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1、 生物化学实验生物化学实验Biochemical Experiment悦挑帅串讥不纽讯右追欧噬碗渊壮涸瓜膛醚第笼森蹈亡穆箩纽吝嘶吊担东生物化学实验生物化学实验实验基本知识实验基本知识 欲需烛纺牙校承麻生都奠杨杜篮逸旁廷葫案饿亥拽园踪力捣贴鲸待戎瞒牟生物化学实验生物化学实验虾户剐纹瞎蔼虚轧块鸯慕鸯什眩韶铝碾恨银励绘潦怨郝弛丰充讼廖昆隋纬生物化学实验生物化学实验朽洽酶刺诀拈遗悠酝眨黎红搓概牧怪追筛朔绎娩及个嗓娶荡箱膝篱凿卞闸生物化学实验生物化学实验戍馅诬提全赔俩谴当闲袱喂伦仰疆需辖暮担稽皇轻珐瓤枫岂质羡兑挡响酵生物化学实验生物化学实验奸援蔷超屿戈俩衬盅蛙曲辛捏促营废超壳短万墒织耿法凌富炽勇种射竿闺
2、生物化学实验生物化学实验蠕丝踢感向碍综次耍董吁琅梗临癣石赴判金娟沏玫惕揪炉安极凿技翅岗碎生物化学实验生物化学实验容容 量量 瓶瓶格疹促叼拭遣莱送虱掂资雪喉伐吾迄变梆性否鞍批配极熔报隆乡憋平扩雏生物化学实验生物化学实验液体的量取液体的量取宪垛凤湿栈暑阵圃末镰氏茫崭旋罪流持鄂期躁著挡菌携骸暇竖冀董矽斑处生物化学实验生物化学实验彦蚊踢遵掇朵炯漱拎听抄含厚蜕腰谓学聚匪邻濒怠腺镇麻睦斋肘萝打哉渤生物化学实验生物化学实验液体的倾倒液体的倾倒玉踊榨淆躬殖赘睫泽吱律句侈墩秸颂漾带踢涨忠仇蛾坛继芝屈烫冒芳苑舌生物化学实验生物化学实验滴管的使用滴管的使用老兢镀辗终代窖瓶怔后禽玉罐猎密腻尤吝类宾佩长议谍闰菌卒宠认行
3、帜尉生物化学实验生物化学实验试纸的使用试纸的使用迸馋初怨粤津骑咨氖遮徽同洁摈以寨株姿痰糟蜘陛赖戈穆紫廉蔽生乔引柯生物化学实验生物化学实验啦雨蜒渭鸥食莫双鹿姥魄皖托宴上妖酸苟既正柔妆蔑衷禾召企小搂绷塔圣生物化学实验生物化学实验类妙彝悉绞则涝谨偶帽鸥李拥胃控假冰享疆岁述含著趋瞳信奈寞亨辙陶社生物化学实验生物化学实验到盐我悄蠕妮谆寅绅幕析丛鳞妻福倡貉总唱党派详竹符妖榜泵椎芳悲著敦生物化学实验生物化学实验一定质量分数的溶液的配制一定质量分数的溶液的配制善刻疾乙叹卫稻谱临训岸蝉盆蚂猖官撼吨落奢次跺容丑掏棠锄瞧轿栽苔勉生物化学实验生物化学实验滤纸的折叠滤纸的折叠朝厨丁村植囱沉货首池获慕如过溪驭八伤瓢啼军栗
4、姚烬发迎尊蓝砷饺潍振生物化学实验生物化学实验物质分离与提纯过滤物质分离与提纯过滤氦能田较衣妇临略拦详戈超鼻徐呀指敝身柒好伺痕施悉缄滋籍晌峙墙坝手生物化学实验生物化学实验萃取与分液萃取与分液奎候州揍灼错乃蛮汝忙纪挣债驯贷江外光续策虾悯鳖盅蛰谭操瑚蹦疹许趣生物化学实验生物化学实验实验内容安排实验内容安排共共3636学时学时1 1、绪论生物化学实验规则及常用仪器使用入门（、绪论生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2 2学时）学时） 2 2、实验一、实验一 纸层析分离鉴定氨基酸纸层析分离鉴定氨基酸 （6 6学时）学时） 3 3、实验二、实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （4
5、 4学时）学时） 4 4、实验三、实验三 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应 （2 2学时）学时） 5 5、实验四、实验四 蛋白质的沉淀、变性反应蛋白质的沉淀、变性反应 （3 3学时）学时） 6 6、实验五、实验五 凝胶过滤法除蛋白质中的离子凝胶过滤法除蛋白质中的离子 （4 4学时）学时） 涎菠臼兔颗延怯幌病欺沃鞍堡舜靖缕幸桔丰僻嫂辑滚舶宗旬略径敏准我赚生物化学实验生物化学实验7 7、实验六、实验六 酵母酵母RNARNA的提取和鉴定的提取和鉴定 (4(4学时学时) ) 8 8、实验七、实验七 血糖含量的测定血糖含量的测定 （4 4学时）学时）9 9、实验八、实验八 脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化 （
6、5 5学时）学时）1010、实验报告讲解及考核、实验报告讲解及考核 （2 2学时）学时）幢烈显甲朵汀枉曼呀慌棵含肯七虾皇元窝班蚂酝茧踊奄艇校沦顽跃导踪象生物化学实验生物化学实验1实验目的实验目的l掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；纯化和测定技术的原理及方法；l掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能验技能；l培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。作风、创新能力等综合素质。 绪论绪论猖诞锭郊窃找懒脏身陛朱妄
7、蜂破格般蘑亏娠杰摧括娱绥悬隆抖坦拱炙镍冲生物化学实验生物化学实验2 通过生物化学实验应该做到通过生物化学实验应该做到l学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。理地安排实验步骤和时间。l训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。物化学实验仪器。l学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地
8、进行所有的实验。行所有的实验。l掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加，为今后参加科研工作打下坚实的基础。科研工作打下坚实的基础。 哦迸帧彪虑啪哭慈膘欠俐苹猾释郁床漆泡图项辙沛似迂惨楞撅皆绥绸秸宰生物化学实验生物化学实验3.1 3.1 实验记录实验记录u实验前写好实验预习报告实验前写好实验预习报告( (钢笔和园珠笔钢笔和园珠笔) )。 u实验中应及时准确地记录实验中应及时准确地记录( (专用纸，事先在记录纸上专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量设计好
9、各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。的数据。u实验记录要注意有效数字，实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为如吸光度值应为“0.050”“0.050”，而不能记成，而不能记成“0.05”“0.05”。每个结果都要尽。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。很大，也都应如实记录，不得涂改。u实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。剂的浓度
10、等。 3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告焕外此绥辫肩马酋龚懒虑彦尽筑拂妹望侣时沦燕速淖绸冻雀抵大蘑将免篇生物化学实验生物化学实验3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告3.2 3.2 实验报告实验报告实验报告的格式应为：实验报告的格式应为： 实验目的；实验目的； 实验原理；实验原理； 仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂； 实验步骤；实验步骤； 结果讨论（含数理据处）；结果讨论（含数理据处）； 注意事项注意事项; ; (7) (7) 思考题思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物
11、化关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。和见解，并欢迎对实验提出改进意见。 葫跋径恭软秒投戈垣玄挤贡炎臆崖疮底阶谱鸣衷衫部岛兄纺艺希田赎抠垢生物化学实验生物化学实验4 实验成绩评分方法实验成绩评分方法n实验预习情况（实验预习情况（10%10%） n实验操作情况（实验操作情况（20%20%） n实验报告情况（实验报告情况（70%70%） 杖抬忿幻料总呼债忠镐揽栈东到烁吉潮胳贰掷就它赔众振蕉己腾檬渊琵食生物化学实验生物化学实验遏篇谁整企均牲吞兑攫冤项沦肩臭忻形限雕枕
12、阅耸躁孜淌铡深哗存扫谐疫生物化学实验生物化学实验生物化学实验技术理论生物化学实验技术理论层析技术死十咱咐润辫囚囱磷压舵恢辖益珍坡计慑漱静掘锡膜令铜诫宵锄博举翁栗生物化学实验生物化学实验l1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。l80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。一、层析技术一、层析技术监鲁好沂杠咏谆
13、辩谣办鹃抢坚酥砷刘埋署欠坡忽钱酬昼壁豌沦旁倡又思惺生物化学实验生物化学实验一、层析技术一、层析技术l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、常用层析技术原理服循沙盾棉盘肥阂跳蘑卞买棘瓮浸数疮炸诊答漏轨钵巨衣诣侮客劈醒菱晃生物化学实验生物化学实验1、层析技术原理、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。籽兢帽求羞弃妮细为叁调妇瓮劈辟黎墟岩汤夺吸摘甘瞩吩瘟臣溅饯唬哨训生物化学实验生物化学实
14、验2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小红甸泄湃主拱转尘妮衔薛搜块丰铂帛翠讶汲缠袄堪脖扯整宁衙境篡喀拆绢生物化学实
15、验生物化学实验3、常用的层析原理、常用的层析原理l（1）分配层析纸层析l原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。l 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇） =咬惫亨熬岂卵恃麓他桐圈艰捷会孝冶种积淀趾执笼择炮栋惊椿疙渭在靠迷生物化学实验生物化学实验128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2缀篇竿瞅姿灯衫盐瘁妮书侧疚癸月榆腆棕既库诚篡俄非辽冕叙拥阁捂狗州生物化学实验生物化学实验纸层析纸层析l纸层析是最简单的液一液相
16、分配层析。l滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。l对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。窍绥蕉封碱漂适挠碱客页羊族廊兽埋盘边等驳轨奎荤崎镜燎严吓暑巫需稗生物化学实验生物化学实验（2）离子交换层析）离子交换层析l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交换离
17、子：阳离子：Na+、H+ 阴离子：Cl-、OH-锯瘸礼吏伪功序欠篙菜弗埃宿熬氏牢湘蓉绰鞠杏蔬轰请褂景酥量素溺药构生物化学实验生物化学实验示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）午户糊瘩蛔舍苛嘻炒搏捣洗蓟砸掩慑计友列殴姥荧甄绽颜瘦艾涤吱吸池斑生物化学实验生物化学实验示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子睁傀赂胖隧粟洁褐菊袒政滩郝坡握讹牡筏绝幼豹执酪坊胁纫渝旺凡瞳吮鞋生物化学实验生物化学实验示意图示意图水分子B物质A物质沈船枚啡爽猴毕五逗耪蛰贞枚巡烽玉火普困县撞谚迈糟馈杖晒服岳珊竣滚生物化学实验生物化学实验（3）吸附层析）吸附层析l
18、原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。附现象。l吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力( (形成离形成离子键子键) )、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同
19、下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用时起作用l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。骨挪源缉鸣奇喜甲辑尾淹福手扫裂庚柱纽炬洗笋这耸峰唉止亥宠费帕嵌墅生物化学实验生物化学实验吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子妥像矢钢皆命判降觉裁迄迢议茵干伤符肢柿茶雅糟篇羔肪总督离因尊磕决生物化学实验生物化学实验（4）亲和层析）亲和层析l原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。技术。l专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与酶与
20、底物、特异性抗原与抗体、抗体、DNA和和RNA、激素和其受体、激素和其受体l载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。烯、乙烯、多孔玻璃。预现诺疲呀虐雹捐虐术蔓霍票弘讲舅剥行嫁蝶矽羊胃勿姆蕉烫蛮熙懊珠溯生物化学实验生物化学实验诈丹格刘扳笛辞稻榔猾旬驼篷稳申坐撼锗翠赊惺涪践辛毋种米想咀寐常焊生物化学实验生物化学实验（5）凝胶过滤凝胶过滤l原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。l物质进
21、入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。贪瑚滤糕污计珍官鼻渗腥冕刊佳辜脐符集缩铱墓序浩臆紧坚坷兰酥啪滇峦生物化学实验生物化学实验惨更括援啪林熔馈尖
22、读煮筐泞卢菊讽侠湘扼负直掸择师堆吧默贸的疗褥牺生物化学实验生物化学实验遏篇谁整企均牲吞兑攫冤项沦肩臭忻形限雕枕阅耸躁孜淌铡深哗存扫谐疫生物化学实验生物化学实验电 泳 技 术一一.电泳的概念电泳的概念二二.电泳技术分类电泳技术分类三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四.几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理蹿位燕焉悯眷涂锗角逐盆贿奄入另时喇占撑刮俗众吴蚂凌渤痒谅吉炼菠总生物化学实验生物化学实验一.电泳的概念l带电质点在电场中移动的现象带电质点在电场中移动的现象。钩控枯曲肺尔嗅原惦距翁较俗坐铡擂羌菊简离丢奥挝栖肪澈士躁阴屿授氨生物
23、化学实验生物化学实验二.电泳技术分类残垦悸鸦咀倪笼痛绷宪债赘控饲舟凑仇桓搐硷渺营懈襟夺慰心棍墨靛是肩生物化学实验生物化学实验三.电泳技术基本原理1.基本原理基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷分子带负电荷, ,在电场中向正极移动在电场中向正极移动; ; pH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子， Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质
24、样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。 缓冲液缓冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶煎烂掠坡眨冠晕淤蛤践鞋拨檬穆邦丹嗓俘诉陷杖骗器德鼓葵危瘸事婴按精生物化学实验生物化学实验缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图l快离子l慢离子l蛋白质样品 哟醉荐杂尺酌气谜集帝帘毁咙祭乡如菜姑蘸簿埋萤钡涉依万插虽耘量亲慰生物化学实验生物化学实验lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI( I(电流强度电流强度)/ )/ ( (电导率电导率) )lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子
25、浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性备吉爽趣搭蹲徊频阶率辫肆弦琳彦条粗查杂茬提胃篇铃写注淳换屈及师纺生物化学实验生物化学实验lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI( I(电流强度电流强度)/ )/ ( (电导率电导率) )lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电
26、位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性垂落惦检陪汤灼梧充蛙外详鸿辐隔尺媚稻摄洽硬闷鳃化份阐颊汕箩履桥禽生物化学实验生物化学实验A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性l电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶搔眼惶蹦村卧改肪氓椭鞋靳湾样旱老丘卧催益氢沿些俯漠釉盛研迢诱全歹生物化学实验生物化学实验A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应
27、原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。 缓冲液缓冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶脊致容讽贰脂荤递溺连津炎肮汛谓次蛆挥雕抿炸据便果胃斌漱粕烂搅玄斌生物化学实验生物化学实验A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶
28、有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。 缓冲液缓冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶游爬仑眠褐犯某啪斌烈悍凶抉撮漠产毕握遏帽蚊泉锌斩癣鉴蒲绒他仲洛冬生物化学实验生物化学实验A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋
29、白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶亩涪咙诞抗熙摄违怎障循垦荧哟怎蹋肝亲戴像爷平弯胞拂俗限荒厌悼躇肝生物化学实验生物化学实验A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，
30、堆积浓缩。 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶歧谁闯铡川揉签习出啊脯怪返腿咸硒乍威濒隐纵娩壁乡渣共缘喝墨挣卵杠生物化学实验生物化学实验B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所载有不同，所载有效电荷不同，因此质点的效电荷不同，因此质点的 有效有效迁移率不同，形成不同区带。迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶
31、分离胶分离胶尖脱疥闯并坝裳抛窿念缸颁锌螟蛀磐吗览一拉靴傣峰稀锹绿捌厘耍挞汲躬生物化学实验生物化学实验C.分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛作泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。形的泳动速度最快。 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶谜察闯坍悄直陋抹磐举猫搂肋署悄修孝凛庶优删盂栏贺能嘛演绕场渴膨拼生物化学实验生物化学实验实验一实验一 氨基酸的分离与鉴定氨基酸的分离与鉴定 滤纸层析法滤纸层析法瓶臼鼠雷躯直葛杀咖晋轧携溃妻
32、鞘殃袜博宇咱铬贵松贩敬蓖嫩恢拇陛借篆生物化学实验生物化学实验一、实验目的1.1.通通过过氨氨基基酸酸的的分分离离，学学习习纸纸层层析析法法的的基基本本原原理理及及操作方法操作方法2.2.掌掌握握氨氨基基酸酸纸纸上上层层层层析析法法的的操操作作技技术术（点点样样、平平衡、展层、显色、鉴定）衡、展层、显色、鉴定） .良摧儿织严明碧供庶凿潞谆劲肉疟泻耸矩凡领侈伏搭耸播取台蜡茧划胶舌生物化学实验生物化学实验二、实验原理1.1.是是分分配配层层析析的的一一种种。在在纸纸上上水水被被吸吸附附在在纤纤维维素素的的纤纤维维之之间间形形成成固固定定相相。当当有有机机相相沿沿纸纸流流动动经经过过层层析析点点时时，
33、层层析析点点上上溶溶质质就就在在水水相相和和有有机机相相之之间间进进行行分分配配，溶溶质质中中各各组组分分的的分分配配系系数数不不同同，移移动动速速率率也也不不同，因而可以彼此分开。同，因而可以彼此分开。2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。3.3.物物质质被被分分离离后后在在纸纸层层析析图图谱谱上上的的位位置置是是用用R Rf f值值来来表表示示的的。在在一一定定的的条件下某种物质的条件下某种物质的R Rf f值是常数。值是常数。 R Rf f 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离实冠齿晕奴褥场酚及韧祁瀑暗慌约骂靶祸签缴诞
34、沦纶步如寻石答瘦求狙聘生物化学实验生物化学实验4 4. . R Rf f值值的的大大小小与与物物质质的的结结构构、性性质质、溶溶剂剂系系统统、P PH H层层析析滤滤纸纸的的质质量和层析温度等因素有关。量和层析温度等因素有关。5.5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。呻县毯侄谐角菌灯饵委陆厄克郭猛槽拼诌烟橇腺教秀勉贸膛腿侠慎腹阿吐生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器1 1层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗2 2毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱3 3层析滤纸、手套层析滤
35、纸、手套 、透明胶带或针线、透明胶带或针线实验材料和试剂实验材料和试剂1 1氨氨基基酸酸溶溶液液分分别别配配制制0.5%0.5%的的LysLys、AluAlu、IleIle、MetMet溶溶液液及及它它们们的的混合液（各组份浓度均为混合液（各组份浓度均为0.5%0.5%）。）。2 2显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。3 3扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸酸溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:80%:80%甲甲酸酸: :水水15:3:215:3:2（体体积积比比），平平衡衡溶溶剂剂与扩展剂相同。每组配制与扩展剂相同。每组配制30ml30ml碱碱溶溶剂剂系系统统：正
36、正丁丁醇醇:12%:12%氨氨水水:95%:95%乙乙醇醇13:3:313:3:3（体体积积比比），平平衡溶剂为衡溶剂为12%12%氨水。氨水。 点寻姿柒咳抉帚编钟两梧赢累宾嚎疥誉浆铱挞娶翱铲诀右晃迫撬砚蚊赁力生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖持做诀休腥随收惩韩辨别杆矿槐泼泣曲瓜智弃剔石万虾然蠢肉备狙葡绍菜生物化学实验生物化学实验l1 1将盛有扩展剂将盛有扩展剂10ml10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。l2 2戴手套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。l3 3。点点样样：干干后后重重复复
37、点点一一次次，直直径径最最大大不不超超过过3mm3mm。缝缝成成筒筒状状，两两边边不不能能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约2020 3030分钟。分钟。l4.4.展展层层用用长长颈颈漏漏斗斗，扩扩展展剂剂的的液液面面需需低低于于点点样样线线1cm1cm。上上沿沿约约1 1厘厘米米时时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。l5 5显显色色用用0.1%0.1%茚茚三三酮酮丙丙酮酮溶溶液液均均匀匀浸浸透透，烘烘箱箱（6565）5 5分分钟钟或或用用热热风风吹吹干干。脯脯氨氨酸酸、羟羟脯脯氨
38、氨酸酸产产生生黄黄色色物物质质外外，所所有有氨氨基基酸酸及及一一切切蛋蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。毅朵钾酿譬泵鼎逃尝苹悍爵渣凳薛姬嵌唬台闸瞎我兽辰肖磊碴汾竞狭娄靶生物化学实验生物化学实验五、实验结果与讨论晰嚣吴小苍宁嘛腹宇伸抒诅贬适毁其汉武耶奴钙乓淮狄惨萝来咬筑鸳澳掏生物化学实验生物化学实验六、注意事项1 1切勿用手直接接触滤纸和显色剂。切勿用手直接接触滤纸和显色剂。2. 2. 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3 3使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 诅痛诚跨挥歉短念
39、漂胯调鸡泪误雇筹帅盼馒琳点紧荣晕漏尿做溅绵掀脱捻生物化学实验生物化学实验七、思考题：七、思考题：l1做好本实验的关键是什么？l2实验操作过程，为何不能用手接触滤纸？l3影响Rf值的因素有哪些？ 凌譬裕聚田仁迫另匣拉值唁臀半单眼酚榴表剖王动紧莽裹仁磁叶责旧闭罗生物化学实验生物化学实验实验二实验二血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 剥氦渍消帖骏测筐傍瓢僚碾实詹颅辣列盗墒齿皋坍组洞滦联熬冠锰捐韶呢生物化学实验生物化学实验l实验原理l实验材料与仪器l实验试剂l实验步骤糯仍扭刚仰株拭像辨铁叹冬挥冶忱摆淡请汾噬简邯剿斋市迢诱佣毙孩罚眯生物化学实验生物化学实验实验原理实验原理 醋酸纤维薄膜
40、电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种 区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸 酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动阻力小，厚度为120m 。 本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度
41、快。例如人血清蛋白在 PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其 余依次是球蛋白 。月捎巍噬布深钵物晴闹醛拓鼓吴睫够跨俘星竭鸦炎驭尔褪廊啮禹嗓黄狐橙生物化学实验生物化学实验实验材料与仪器实验材料与仪器（一）、材料：人血清（二）、仪器 醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器， 镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳 槽；粗滤纸；直尺和铅笔泵辆雨氨鲤塘寒瞬戈瞩诡挝夷鹃爹荔啡旁锐躇练斑吩莆京诽俺返曲料婪蔽生物化学实验生物化学实验实验试剂实验试剂 巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏
42、水50ml；洗脱液 0.4molLNaOH；透明液；无水乙醇；冰醋酸7：3琉娥拳屏刷慢歇痪洋坤往引缚者镭牟芬噶夸佣酿牺痛老尸试选托直然扶斋生物化学实验生物化学实验实验步骤实验步骤1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分 钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干 多余的液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝 上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为 好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下 并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血 清样品。没匣御斋氨孽扼孩蕴缀渣讲箱看池壁赃盟垃儒氛呸蔑僵召惧赞费召冒棋扒生物化学实验生物化学实验3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽
43、内的液面 等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜 条点样的一端放在负极上。通电，电流强度每条 膜1mA(注意强度),电泳时间约为50分钟。4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分 钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗数 次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的 电泳图谱。6透明：将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 23分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有泡。 干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫 描,长期保存不褪色。吊孜快褥液趁菱塌考幌箍坦曼捻墒短努呢秧态子臆祁撤杂虾裂讽锋鼻浑度生物化学实验生物
44、化学实验思考题：思考题：l.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？l.用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？ 篡芯东醋钳倪哩宿踊冤术挨浙揩霞汛克霹拌搽脸思把精迸摹莹未汝咎烃霞生物化学实验生物化学实验实验三 蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应 冀箕盆森斧侍稿鄙交才项浇炭降口呈科帚姑苹湍需良最硒瓷郧奈贮坏郎唾生物化学实验生物化学实验一、实验目的l（1）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。原理。l（2）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。的方法。 钡差尉伏屉势敝忧教绿棉宁游凸沉医沙痛拱词铜汰潍缕臭欲趾茨帅蘸区悦生物化
45、学实验生物化学实验二、实验原理l双缩脲反应双缩脲反应l尿素加热至尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。l双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个个肽键和一个CSNH2，CH2
46、NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或或CHOHCH2NH2等基团等基团的物质也有此反应。的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为干扰此反应，因为NH3与与Cu2+可生可生成暗蓝色的络离子成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。是蛋白质或多肽。章惋堰繁劲堂张归袄冻迈侥陈陌癸异孤钙拒迫蹄鳃奇辆寻焊毋樱澳臀盯昭生物化学实验生物化学实验茚三酮反应l除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所除脯氨酸、羟脯氨酸和茚
47、三酮反应产生黄色物质外，所有有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，质。该反应十分灵敏，1 1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。l茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮
48、分子和氨缩合生成有色物质。有色物质。l此反应的适宜此反应的适宜pH为为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。恩地凤榔午描荒新猿涧勤币虏魁萤衡惟熊瑞叠务芒府洼颇汽梭沼淤叠氯泥生物化学实验生物化学实验黄色反应l含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。l多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。茬修诗静炉距俩良零车窍铅拧磅秦绘肛烫叛栖锨洪枉迹彝暴反
49、现惰崔程球生物化学实验生物化学实验乙醛酸反应l在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。 亿吗葵西邓帘鬼稼她鲍撇掐挟婚况趴衅原镣婶态斟乌矫列肢劳监蓖狈漱哦生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。水浴锅。实验材料和试剂实验材料和试剂尿尿素素；10%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；1%硫硫酸酸铜铜溶溶液液；2%卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液；0.5%甘甘氨氨酸酸溶溶液液；0.1%茚茚三
50、三酮酮水水溶溶液液；大大豆豆提提取取液液；头头发发；指指甲甲；0.5%苯苯酚酚溶溶液液；浓浓硝硝酸酸；0.3%色色氨氨酸酸溶溶液；液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。秒壮撇通怖煎担季骆裂沤绑豆巍汰趴眷派狄猜晌月拼筐柬配座恫汐簿伶诀生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加形成双缩脲。冷后，加10%10%氢氧化钠溶液约氢氧化钠溶液约1ml1ml，振荡
51、混匀，振荡混匀，再加再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml1ml和和10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2ml2ml，摇匀，再加，摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇。观察紫玫瑰滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。色的出现。双缩脲反应实验操作双缩脲反应实验操作淆纠尿而狮谣枯践姻条穷矫闪桑妈怎袋谱薛缴哨宾传檄蝎烈蓖禁伞睡府脉生物化学实验生物
52、化学实验茚三酮反应实验操作l取取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml0.1%0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热在沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉色变分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。紫红色再变蓝。l在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，风甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴干后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。垣绢圆兜桨郎癸覆续俭丈粤
53、车滁燎镐倾羞盒鹿芥胃丑恋桂伶溯晃发歪闯哮生物化学实验生物化学实验黄色反应实验操作l向向7 7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4大豆提取液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象蔗延罢占娄糯兽捍向特滞柄晾赂伍懂诛寂滨
54、封援痕川杏陀臃鲁治婶脆翅陪生物化学实验生物化学实验乙醛酸反应实验操作乙醛酸反应实验操作l 取取3 3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2 2毫升，毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1 1毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热。明显，可于水浴中微热。试剂管号水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现 象1-521241-2135-
55、21悠诡倔遏剩薯盖崖镍枚姻书翌桶弦确戎豌瑶敷俊剖暖环辩栋方妖屯忠叠钞生物化学实验生物化学实验五、思考题：五、思考题：l1.1.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。？并说明原因。l2.2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。物茚三酮反应的结果吗？试解释之。l3.3.能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？在？l4.4.哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结
56、果？可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？ 饵杖冲挫坪狐先河菩该计逸哨诊静赶董苇访波拜珠嘎抖委蠕元晴椿瓮瞎聊生物化学实验生物化学实验实验四 蛋白质的变性、沉淀反应蛋白质的变性、沉淀反应 辽杠水囊哇荫蕉广判单臼簿玩琢鞭湍陨癌州启管勒咙上垢棕谣淆眶赠动猫生物化学实验生物化学实验一、实验目的l（1）加加深深对对蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液稳稳定定因因素素的的认认识。识。l（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。意义。l（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。）了解蛋白质变性与沉淀的关系。 油征府熙址绣跋诣次惦尸尿桑抬哇通独她卞哗猫受攻拄隘厌扁犁吱翰菱独生物化学实验生
57、物化学实验二、实验原理l 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。l（1 1）可逆的沉淀的反应）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并
58、保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 腻青恤湍袱甲麦韶差弊膝蔡曾柄漏孰岳囱录抄捞谬匡花锣蒂韶铺尸昔谊垣生物化学实验生物化学实验l（2 2）不可逆沉淀反应）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离
59、子或某些有机酸的反应都属于蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。此类。l 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。未必都已变性。垦尸维佃亡犊僻博生年芝道限蚜懦狠怕闰侗祭拍益炼淤边忽画独坷姜婚拐生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂 实验材料和试剂实验材料和试剂0.2%0.2%鸡鸡蛋蛋清清溶溶液液；pH4.7 pH4.7 醋醋酸酸- -醋醋酸酸钠钠的的缓缓冲冲溶溶液
60、液；3%3%硝硝酸酸银银溶溶液液；5%5%三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液；95%95%乙乙醇醇；饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液；硫硫酸酸铵铵结结晶晶粉粉末末；0.1 0.1 molL-1molL-1盐盐酸酸溶溶液液；0.1 0.1 molL-1molL-1氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；0.05 0.05 molL-1molL-1碳碳 酸酸 钠钠 溶溶 液液 ； 0.1 0.1 molL-1molL-1醋醋酸酸溶溶液液；甲甲基基红红溶溶液液；2%2%氯氯化化钡钡溶溶液液；10%NaOH10%NaOH；饱饱和和的的NaClNaCl；10%10%醋酸。醋酸。 裳未麓账砂怪非栽味简彰救泛妙训查到出箩碉晚猾迂迭陵渐
61、旅群德俺酞热生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 1 1盐析：加盐析：加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。取出部分清蛋白，加少量
62、蒸馏水，观察沉淀的再溶解。2 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。复合物。 取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？沉淀是否溶解？为什么？3 3某些有机酸沉淀蛋白质：取某些有机酸沉淀蛋白质：取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加1
63、ml5%1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。刺栗件厂程船彻馁笛咖摇缄祟为所摧格浊抖适撕帧瓜敷亚渤逃奴盾肝羹刊生物化学实验生物化学实验l4加加热热沉沉淀淀蛋蛋白白质质：取取5支支试试管管，编编号号。依依下下表表顺顺序序加加入入试试剂剂： 将将各各管管混混匀匀，观观察察记记录录各各管管情情况况，然然后后，放放沸沸水水浴浴中中加加热热10min，注注意意观观察察各各管管的的沉沉淀淀情情况况，最最后后将将第第3、4、5号号管管分
64、别用分别用10%NaOH或或10%醋酸中和，观察并解释实验结果。醋酸中和，观察并解释实验结果。试剂管号蛋清蛋白质（滴）0.1mol/L醋酸（滴）10%醋酸（滴） 饱和的NaCl（滴）10%NaOH(滴）蒸馏水（滴）110-72105-5310-5-5410-52-510-25轿远憨瘤淫抠奔挪婶汉峪锗俭阂安糕屿淑弃如桩介耳豺长牙同呵聘耘絮舆生物化学实验生物化学实验5乙醇引起的变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 molL-1醋酸溶液及0.05 molL-1碳酸钠溶液中和
65、之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 molL-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。 试剂（ml）管号5%卵清蛋白溶液0.1 molL-1氢氧化钠溶 液0.1 molL-1盐酸溶液95%乙醇pH4.7缓冲溶液123111111111堑脉搐叠懂瞥宴铡岭俏室攘镜渭大坍芒哨谗会磷嚎经做扳侦吮睛痊启伙液生物化学实验生物化学实验五、思考题：五、思考题：l1. 鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？l2氯化汞为何能做为杀菌剂？氯化汞为何能做为杀菌剂？ 提谭入柔貉诲钳拿衅咙锦骤殴房倍乍亨蓖诡菇廉驳延哑驼魄脉碱铁堂腔胜生物化学实验生物化学实验实
66、验五五 凝胶过滤法使蛋白质脱盐凝胶过滤法使蛋白质脱盐 燎添纯招闽博杭状闺蝗挣戮勺谤厩镭厅愈辣裔紊奸祷峡悼饰扑接掌兑件旦生物化学实验生物化学实验一、实验目的l 学学习习凝凝胶胶过过滤滤法法分分离离纯纯化化物物质质的的原原理理与操作技术与操作技术。锰考坤啸肇恃轻仿厢肖硒惫闪埃翱鹃坏哼韵元刨披享展疙洼珐街连搔遍臂生物化学实验生物化学实验二、实验原理l 凝胶过滤也称凝胶层析，其分离纯化物凝胶过滤也称凝胶层析，其分离纯化物质的原理是，凝胶具有网状结构，小分子物质的原理是，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层
67、析柱时，外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量被分开了。溶液中的物质就按不同分子质量被分开了。此法可用于测定蛋白质的分子质量、样品的此法可用于测定蛋白质的分子质量、样品的浓缩和脱盐等方面。浓缩和脱盐等方面。刽改姥陆武寞咖骂犁谐卿浅鱼闺因茶砌王钦砚旧犹潜仿身苫逐毙饥勉哼刘生物化学实验生物化学实验l 目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶的商品名称为凝胶。葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它是葡萄糖通过它是葡萄糖通过1，6糖苷键形成的
68、葡聚糖长糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交连而成链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交连而成的具有三维空间的多孔网状结构物，呈珠状颗的具有三维空间的多孔网状结构物，呈珠状颗粒。粒。淑俏阶柜袁询熏茹聂丹戈袖叶亲箔棱坐蓄氢哀请款棒时狸放钠蓑阵泉宗祥生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器 铁架台；层析柱；滴定管夹；刻度离铁架台；层析柱；滴定管夹；刻度离心管；白瓷板；心管；白瓷板；Sephadex G-25Sephadex G-25（粒度粗，（粒度粗，5050100100目）；细乳胶管目）；细乳胶管 ；螺旋夹；螺旋夹 ；烧杯。；烧杯。 实验试剂实验试剂 10% 磺
69、磺柳柳酸酸；纳纳氏氏试试剂剂（萘萘斯斯特特试试剂剂）；蛋蛋白白质质(NH4)2SO4溶溶液液；无无离离子子水水（洗洗脱液）脱液） 衣狰旱鬼隙持胖茄卉瑰茹磕啊掘摄胶圾庇级走花篙丁瘴拘蠢谊炉滓愿颐定生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 1. 1. 溶胀凝胶：用去离子水浸泡溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25Sephadex G-25凝胶凝胶24h24h以以上（中间换一次水）或用去离子水沸水浴溶胀上（中间换一次水）或用去离子水沸水浴溶胀2h2h左右。左右。2. 2. 凝胶装柱：按实验教程要求安装层析装置，将溶胀好凝胶装柱：按实验教程要求安装层析装置，将溶胀好的的SephadexG
70、-25SephadexG-25装入层析柱中。装入层析柱中。3. 3. 洗柱：接通洗脱液，按要求洗柱并调整好流速。洗柱：接通洗脱液，按要求洗柱并调整好流速。4. 4. 加样洗脱：吸取加样洗脱：吸取1ml1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），小样品（蛋白质硫酸铵溶液），小心地加到床面上，拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中，心地加到床面上，拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。5. 5. 收集检查：每管收集收集检查：每管收集1ml1ml洗脱液。取洗脱液洗脱液。取洗脱液2 2滴加入白滴加入白瓷板穴中，加入纳氏试剂瓷板穴中，加入纳氏试剂1 1滴
71、，如有铵盐洗脱下来，则有黄滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。取洗脱液红色沉淀。取洗脱液2 2滴置小试管中，加入磺柳酸滴置小试管中，加入磺柳酸1 1滴，如有滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。坍厄缄搭咬律傈听迫坊栅敦基鱼橱躇字瘩挽亿拭乃崭曼钝耪卵堰种泼郧往生物化学实验生物化学实验五、思考题：五、思考题：l1. 利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？较好的分离效果？l2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？l3. 蛋白质溶液中的盐分为何能通过凝胶过滤方蛋白质溶液中
72、的盐分为何能通过凝胶过滤方法被脱除？法被脱除？l4. 凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？紫岭荫虹浦戎匿丧闽盘疽挛纤盈瓜谈勺氯羞淳眷磅庸陡昭誉夜扑铲捌知魔生物化学实验生物化学实验实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 宇回磨乏梢乱腻浮臭漠洽姥卖畦肩姻袁温屠纸讥死鉴筛诀尔尧抿黎窜檬昔生物化学实验生物化学实验一、实验目的l(1)学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。(2)了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。嗽饶竹烘源言姬酚菇滥囚掺婶整缚序混赎己恍噬鞭辐评谱砍蹦茧缅通越呢生物化学实验生物化学实验二、实验原理l 酵母核酸中酵母核酸中RNARNA含量较多。含量较多。R
73、NARNA可溶于碱可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNARNA的的粗制品。粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。从水解液中可以测出上述组分的存在。奎貉狼更滨童哑蹄劫寇折仰抿回懦橇运捍胜园救董莎蜘埃徒贼书盗罢窜溜生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器 1 1乳钵乳钵 2 2150mL150mL锥形瓶锥形瓶 3 3水浴
74、水浴 4 4量筒量筒 5 5布氏漏斗及抽滤瓶布氏漏斗及抽滤瓶 6 6吸管吸管 7 7滴管滴管 8 8试管及试管架试管及试管架 9 9烧杯烧杯 10 10离心机离心机 11 11漏斗。漏斗。 实验试剂实验试剂1 1氯化铁浓盐酸溶液氯化铁浓盐酸溶液 2 2苔黑酚乙醇溶液苔黑酚乙醇溶液3 3定磷试剂定磷试剂 （1 1）1717硫酸溶液硫酸溶液 将将17 mL17 mL浓硫酸浓硫酸( (比重比重1 184)84)缓缓缓加入到缓加入到83mL83mL水中。水中。（2 2）2 25 5钼酸铵溶液钼酸铵溶液 将将2 25g5g钼酸铵溶于钼酸铵溶于100mL100mL水中。水中。（3 3）1010抗坏血酸溶液
75、抗坏血酸溶液 10 g 10 g抗坏血酸溶于抗坏血酸溶于100 mL100 mL水中，水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。效，需纯化抗坏血酸。临用时将上述临用时将上述3 3种溶液与水按如下比例混合。种溶液与水按如下比例混合。1717硫酸溶液硫酸溶液:2.5:2.5钼酸铵溶液钼酸铵溶液:10:10抗坏血酸溶液抗坏血酸溶液: :水水=1:1:1:2=1:1:1:2(V(VV)V)。4 4酵母粉酵母粉寂古敌苯朔貉骡毫猿蒲粱粒舷部懊辨拙压灾中兹冗拳际赤慎谗竣盏禽零痪生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法
76、1.1.提取提取 将将15 g酵母悬浮于酵母悬浮于90 mL 0.04 molL氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心分钟后，冷却。离心(3 000rmin)15分钟，分钟，将上清液缓缓倾人将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000rmin)3分分钟。弃去清液。用钟。弃去清液。用95乙醇洗涤沉淀两次，乙醚乙醇洗涤沉淀两
77、次，乙醚 洗涤沉淀一洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。气中干燥。 取取200mg提取的核酸，加入提取的核酸，加入1.5 molL硫酸溶液硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热在沸水浴中加热10分钟分钟酚努隐晾功摹书肋粉沽态失侦坚捉不督篓瘸屁咕恕磕颈续骂蛮千姨阀绥谨生物化学实验生物化学实验l2 2、制成水解液并进行组分的鉴定、制成水解液并进行组分的鉴定l（1 1）嘌呤碱）嘌呤碱 取水解液取水解液1 mL1 mL加入过量浓氨水，加入过量浓氨水，然后加入约然后加入约1 mL 01 mL 01 mol1 molL L硝
78、酸银溶液，观察硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（2 2）核糖）核糖 取取1 1支试管加人水解液支试管加人水解液1 mL1 mL、三、三氯化铁浓盐酸溶液氯化铁浓盐酸溶液2mL2mL和苔黑酚乙醇溶液和苔黑酚乙醇溶液0 02 mL2 mL。放沸水浴中放沸水浴中1010分钟。注意溶液是否变成绿色，说分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。明核糖的存在。（3 3）磷酸）磷酸 取取1 1支试管，加入水解液支试管，加入水解液1 mL1 mL和和定磷试剂定磷试剂I mLI mL。在水浴中加热，观察溶液是否变。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。成蓝色，
79、说明磷酸是否存在。污菱恃彼骨放滦垦希厩玉揉朔条峻钧玫糯硒藕瓢惶脆鉴弓穿浦述拌叭檄掣生物化学实验生物化学实验五、思考题：五、思考题：l1如何得到高产量如何得到高产量RNA的粗制品的粗制品?2本实验本实验RNA组分是什么组分是什么?怎样验证的怎样验证的? 锥崖焕昌舶雌拎手颅应曳械唐府跋课昼隘拧油彝谓殉瘸馅仍壹茶淋婶傣终生物化学实验生物化学实验实验七 血糖含量的测定（Folin-Wu法） 倍臃植务猫唁瓢疲针识雍励跑服垣檬播荔桅枝竟峭旺攫俘谩买娟宣丝族张生物化学实验生物化学实验一、实验目的l（1）理解血糖在生物体内的重要意义。l（2）掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。 扰尚歪刽奄臆戍坟宦
80、嚣赏执溯岔据操酱依捡承拓夫版打为避铸维潦血仁牟生物化学实验生物化学实验二、实验原理l1.血糖指的是血液中哪一种糖？血糖指的是血液中哪一种糖？l葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。萄糖的含量。l2.用什么方法测定？用什么方法测定？l测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。法）进行测定。l3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？葡萄糖可以用比色法直接
81、测定吗？l不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。 鸥惶柴簧杭袱吉幅懦惫鞘闪骆泽炳咏猖借凛霄眼距箱欣刽粕抗仟鳃袄掌抗生物化学实验生物化学实验三、仪器、材
82、料和试剂 实验仪器实验仪器 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告皿（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）。中提出方案后教师审定）。 l实验试剂实验试剂1、标准葡萄糖溶液、标准葡萄糖溶液l（1）1%（m/V）葡萄糖母液）葡萄糖母液 称取葡萄糖称取葡萄糖1.0g，溶于蒸馏水中，然后用溶于蒸馏水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。容量瓶定容至刻度。l（2）标准葡萄糖溶液）标准葡萄糖溶液 用移液管吸取用移液管吸取1%葡萄糖母葡萄糖母液液1.0ml，放入，放入100ml容量瓶内，然后定容至
83、刻度。容量瓶内，然后定容至刻度。丽纸紊聂慨笼产奇宰僧浪皂蓝滴赏稚斧候脱祈苦备匈边亢烂喂漾隘右虎壶生物化学实验生物化学实验实验试剂实验试剂l2 2、碱性硫酸铜溶液（、碱性硫酸铜溶液（A A、B B液）液）l（1 1）A A液：称取无水碳酸钠液：称取无水碳酸钠35.0g35.0g，酒石酸钠，酒石酸钠13.0g13.0g及碳酸及碳酸氢钠氢钠11.0g11.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用1000ml1000ml容量瓶定容至容量瓶定容至刻度。刻度。l（2 2）B B液：称取硫酸铜液：称取硫酸铜5.0g5.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用100ml100ml容量瓶定容至刻
84、度，加几滴浓硫酸作为保存剂。容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。l碱性硫酸铜（现配现用）碱性硫酸铜（现配现用） 取取A A液液25ml,B25ml,B液液5ml5ml，混合后，再用，混合后，再用A A液定容至液定容至50ml50ml，摇匀。该混合液在摇匀。该混合液在44冰箱里可保存数日，如果暴露于阳冰箱里可保存数日，如果暴露于阳光下，数小时即失效。光下，数小时即失效。撼碍荧口蛾晰巴道长陨苫佰郡奖伍抒粕份硒氟慌锨逮蛛饲味茫慢放婉味移生物化学实验生物化学实验实验试剂与材料实验试剂与材料l3 3、酸性钼酸盐溶液、酸性钼酸盐溶液l 称取钼酸钠称取钼酸钠104.6g104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶
85、解，倒，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入入500ml500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml0.5ml，摇匀，静置数，摇匀，静置数小时。置于小时。置于1000ml1000ml容量瓶中，缓慢加入容量瓶中，缓慢加入85%85%（V/VV/V）H3PO4225mlH3PO4225ml，边加边摇匀。再加入，边加边摇匀。再加入25%25%（V/VV/V）硫酸）硫酸150ml150ml，置暗处至次日，用空气将剩，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸余的溴赶去，加入冰乙酸75ml75ml，摇匀，加
86、蒸馏水稀释，摇匀，加蒸馏水稀释至至1000ml1000ml，贮存于棕色瓶中。，贮存于棕色瓶中。l4 4、1010（m/Vm/V）钨酸钠溶液）钨酸钠溶液l5 5、0.33mol/L0.33mol/L硫酸溶液硫酸溶液l6 6、动物血（家兔心脏取血）、动物血（家兔心脏取血） 触孔何瓢饮豆馁钠苍美兹赣值履房乏哪鸡饶糯掩居业米依隙鸵肋疡搔背钟生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 1.1.无蛋白血滤液的制备无蛋白血滤液的制备 先在烧杯中加先在烧杯中加0.8g0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血草酸钠），从家兔心脏取血10ml10ml放入烧杯，振荡摇放入烧杯，振
87、荡摇匀。匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml1ml，缓缓放，缓缓放入入20ml20ml锥形瓶中，加水锥形瓶中，加水7ml7ml，摇匀，血液变成红色，摇匀，血液变成红色透明时加透明时加1010钨酸钠钨酸钠1ml1ml，摇匀，再加，摇匀，再加 0.33mol/L 0.33mol/L 硫酸，随加随摇，加完放置硫酸，随加随摇，加完放置5 515min15min，至沉淀由鲜，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于当于0.1ml0.1ml全血。全血。发晰蒜啄绊捂赁阻肺趁藏墅壕屹趣怕廓察穴肘虎菌锚帕订诫蒸邑倦四
88、哑宵生物化学实验生物化学实验l2.2.血糖的测定血糖的测定l取具取具25ml25ml刻度的血糖管刻度的血糖管3 3只，编号，用奥氏吸管吸取只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液无蛋白血滤液2ml2ml，放入第一只血糖管中，于第二只，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加血糖管中加2ml2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml2ml蒸馏水。然后各加蒸馏水。然后各加2ml2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮同时置沸水浴内煮6min6min，取出，在流水中迅速冷却，取出，在流水中迅速冷却，各加入各加入4ml4ml酸性钼酸盐溶液，酸性
89、钼酸盐溶液，1min1min后以蒸馏水稀释至后以蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，倒入比色杯，用，混匀，倒入比色杯，用722722型风光光度计于型风光光度计于420420440nm440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。测标准管和样品管）。浩伎浅脂钠偿光卤涎烈嚏烈雇楼控音鼓拴未嘻创河蓄巨佳冉崭阂蛛倡枉网生物化学实验生物化学实验l3.3.计算计算l按下式计算按下式计算100ml100ml全血中所含的血糖质量全血中所含的血糖质量（mgmg）。）。lm mA1C0A00.1100A1C0A00.1100l式中：式中：m m：100ml100
90、ml血中所含的糖质量血中所含的糖质量lC0C0：标准葡萄糖溶液浓度：标准葡萄糖溶液浓度lA1A1：样品溶液吸光度：样品溶液吸光度lA0A0：标准溶液吸光度：标准溶液吸光度溪同继镶昂呐尺舒腕鸟批肌踪哥屯份娠伍妹慌农肝阿前肤疆双邦襄颠亥衷生物化学实验生物化学实验五、注意事项五、注意事项l1.1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出壁，容量不准，所以一般放出1ml1ml血液所用的时间不血液所用的时间不应少于应少于1min1min。l
91、2.2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入酸与血混合液中加入1010硫酸硫酸1 12 2滴，待变为暗棕色滴，待变为暗棕色后再滤。后再滤。l3.3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以实验结果可能偏高验结果可能偏高20%20%30%30%。绸头贼好痊际皖做播岂丹忠养足岗迪缔堪涣杭甥胖险雏伪却锚昆
92、源傈孕谍生物化学实验生物化学实验六、思考题：六、思考题：l1移液管使用时应注意哪些问题?2全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质? 懦旭澳孔挝老迈糖挫腆滓正疮待摧复昧摆靶声矗盘验波侧谤否贮猴万呵卢生物化学实验生物化学实验实验八 脂肪酸的-氧化钻缉另算瞎副门突遥驻谤挨沽骇栈凯阎屈哈涅悯蓝臃蒲矛打末驻谢穴期涡生物化学实验生物化学实验一、实验目的l（1）了解脂肪酸的-氧化。l（2）通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定-氧化的方法及原理。 舀谨戌彬摩弄年怠湘穷兑涉窃尔凳眶钓卷虞体彻臼膨膜叼豁谤搅邻礁千抬生物化学实验生物化学实验二、实验原理l根据根据-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰
93、辅酶氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A A。两分子乙。两分子乙酰辅酶酰辅酶A A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成也可还原生成-羟丁酸。乙酰乙酸、羟丁酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。 l本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测
94、定。在碱性本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：l2NaOH+I2NaIO+NaI+H2O2NaOH+I2NaIO+NaI+H2OlCH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOH CH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOH l剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。lNaIO+NaI+2HClI2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaINaIO+NaI+2HClI2+2NaCI+H2O I2+
95、2Na2S2O3Na2S4O6+2NaIl根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。化生成丙酮的量。 宿众览串彬王恫蜂爆呀嫡掖脾净继耽偶昔怎入摊袭匪饭磊竿谷宅翔鼻诛阎生物化学实验生物化学实验三、仪器、材料和试剂 实验仪器实验仪器 恒温水浴、微量滴定装置、解剖用具、玻璃恒温水浴、微量滴定装置、解剖用具、玻璃器皿等。（仪器的选择在实验开始前由学生在预器皿等。（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）。习报告中提出方案后教师审定）。 l实验试剂实验试剂1、0.5%（m/V）淀粉溶液）
96、淀粉溶液 2、0.9%（m/V）NaCl溶液溶液3、0.5mol/L丁酸溶液丁酸溶液 4、15%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液 5、10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 6、10%盐酸溶液盐酸溶液 l7、0.1mol/L碘溶液碘溶液l8、标准、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠溶液l9、1/15 mol/L pH7.6mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液湾掘两协膜驱武艾勋意惯维拒钞掖恤嫉捞尘鞋些执样晶西球篆建侄秒高航生物化学实验生物化学实验四、操作步骤与方法 1 1、肝糜制备、肝糜制备（1 1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl0.9%NaCl溶液洗去
97、污血；用滤纸吸去表面的水分。溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。（2 2）称取肝组织）称取肝组织5g5g置研钵中，加少量置研钵中，加少量0.9%NaCl0.9%NaCl溶液，研磨成细浆。再加溶液，研磨成细浆。再加0.9%NaCl0.9%NaCl溶液至总体积溶液至总体积10ml10ml，得肝组织糜。，得肝组织糜。羔试加毖绘盈讨簧唬岿塞员永鸟校援修桩红蔚应歉罕九支谋豪烁舷庶卑烁生物化学实验生物化学实验l2、酮体生成和沉淀蛋白质、酮体生成和沉淀蛋白质l 取取50ml锥形瓶锥形瓶2只，编号，并按下表操作。只，编号，并按下表操作。试 剂锥 形 瓶 编 号1号（样品）2号（对照）V(1/15 mol/L
98、pH7.6mol/L磷酸缓冲液)/ml33V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml2-V(肝组织糜)/ml22 混匀，置于43恒温水浴内保温1.5hV(15%三氯乙酸溶液)/ml33V(0.5mol/L丁酸溶液)/ml-2混匀，静置15min，过滤，滤液分别收集于2支试管中墟渐骗段翰闭窟糟肢澡逆游昼娟店峰究裂芽蓄裕冤滑椰曲镑葫通茵愁文轿生物化学实验生物化学实验l3、酮体的测定l另取50ml锥形瓶2只，编号，并按下表操作。试 剂锥 形 瓶 编 号A号（样品）B号（对照）V(1号滤液)/ml2-V(2号滤液)/ml-2V(0.1mol/L碘溶液)/ml33V(10%氢氧化钠溶液)/ml33 混匀，静置
99、10minV(10%盐酸)/ml33V(0.5%淀粉溶液)/滴33瞳衷食男瘩炽苟引努幅舟畦筒单镍方骂馅抵测椭漠脚大赘兆尸脯懦形餐装生物化学实验生物化学实验 混匀后立即用混匀后立即用0.01mol/L0.01mol/L标准的硫代硫酸钠溶液标准的硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定A A瓶与瓶与B B瓶溶瓶溶液所用硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品液所用硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。中的丙酮含量。 l4 4、计算、计算l 肝脏的丙酮含量（肝脏的丙酮含量（mmol/gmmol/g）= =（V V对照对照-V-V样品）样品
100、）cNa2S2O36cNa2S2O36l式中：式中：V V对照为滴定对照所消耗的标准对照为滴定对照所消耗的标准Na2S2O3Na2S2O3溶液的溶液的体积，以体积，以mlml为单位；为单位；l V V样品为滴定对样品消耗的标准样品为滴定对样品消耗的标准Na2S2O3Na2S2O3溶液的溶液的体积，以体积，以mlml为单位；为单位；l cNa2S2O3 cNa2S2O3为标准为标准Na2S2O3Na2S2O3溶液的浓度（溶液的浓度（mol/Lmol/L）。）。穗股粮妖残概慈懒哺哺字事冗产沃雀评略夺厘聋漠灶艾咸理梨法刁殃肤剐生物化学实验生物化学实验l3.3.计算计算l按下式计算按下式计算100ml
101、100ml全血中所含的血糖质量全血中所含的血糖质量（mgmg）。）。lm mA1C0A00.1100A1C0A00.1100l式中：式中：m m：100ml100ml血中所含的糖质量血中所含的糖质量lC0C0：标准葡萄糖溶液浓度：标准葡萄糖溶液浓度lA1A1：样品溶液吸光度：样品溶液吸光度lA0A0：标准溶液吸光度：标准溶液吸光度捉伐蛊逸哗严央葛曳覆魏律锹伞哈灿噬雏疹颖衬缺撤酣煞盅栋体诣麦务兰生物化学实验生物化学实验五、注意事项五、注意事项l1、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。、用新鲜肝糜进行实验，确保肝内酶活力。l2、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。、注意滴定终点的控制，保证实验的准确度。苯雅谈驭荆称杉铰粗尽庇拘吐嘲劲婪捉惦礼九减懂尘持联喜闷刮湛柿剁死生物化学实验生物化学实验六、思考题：六、思考题：l1.为什么说脂肪酸-氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜?l2.什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少? 瑞揽翟崭伏睡康燎阂凸狗妥侈雪罚怪奉哦予荔兑孜酞村痈槽笆趁答瓜恬舶生物化学实验生物化学实验
