭接停烁托耽斯刷厌甲庞余微捆锐言剪潮陶纵刺谩国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写项目的特色和创新之处项目的特色和创新之处项目特色：项目特色：（1）由于RBP-J介导四种Notch受体的转录激活活性，本课题所得结果可以回答Notch在体内对血管形态形成中的作用。本项目利用已经建立的RBP-J条件性基因剔除小鼠研究Notch信号途径在成体血管生成中的作
78、用，具有可靠的工作基础和前期研究结果。结合深入的分子生物学研究，可阐明血管形态形成的细胞和分子机理。（2）以往文献中多采用胚胎期血管形成模型（包括新生小鼠的视网膜血管发生）进行关于血管形态的发生的研究。本研究采用成年动物新生血管形态形成为模型进行研究，研究结果可能直接具有医学意义。檀用雇陌惑瓮眠武溶沈守天费脊僳娄掺终郸协距荷第衰匣澄掩江猫蜂斗罗国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写创新之处：创新之处：（1）虽然有关血管形成中血管形态形成已经进行了大量的研究，）虽然有关血管形成中血管形态形成已经进行了大量的研究，但到目前位置参与血管形态形成的信号途径、作用机理和
79、相互作但到目前位置参与血管形态形成的信号途径、作用机理和相互作用还没有内完全阐明。本课题组首先在成年个体血管内皮细胞中用还没有内完全阐明。本课题组首先在成年个体血管内皮细胞中剔除剔除RBP-J，发现血管形成虽然明显增加但血管形态结构和功能异，发现血管形成虽然明显增加但血管形态结构和功能异常。本课题在以往工作的基础上，以常。本课题在以往工作的基础上，以Notch-RBP-J信号途径为核心信号途径为核心研究血管形态形成中的信号网络，结合进一步的细胞和分子生物研究血管形态形成中的信号网络，结合进一步的细胞和分子生物学研究，可以实现在血管形态形成的细胞和分子调控机理研究领学研究，可以实现在血管形态形成
80、的细胞和分子调控机理研究领域的域的知识创新知识创新。（2）虽然以往的研究认为）虽然以往的研究认为Notch信号途径在血管祖细胞的分化中信号途径在血管祖细胞的分化中作用不大，但本课题组的前期研究却提示在成年小鼠作用不大，但本课题组的前期研究却提示在成年小鼠Notch信号信号途径有可能调控血管祖细胞的分化。本课题在此基础上对这一现途径有可能调控血管祖细胞的分化。本课题在此基础上对这一现象进行进一步研究和确认，并探讨其分子象进行进一步研究和确认，并探讨其分子调控机理调控机理。有关研究尚。有关研究尚未见报道。未见报道。（3）以血管为靶向的药物开发是治疗包括肿瘤在内的多种人类）以血管为靶向的药物开发是治
81、疗包括肿瘤在内的多种人类疾病的研究方向。本课题的研究将为这类应用研究建立疾病的研究方向。本课题的研究将为这类应用研究建立新的平台新的平台并奠定进一步研发的理论基础。并奠定进一步研发的理论基础。棱磊檀窃行凝蓟手压虑劈固蓬菠耀脂岗笆阀截擞司趁械磊遇违词满掺翟殊国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写研究基础和条件研究基础和条件研究基础：申请人近年来主要从事研究基础：申请人近年来主要从事Notch信号途径的功能和调控信号途径的功能和调控的研究。主要研究成就可概括为以下几个方面：的研究。主要研究成就可概括为以下几个方面：（1）首次建立了转录因子）首次建立了转录因子RBP
82、-J的条件性基因剔除的条件性基因剔除小鼠小鼠。表型分。表型分析表明，析表明，RBP-J可以介导可以介导Notch信号途径对淋巴祖细胞、转换信号途径对淋巴祖细胞、转换B细细胞、辅助性胞、辅助性T细胞以及表皮干细胞的分化的调节。（论文细胞以及表皮干细胞的分化的调节。（论文5篇）篇）（2）筛选）筛选RBP-J结合蛋白了结合蛋白了KyoT2的相互作用的相互作用分子分子，并对，并对KyoT2相相互作用分子对互作用分子对RBP-J的调控作用进行了研究，发现的调控作用进行了研究，发现KyoT2可以将转可以将转录共抑制物录共抑制物PcG蛋白募集到蛋白募集到RBP-J，从而抑制，从而抑制RBP-J的转录活性，提
83、的转录活性，提示示PcG蛋白可对蛋白可对Notch的转录活性进行表观遗传学的转录活性进行表观遗传学“记忆记忆”。利用。利用酵母双杂交系统筛选得到了新酵母双杂交系统筛选得到了新MINT相互作用蛋白，发现相互作用蛋白，发现MINT可可以和多种信号转导分子和转录因子相互作用。（论文以和多种信号转导分子和转录因子相互作用。（论文7篇）篇）（3）研究了）研究了Notch信号途径分子在肿瘤和信号途径分子在肿瘤和B细胞分化中的作用。细胞分化中的作用。建立了建立了B细胞受体转基因小鼠模型，用细胞受体转基因小鼠模型，用基因芯片基因芯片对比了外周对比了外周B细胞细胞的主要亚群之间的基因表达差异，鉴定了二者在表面标
84、志和分化的主要亚群之间的基因表达差异，鉴定了二者在表面标志和分化调控方面的部分分子。（论文调控方面的部分分子。（论文5篇）篇）排毋憾捐则獭击景梆晒功蒋闹追咨庐引香谦毡宫遵姜涤泅咏匀峦壁糕宫翁国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写前期工作：前期工作：利用利用RBP-Jfloxed小鼠和小鼠和Mx-Cre小鼠，得到小鼠，得到RBP-J条件性基因剔除小鼠（条件性基因剔除小鼠（RBPf/f-MxCre），通过注射干扰素诱生剂诱导成年小鼠），通过注射干扰素诱生剂诱导成年小鼠RBP-J的剔除。分析诱导后的的剔除。分析诱导后的RBPfloxed-MxCre小鼠，得到以下发现
85、（具体结果参见小鼠，得到以下发现（具体结果参见DouGR,HanH,etal.FASEBJ.2008;Epubaheadofprint）：）：与对照小鼠相比，剔除小鼠有明显的自发新生血管形成。与对照小鼠相比，剔除小鼠有明显的自发新生血管形成。新生血管不具有完整结构和功能，表现在角膜新生血管有明显地红细胞外泄，以及在新生血管不具有完整结构和功能，表现在角膜新生血管有明显地红细胞外泄，以及在Metrigel中生长的新生血管有明显的出血。中生长的新生血管有明显的出血。Notch信号可能调控血管祖细胞的增殖和分化。信号可能调控血管祖细胞的增殖和分化。Notch信号可抑制内皮细胞的增殖，并且抑制信号可抑
86、制内皮细胞的增殖，并且抑制VEGFR2但促进但促进VEGFR1的表达。的表达。克隆了人克隆了人Notch配体配体Dll1胞外段的胞外段的N端片断（端片断（hDll1），插入原核表达载体，在大），插入原核表达载体，在大肠杆菌中得到高效表达。建立了复性和纯化原核表达的肠杆菌中得到高效表达。建立了复性和纯化原核表达的hDll1的方法。用报告的方法。用报告基因实验等方法证实纯化得到的基因实验等方法证实纯化得到的hDll1蛋白具有刺激蛋白具有刺激Notch受体的活性（具体结受体的活性（具体结果见果见ShiZX,etal,Protein Expr. Purif.Accepted.）。）。发现发现RBP-J
87、基因剔除可引起肝血窦内皮细胞功能异常，引起肝血窦阻塞综合症，基因剔除可引起肝血窦内皮细胞功能异常，引起肝血窦阻塞综合症，进一步提示进一步提示Notch-RBP-J信号途径对于血管内皮细胞分化和结构的作用（信号途径对于血管内皮细胞分化和结构的作用（WangL,HanH,etal,manuscriptinpreparation）。）。构建了构建了Tie2-ERTCre转基因小鼠。按常规方法克隆了小鼠转基因小鼠。按常规方法克隆了小鼠Tie2启动子，在其下游启动子，在其下游插入插入ERTCre融合基因，在内皮细胞中证实其受融合基因，在内皮细胞中证实其受Tamoxifen诱导表达后，经受精诱导表达后，经
88、受精卵显微注射引入小鼠基因组。目前已经得到转基因的基因组整合和传递卵显微注射引入小鼠基因组。目前已经得到转基因的基因组整合和传递（FengL,HanH,etal,unpublished）。）。雷稻缔启铀矮呈哑潦施漂故慕数愿宅窖苗诸岿浸捞烂抠响红锣雍俱叙渍宗国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写细细 节节 决决 定定 成成 败败未能强调工作基础、思路的创新点、关键技术平台等重要事项未能强调工作基础、思路的创新点、关键技术平台等重要事项文字失误：错别字、标点符号、英文拼写、参考文献格式文字失误：错别字、标点符号、英文拼写、参考文献格式科学问题过分虚幻（比如：修改牛
89、顿定律）科学问题过分虚幻（比如：修改牛顿定律）自大，用太多的形容词修饰自己，整个立论依据完全基于自己的工作自大，用太多的形容词修饰自己，整个立论依据完全基于自己的工作夸大研究意义（比如，征服癌症）夸大研究意义（比如，征服癌症）参考文献引用不当：少引，没有和正文对照参考文献引用不当：少引，没有和正文对照个人资料及时个人资料及时update：比如：比如2005年的论文现在仍然在年的论文现在仍然在E-pub阶段阶段个人资料不诚实个人资料不诚实思路不清晰，研究目标思路不清晰，研究目标/内容内容/方案混淆或者错误方案混淆或者错误综述超长、离题、甚至和自己的研究设想矛盾综述超长、离题、甚至和自己的研究设想矛盾:favor/against your idea?一开始使评委产生负面印象（摘要失败：论述不清楚、太短或太长、错别字）一开始使评委产生负面印象（摘要失败：论述不清楚、太短或太长、错别字）孽握吱邻变巫舞杯驭帆赚舌鹊扛罢真扮招蕊摄巨午钥呢枢狰框逝供甄顺任国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写希啤杏脓老卫觉渭添抢取疆痴阂郁鞍被拄窝苇刁孽纯绷捷彬群议饲怨骸兑国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写秘花镇挪彼锋檬遍坯贩询抨来嘎妊耶听酪柄劳瘩寻超悍慨吐续丝毙叔时茄国家自然科学基金课题设计和申请书撰写国家自然科学基金课题设计和申请书撰写
