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1、 RNA干干扰及及应用用RNA Interference (RNAi)Genomics: Whats Next?HapMapSystems BiologyDogmatic View of Gene ExpressionDNAProteinRNAPost-transcriptional Control:Quantitative Control: Levels of mRNA not proportional to levels of mRNA synthesized or protein producedQualitative Control: More than one protein fro
2、m a single gene (e.g. Differential RNA Processing or RNA editing)An “RNA-Centric” View ofGene ExpressionRNADNAProtein二二.RNAi.RNAi发现史发现史三三.RNAi.RNAi作用机制作用机制四四.RNAi.RNAi应用应用一一. RNA. RNA干扰干扰五五.RNAi.RNAi展望展望一一.RNA.RNA干干扰的的简介介RNA干干扰作作用用(RNA interference，RNAi）双双链RNA (doublestranded RNA，dsRNA)引引发的的转录后后基基因因
3、沉沉默默机机制制(post transcriptional gene silencing, PTGS)。l目前目前对RNAi 的定的定义有很多种，不同的有很多种，不同的资料料对其定其定义的的侧重点也不尽相同，如果将重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学看作一种生物学现象，可以有以下定象，可以有以下定义： l RNAi是由是由dsRNA介介导的由特定的由特定酶参与的特异性参与的特异性基因沉默基因沉默现象象,它在它在转录水平、水平、转录后水平和翻后水平和翻译水水平上阻断基因的表达。平上阻断基因的表达。 l RNAi是有是有dsRNA参与指参与指导的，以外源和内源的，以外源和内源mRNA为降解
4、目降解目标的的转基因沉默基因沉默现象。具有核苷酸象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，入或病毒入侵后，细胞中与胞中与转基因或入侵病毒基因或入侵病毒RNA同源的基因同源的基因发生共同基因沉默的生共同基因沉默的现象。象。 RNAi的定的定义l1990, Jorgensen et all材料：材料：petunias l目的：得到紫色更深的花目的：得到紫色更深的花;l方法：构建方法：构建强启启动子的苯基苯乙子的苯基苯乙烯酮合合酶表达表达载体，体，导入入牵牛花牛花;l结果：花果：花变得更白得更白;l分析：内源和外源的苯基苯乙分
5、析：内源和外源的苯基苯乙烯酮合合酶基因的表基因的表达都被抑制达都被抑制,称之称之为共抑制共抑制(cosuppression).二.RNAi.RNAi发现史l1995年，年，Guo S等等试图阻断秀阻断秀丽新小杆新小杆线虫虫（C. elegans）中的）中的par-1基因的表达。基因的表达。l设计： 反反义RNA 特异性地阻断特异性地阻断par-1基因的表达；基因的表达； 正正义RNA 以期以期观察到基因表达的增察到基因表达的增强。l结果果: 二者都同二者都同样地切断了地切断了par-1基因的表达途径。基因的表达途径。这 是与是与传统上上对反反义RNA技技术的解的解释不相符合。不相符合。该 研究
6、小研究小组一直没能一直没能给这个意外以合理解个意外以合理解释。l直直到到1998年年2月月，Fire A和和Mello C才才首首次次揭揭开开这个个悬疑之疑之谜。l他他们将将体体外外转录得得到到的的单链RNA纯化化后后注注射射线虫虫时发现，基基因因抑抑制制效效应变得得十十分分微微弱弱；而而经过纯化化的的双双链RNA却却正正好好相相反反，能能够高高效效特特异异性性阻阻断断相相应基基因因的的表表达。达。l他他们证实，Guo S博博士士遇遇到到的的正正义RNA抑抑制制基基因因表表达达的的现象象，以以及及过去去的的反反义RNA技技术对基基因因表表达达的的阻阻断断，都都是是由由于于体体外外转录所所得得R
7、NA中中污染染了了微微量量双双链RNA而而引起。引起。l该小小组将将这一一现象象称称为RNA干干扰（RNA interference， 简称称RNAi）。）。 2002 Science 杂 志志 评 为“2002年的重大突破年的重大突破” 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine l真真核核生生物物：真真菌菌、果果蝇、拟南南芥芥、锥虫虫、水水螅螅、涡虫、斑虫、斑马鱼等。等。lRNAi在在不不同同物物种种的的表表现形形式式：植植物物中中的的转录后后基基因因沉沉默默、共共抑抑制制及及RNA介介导的的病病毒毒抗抗性性、真真菌菌的的抑抑制制现象。象。RNAi
8、广泛存在于自然界广泛存在于自然界三.RNAi.RNAi作用机制起始起始阶段段效效应阶段段扩增增扩散散阶段段起始起始阶段段u长dsRNAsiRNA 21-23ntuATP, RNase特特异异 核核 酸酸 酶 (Dicer,果果蝇)u切切割割产生生的的siRNA 是是有有3羟基基末末端端和和5磷磷酸酸基基团的的双双链形式形式dsRNAuRISCRISC效效应阶段段uRISC binding targeted RISC binding targeted RNARNAusiRNARISC (RNAinduced silencing complex) ATPu活活化化的的RISC在在单链siRNA引引
9、导下下识别互互补的的mRNA，并并在在RISC中中的的核核酸酸内内切切酶作作用用下下从从siRNA引引导链中中心心所所对应的的靶靶基基因因位位置置切切割割靶靶mRNA，最最后后可可能能再再被被核核酸酸外外切切酶进一步降解，从而干一步降解，从而干扰基因表达。基因表达。u模板：靶模板：靶mRNA切割片段切割片段u引物：引物：siRNAu产物：物：长链dsRNAu依次循依次循环： 新新合合成成的的长链dsRNA同同样可可被被Dicer切切割割、降降解解生生成成大大量量的的次次级siRNA。次次级siRNA又又可可进入入合合成成一一切切割的循割的循环过程，程，进一步放大一步放大RNAi作用。作用。扩增
10、增扩散散阶段段重要特征：重要特征：u只只对exon有有效效，对intron和和promoter无无效效，尚尚未未发现对染色体染色体DNA有影响有影响uRNAi具有很高的特异性具有很高的特异性u放大性放大性 uRNAi的的效效应可可以以穿穿过细胞胞界界限限，在在不不同同细胞胞间长距距离离传递和和维持持四四.RNAi.RNAi应用应用u对抗由转座子和重复序列引起的不稳定性u对抗病毒等外源性物质的侵入u内源基因调控:探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗u由由于于RNAi能能高高效效特特异异的的阻阻断断基基因因的的表表达达，因因而而RNAi成成为研究基因功能的很好的工具。研究基因功能的很好的工
11、具。1.1.研究基因功能研究基因功能u人人们已已经开始利用开始利用RNAi技技术从基因从基因组水平分水平分析哺乳析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出定出许多与疾病相关的基因。多与疾病相关的基因。u黄国忠等黄国忠等 RKN (根根节线虫虫)分泌分泌肽编码基因基因16D10证实这种寄生基因在根种寄生基因在根节线虫的植物寄生虫的植物寄生过程中起到关程中起到关键作作用。用。uZimmermann等等人人对为猕猴猴的的阿阿朴朴脂脂蛋蛋白白B (ApoB)编码的的基基因因施施用用siRNA，成成功功降降低低ApoB蛋蛋白白、血血清清胆固醇和低密度脂蛋白的水平。胆固醇和
12、低密度脂蛋白的水平。u这是是首首次次在在非非人人类灵灵长类动物物中中有有关关RNAi的的全全身身用用药，是是RNAi在在药物物治治疗方法上的重要方法上的重要进展。展。2.2.基因治疗基因治疗uRNAi可以特异性的抑制基因表达，所以可用于可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、基因病、病毒感染、癌症病毒感染、癌症的治的治疗。uRNAi是是机机体体中中古古老老而而天天然然的的抗抗病病毒毒机机制制。目目前前利利用用RNAi抗抗病病毒毒感感染染的的研研究究已已经展展开开，主主要要集集中中在在肝肝炎炎病毒、病毒、HIV病毒。病毒。uJacque等等针对HIV.1基因基因组的的LTR(Longterm
13、inal repeate，LTR)、vif和和nef设计了了siRNA，将，将siRNA转染染进HIV后，后，这些些基因的水平降低了基因的水平降低了95。uRNAi转基基因因小小鼠鼠,运运用用RNAi技技术，设计针对c-myc基基因因的的siRNA可可以以有有效效地地干干扰K562细胞胞中中c-myc的的表表达达，并并进一一步步诱导细胞胞凋凋亡亡 。u利利用用RNA干干扰成成功功构构建建针对突突变p53的的RNA干干扰载体体，此此干干扰载体体可可以以有有效效降降低低p53蛋蛋白白表表达达水水平平，导致致突突变p53基基因因沉沉默默，进而而延延缓PLCPRF5细胞胞生生长速速度，阻滞度，阻滞肿瘤
14、瘤细胞停滞于胞停滞于G1期。期。uRNAi可用来研究可用来研究细胞信号胞信号转导通路和通路和细胞生胞生长分化分化过程。程。uClemens等等应用用RNAi研研究究了了果果蝇细胞胞系系中中胰胰岛素素的的信信号号转导通通路路，证明明RNAi技技术较传统的的转染染实验简单、快快速速、重重复复性性好好，克克服服了了转染染实验中中重重组蛋蛋白白特特异异性性聚聚集集和和转染效率不高的缺点。染效率不高的缺点。u2004年年，Jin等等人人利利用用果果蝇作作为模模式式生生物物发现在在FMRP参参与与神神经元元发育育和和突突触触生生长的的过程程中中，argonau-1起起了了重重要作用，要作用，证明明FMRP
15、能能够调节miRNA信号通路。信号通路。3.3.信号转导信号转导u 人们对RNAi的研究只有短短的几年时间，但进展却极为迅速。可以认为RNAi是一个以小分子RNA为中心的真核细胞基因表达调控系统，它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化，通过对RNAi的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。u 随着后基因组学时代的到来，RNAi作为有效、经济的分析基因功能的技术，已逐渐成为分析包括原生动物在内的所有生物基因功能的有力工具。五.RNAi.RNAi展望u RNAi文库的建立可以便利地开展更多的遗传学研究，这就意味着将有越来越多基因的功能被揭示，可望进行高通量的基因功能分析。而且它还为人们预防
16、和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路，给寄生原虫病的基因治疗、新药开发和生物医学等应用研究领域带来新的变革。u 由于对RNAi分子机制的了解尚不十分明确，目前对dsRNA和siRNA的设计还属于经验性过程，实验设计尚需进一步完善。现有的研究主要集中在模式生物中，是否所有基因的表达都能用RNAi来由于抑制尚不确定，将dsRNA加工成siRNA的类似Dicer的核酸酶也尚未在原生动物的基因库里找到。u 此外，又发现另一种小分子RNA就是piRNA：Piwi蛋白代 表 着 Ago蛋 白 家 族 中 的 一 个 分 支 ， 首 次 在 果 蝇(Drosophila)中发现，随后也发现哺乳动物的Piwi蛋白成员调节着生殖细胞的成熟。与哺乳动物Piwi蛋白结合的小分子RNA被称为piRNAs。该类新型小分子RNA的证实为确定哺乳动物中精子形成过程中的Piwi蛋白的作用提供了起点。这些都将是今后的研究方向。u尽管目前的研究离真正应用还有一段距离，但作为一项极具潜力的新技术，它将给生命科学带来新的期望。Thank you!
