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1、兽用疫苗生产兽用疫苗生产 一、一、兽用生物制品分类兽用生物制品分类 二、兽用疫苗的制备技术二、兽用疫苗的制备技术 三、三、兽用诊断试剂的制备技术兽用诊断试剂的制备技术 四、兽用生物制品检测技术四、兽用生物制品检测技术 一、兽用生物制品分类一、兽用生物制品分类 兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（细菌、兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（细菌、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代谢产物、寄生虫、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代谢产物、寄生虫、动物血液或组织等为原材料，采用生物学、分子生物学或动物血液或组织等为原材料，采用生物学、分子生物学或生物化学等相应技术制成的生物制剂，用于预防、
2、治疗或生物化学等相应技术制成的生物制剂，用于预防、治疗或诊断畜禽疫病。诊断畜禽疫病。 1 1、按照性质和制造方法、按照性质和制造方法 疫（菌）苗、类毒素、抗血疫（菌）苗、类毒素、抗血清、诊断制剂和微生态制剂等。清、诊断制剂和微生态制剂等。 2 2、按照作用与用途、按照作用与用途 预防、诊断和治疗用生物制品。预防、诊断和治疗用生物制品。 （一）预防用兽用生物制品（一）预防用兽用生物制品 将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培养，将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培养，收获其抗原单位或亚单位，或用人工合成的抗原单位或亚收获其抗原单位或亚单位，或用人工合成的抗原单位或亚单位制备而成的活的或
3、灭活的、具有特异性和免疫原性的单位制备而成的活的或灭活的、具有特异性和免疫原性的生物制品，用于预防靶动物的疾病。生物制品，用于预防靶动物的疾病。 预防用兽用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重组预防用兽用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重组亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫苗和核酸（苗和核酸（DNADNA）疫苗。）疫苗。 1 1、灭活疫苗、灭活疫苗( (死疫苗死疫苗) ) 1)1)强毒强毒( (菌菌) )或弱毒（菌）或弱毒（菌）培养培养灭活或灭活或加热加热纯化或浓缩纯化或浓缩佐剂或防腐剂。佐剂或防腐剂。 2)2)灭活的毒素或提取的
4、亚单位或灭活的毒素或提取的亚单位或rDNArDNA产生产生亚单位。亚单位。 灭活疫苗稳定、安全，便于运输和保存，灭活疫苗稳定、安全，便于运输和保存，易于提纯纯化和制备多价、多联苗。易于提纯纯化和制备多价、多联苗。但用量较但用量较大、接种次数多、免疫力产生慢、注射困难、大、接种次数多、免疫力产生慢、注射困难、注射局部可能有反应等。注射局部可能有反应等。 2 2、活疫苗、活疫苗( (弱毒疫苗弱毒疫苗) ) 1 1）致弱的弱毒（菌、虫）株）致弱的弱毒（菌、虫）株 动物、组织、动物、组织、细胞、鸡胚或培养基细胞、鸡胚或培养基培养培养降低毒力、保留降低毒力、保留免疫原性免疫原性筛选。筛选。 2 2）自然
5、弱（无）毒（菌、虫）株。）自然弱（无）毒（菌、虫）株。 3 3）异种毒（菌、虫）株。）异种毒（菌、虫）株。 4 4）基因工程改造弱毒株。）基因工程改造弱毒株。 活疫苗对原宿主动物无致病性或引起亚临床活疫苗对原宿主动物无致病性或引起亚临床感染，能产生主动免疫力，用量少、成本低、免感染，能产生主动免疫力，用量少、成本低、免疫力产生快、免疫期长。但可能存在不安全风险。疫力产生快、免疫期长。但可能存在不安全风险。3 3、重组亚单位疫苗、重组亚单位疫苗 1 1）微生物）微生物物理和化学方法物理和化学方法提取有效抗原成分。提取有效抗原成分。 2 2）病原病原基因工程技术基因工程技术保护保护性抗原基因序列性
6、抗原基因序列插入合适的表达质插入合适的表达质粒粒高效稳定表达高效稳定表达生产抗原生产抗原亚亚单位疫苗。单位疫苗。4 4、合成肽疫苗、合成肽疫苗用化学方法人工合成多肽作为抗用化学方法人工合成多肽作为抗原。纯度高、稳定，但只能线性原。纯度高、稳定，但只能线性表达，不能折叠，免疫原性较差。表达，不能折叠，免疫原性较差。5 5、基因缺失疫苗、基因缺失疫苗 病原体病原体基因工程方法基因工程方法缺失致缺失致病性基因或非必要糖蛋白病性基因或非必要糖蛋白保持免疫保持免疫原性原性降低致病性。疫苗毒力不易恢降低致病性。疫苗毒力不易恢复，稳定性好，可配合鉴别诊断方法，复，稳定性好，可配合鉴别诊断方法，区别免疫动物和
7、自然感染动物。区别免疫动物和自然感染动物。6 6、重组活载体疫苗、重组活载体疫苗病原保护性抗原基因序列病原保护性抗原基因序列插入另一插入另一种无毒或弱毒的微生物基因组种无毒或弱毒的微生物基因组表达表达构建重组活载体疫苗株。可以同时构建重组活载体疫苗株。可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，毒力不返强。毒力不返强。 7 7 7 7、核酸疫苗（基因或、核酸疫苗（基因或、核酸疫苗（基因或、核酸疫苗（基因或DNADNADNADNA疫苗）疫苗）疫苗）疫苗） 病原保护性抗原基因病原保护性抗原基因连接细连接细菌或病毒菌或病毒DNA DNA 直接导入动物体直接导入动物体表
8、达抗原表达抗原诱导产生免疫保护。制诱导产生免疫保护。制造简便、成本低、安全、免疫期长、造简便、成本低、安全、免疫期长、热稳定性好，但仍未商品化生产。热稳定性好，但仍未商品化生产。（二）诊断用制品（二）诊断用制品1 1、常规免疫、常规免疫血清学诊断技术血清学诊断技术 （1 1）凝集试验抗原：）凝集试验抗原： 直接凝集试验（平板法、试管法）：抗原和直接凝集试验（平板法、试管法）：抗原和抗体混合后直接发生凝集反应。抗体混合后直接发生凝集反应。 间接凝集试验（间接凝集试验（间接血凝、胶乳凝集和反相间接血凝、胶乳凝集和反相间接血凝试验间接血凝试验）。）。 1 1、常规免疫、常规免疫血清学诊断技术血清学诊
9、断技术（2）免疫沉淀试验抗原：包括试管沉淀法、单相免疫扩免疫沉淀试验抗原：包括试管沉淀法、单相免疫扩散试验和双相免疫扩散试验、免疫电泳、对流免疫电泳等。散试验和双相免疫扩散试验、免疫电泳、对流免疫电泳等。（3 3）中和试验：将特异性血清与相应病原混合，用血清）中和试验：将特异性血清与相应病原混合，用血清病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察感染情病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察感染情况进行疾病诊断。况进行疾病诊断。（4 4）补体结合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活补体，）补体结合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活补体，出现各种生物学反应。出现各种生物学反应。1 1、常规免疫、常规免
10、疫血清学诊断技术血清学诊断技术（5 5）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）：包括直接法、间接法、）：包括直接法、间接法、双抗体夹心、竞争双抗体夹心、竞争ELISAELISA等。等。（6 6）荧光抗体染色技术：直接法、间接法、竞争法等。）荧光抗体染色技术：直接法、间接法、竞争法等。 （7 7）胶体金免疫检测技术。）胶体金免疫检测技术。（8 8）免疫组化诊断试剂。）免疫组化诊断试剂。2 2、生物技术和分子生物学诊断技术、生物技术和分子生物学诊断技术（1 1）生物技术：单克隆抗体技术（荧光抗体染色技术或）生物技术：单克隆抗体技术（荧光抗体染色技术或酶联免疫染色技术）。酶联免
11、疫染色技术）。 （2 2）分子生物学技术。）分子生物学技术。PCRPCR（RTRTPCRPCR）扩增技术。）扩增技术。荧光定量荧光定量PCRPCR（RTRTPCRPCR）。）。基于核酸序列扩增技术（基于核酸序列扩增技术（NASBANASBA）。）。核酸探针。核酸探针。（三）治疗及其他制品（三）治疗及其他制品1 1、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血清制成，用于、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血清制成，用于治疗或预防动物疾病。治疗或预防动物疾病。2 2、微生态制剂：含活菌的制剂，具有调节机体菌群、增、微生态制剂：含活菌的制剂，具有调节机体菌群、增强免疫力、促生长等。强免疫力、促生长等。3 3、
12、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取卵黄抗体制成，、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取卵黄抗体制成，用于治疗或预防动物疾病。用于治疗或预防动物疾病。4 4、干扰素：用病毒等诱导产生干扰素。、干扰素：用病毒等诱导产生干扰素。5 5、转移因子：用动物脏器或组织提取制成，作为非特异转移因子：用动物脏器或组织提取制成，作为非特异性免疫调节剂，增强机体免疫力，提高生产性能。性免疫调节剂，增强机体免疫力，提高生产性能。二、兽用疫苗制备技术二、兽用疫苗制备技术（一）兽用灭活疫苗的制备技术（一）兽用灭活疫苗的制备技术 灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组织灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组织或细胞培养物，经化
13、学灭活剂灭活或加热处理，或细胞培养物，经化学灭活剂灭活或加热处理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当的防腐剂或加入免疫佐剂制成。的防腐剂或加入免疫佐剂制成。 1 1、菌（毒）种菌（毒）种1.11.1、菌（毒）种菌（毒）种标准标准历史清楚；历史清楚；生物学性状明显；生物学性状明显；遗传稳定；遗传稳定；优良的免疫原性与反应原性；优良的免疫原性与反应原性；毒力在规定的范围内。毒力在规定的范围内。1.11.1、菌（毒）种菌（毒）种标准标准原种原种 细菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和细菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力
14、和免疫原性等，并作纯粹检查。病毒原种应规定其生物学特性、理化特免疫原性等，并作纯粹检查。病毒原种应规定其生物学特性、理化特性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。基础种子基础种子 基础种子由原种制备而来，基础种子为企业生产兽用生物基础种子由原种制备而来，基础种子为企业生产兽用生物制品提供种子来源，应作系统鉴定，并规定代次。制品提供种子来源，应作系统鉴定，并规定代次。生产种子生产种子 生产种子由生产企业用基础种子进行复壮、繁殖。细菌等生产种子由生产企业用基础种子进行复壮、繁殖。细菌等生产种子应作纯粹检查。病毒生产种子应作
15、含量测定和纯净检查。生产种子应作纯粹检查。病毒生产种子应作含量测定和纯净检查。1.2 1.2 、菌（毒）种选育、菌（毒）种选育菌种的选育菌种的选育 分离病原分离病原纯粹检验纯粹检验致病性鉴定和致病性鉴定和抗原性测定抗原性测定设计制成灭活疫苗设计制成灭活疫苗接种实验室动物接种实验室动物攻毒攻毒用本动物进行保护率测定用本动物进行保护率测定以确定疫苗候以确定疫苗候选株。选株。毒种的选育毒种的选育 弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒株；强毒毒株分离株；强毒毒株分离系统鉴定（无污染、毒力强而系统鉴定（无污染、毒力强而稳定、免疫原性好、抗原谱广、与流行毒血清型相稳定、免疫原性
16、好、抗原谱广、与流行毒血清型相符）符）疫苗候选株。疫苗候选株。1.3 1.3 、菌（毒）种保存、菌（毒）种保存冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法 冻干的菌种一般在冻干的菌种一般在2828 C C保存；冻保存；冻干的毒种一般在干的毒种一般在-20-20 C C以下保存，以下保存，温度越低保存期越温度越低保存期越长。长。结冻保存结冻保存 有些病毒可用含毒组织在低温条件下（有些病毒可用含毒组织在低温条件下（- -2020 C C以下）。以下）。液氮保存液氮保存 有些细胞结合毒须在有些细胞结合毒须在196196 C C的液氮中保的液氮中保存。存。动物继代保存动物继代保存 虫种一般通过动物继代保存。虫种一般通
17、过动物继代保存。1.41.4、菌（毒）种的管理、菌（毒）种的管理生产检验用菌（毒）种实行分级管理制度，种子分生产检验用菌（毒）种实行分级管理制度，种子分三级（原种、基础种子和生产种子）。三级（原种、基础种子和生产种子）。原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心负原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心负责保管；基础种子由菌种中心或分中心负责制备、责保管；基础种子由菌种中心或分中心负责制备、鉴定、保管和供应；生产种子由生产企业自行制备、鉴定、保管和供应；生产种子由生产企业自行制备、鉴定和保管。鉴定和保管。1.5、菌（毒）种索取与分发菌（毒）种索取与分发 供应：菌种中心及分中心统一供应。供应：
18、菌种中心及分中心统一供应。索取：须持有相应级别机构出具的正式公函，说明索取：须持有相应级别机构出具的正式公函，说明菌种名称、型别、数量及用途。一、二类菌种时，菌种名称、型别、数量及用途。一、二类菌种时，必须由省（市、自治区）兽医行政主管部门审核，必须由省（市、自治区）兽医行政主管部门审核，农业部批准后，方可供应。有产品批准文号者，可农业部批准后，方可供应。有产品批准文号者，可由生产企业直接向菌种中心或分中心领取。由生产企业直接向菌种中心或分中心领取。要求：其他任何单位不得转发生产用菌（毒）种。要求：其他任何单位不得转发生产用菌（毒）种。烈性传染病或人畜共患传染病的强毒菌（毒）种，烈性传染病或人
19、畜共患传染病的强毒菌（毒）种，必须有专职技术人员领取。必须有专职技术人员领取。 1.21.2、病原培养、病原培养1.2.1 1.2.1 细菌培养技术细菌培养技术细菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个时期：迟细菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个时期：迟缓期（细菌处于静止适应状态）；对数增殖期缓期（细菌处于静止适应状态）；对数增殖期（以恒定的速度增殖）；稳定期（细菌增加数与（以恒定的速度增殖）；稳定期（细菌增加数与死亡数保存平衡）；衰退期（活菌数下降）。死亡数保存平衡）；衰退期（活菌数下降）。1.2.11.2.1、细菌培养技术、细菌培养技术 需氧菌的培养需氧菌的培养 平板培养法平板培养法 有平板划线培养
20、法和倾注培养法。有平板划线培养法和倾注培养法。需氧芽孢菌的培养需氧芽孢菌的培养 将接种材料先接种于液体培养将接种材料先接种于液体培养基中，置水浴加入至基中，置水浴加入至8080 C C，维持，维持15152020分钟，以杀分钟，以杀死非芽孢菌，然后在死非芽孢菌，然后在3737 C C作增菌培养。作增菌培养。抑菌分离培养抑菌分离培养 利用某些化学药品对某类细菌的抑利用某些化学药品对某类细菌的抑制或杀灭作用，而对另一些细菌不生产明显的作用，制或杀灭作用，而对另一些细菌不生产明显的作用，来分离培养某些细菌。来分离培养某些细菌。接种试验动物进行培养。接种试验动物进行培养。1.2.1、细菌培养技术、细菌
21、培养技术厌氧菌的培养厌氧菌的培养 生物学方法生物学方法 在培养基中加入植物或动物组在培养基中加入植物或动物组织（如马铃薯、发芽谷物、灭菌的新鲜动物织（如马铃薯、发芽谷物、灭菌的新鲜动物组织块），以消耗养气或使氧化还原电势下组织块），以消耗养气或使氧化还原电势下降。用这些培养基培养厌氧菌时，先将培养降。用这些培养基培养厌氧菌时，先将培养基煮沸基煮沸15153030分钟，降温后在培养基表面加分钟，降温后在培养基表面加一层灭菌的液体石蜡，然后接种培养。一层灭菌的液体石蜡，然后接种培养。厌氧菌的培养厌氧菌的培养化学方法化学方法 利用还原作用强的化学物质，吸收环境或利用还原作用强的化学物质，吸收环境或培
22、养基内的养气或还原氧化型物质，降低氧化还原电培养基内的养气或还原氧化型物质，降低氧化还原电势。势。物理学方法物理学方法 利用加热、密封、抽气等物理学方法，利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝培养环境或培养基中的养气，形成无氧以驱除或隔绝培养环境或培养基中的养气，形成无氧状态，以利于厌氧菌的生长。常用的有厌氧罐法。状态，以利于厌氧菌的生长。常用的有厌氧罐法。含二氧化碳条件下的细菌培养含二氧化碳条件下的细菌培养含二氧化碳条件下的细菌培养含二氧化碳条件下的细菌培养有些细菌特别是初次分离培养，在含有有些细菌特别是初次分离培养，在含有5 51010CO2CO2环境下生环境下生长良好，培养时，可
23、直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要长良好，培养时，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要调节培养箱内二氧化碳的浓度。调节培养箱内二氧化碳的浓度。在没有条件的实验室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接在没有条件的实验室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧耗氧产生种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧耗氧产生二氧化碳，蜡烛即熄灭。此时容器内含有较高浓度的二氧化碳，二氧化碳，蜡烛即熄灭。此时容器内含有较高浓度的二氧化碳，将容器放入适宜温度培养。将容器放入适宜温度培养。 1.2.21.2.2、病毒培养基本技术、病毒培养基本技术病毒是严格的细胞内寄
24、生物，由于病毒缺乏自主复制的酶病毒是严格的细胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的酶系统，不能独自进行物质代谢，必须依赖宿主细胞或细胞系统，不能独自进行物质代谢，必须依赖宿主细胞或细胞的某些成分合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的细胞内的某些成分合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的细胞内以复制的方式进行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内以复制的方式进行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内生长。生长。除少数病毒外，大多数动物病毒能在试验动物、受除少数病毒外，大多数动物病毒能在试验动物、受精卵和细胞培养中增殖。精卵和细胞培养中增殖。1.2.21.2.2、病毒培养基本技术、病毒培养基本技术病毒细胞培养的营养需
25、求病毒细胞培养的营养需求1 1）无机离子）无机离子 维持渗透压、提供细胞酶与代谢活动所需维持渗透压、提供细胞酶与代谢活动所需要的物质，促进细胞贴壁等。常用弱碳酸氢盐来调节培养要的物质，促进细胞贴壁等。常用弱碳酸氢盐来调节培养液的液的pHpH值，培养液的值，培养液的pHpH值一般维持在值一般维持在7.2-7.47.2-7.4。2) 2) 碳水化合物碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂的培养基，还需添加其它糖类或简单的化合物如乳酸、丙的培养基，还需添加其它糖类或简单的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。3) 3) 氨基酸氨
26、基酸 细胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。维持细胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。维持细胞生长的最低营养要求需要以下细胞生长的最低营养要求需要以下1313种氨基酸。种氨基酸。病毒细胞培养的营养需求病毒细胞培养的营养需求4) 4) 维生素维生素 大部分维生素与细胞代谢有关。使用较多的大部分维生素与细胞代谢有关。使用较多的维生素主要是维生素主要是B B族维生素，复杂的培养液中还含有还原剂、族维生素，复杂的培养液中还含有还原剂、谷胱甘肽、抗坏血酸及谷胱甘肽、抗坏血酸及L L半胱氨酸。在不含血清的培养半胱氨酸。在不含血清的培养液中，常含有脂溶性维生素。液中，常含有脂溶性维生素。5) 5) 蛋白质蛋白质 动
27、物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛动物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛血清或犊牛血清。血清起营养作用，保护细胞或去毒，抑血清或犊牛血清。血清起营养作用，保护细胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促进细胞在玻璃上附着和铺开。制蛋白溶解酶，促进细胞在玻璃上附着和铺开。6 6）抗生素）抗生素 控制细胞培养中细菌的污染，常用的抗生素控制细胞培养中细菌的污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、制霉菌素或两性霉素有青霉素、链霉素、制霉菌素或两性霉素B B。细胞培养技术细胞培养技术 细胞培养类型细胞培养类型 （1 1）原代细胞）原代细胞 原代细胞是用动物新鲜组织如胚胎或幼畜原代细胞是用动物新鲜组织如胚胎或幼畜的组
28、织或受精卵，经胰蛋白酶消化分散后制备而成。病毒的组织或受精卵，经胰蛋白酶消化分散后制备而成。病毒对原代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代细对原代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代细胞不能在体外多次传代，组织原材料的来源不固定，易混胞不能在体外多次传代，组织原材料的来源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其质量，影响入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其质量，影响产品的纯净和安全性。产品的纯净和安全性。 细胞培养类型细胞培养类型2 2） 二倍体细胞株二倍体细胞株 原代细胞原代细胞次代细胞次代细胞多次连续传代多次连续传代成为二倍体细胞。二倍体细胞的细胞形态学可能发生
29、变化，成为二倍体细胞。二倍体细胞的细胞形态学可能发生变化，但细胞染色体数与原代细胞一样。不能在体外无限制传代，但细胞染色体数与原代细胞一样。不能在体外无限制传代，从几代至几十代，兼有原代细胞和传代细胞的优点，病毒从几代至几十代，兼有原代细胞和传代细胞的优点，病毒对其易感，质量可控，适用于繁殖病毒。对其易感，质量可控，适用于繁殖病毒。 3 3）传代细胞系）传代细胞系 由肿瘤组织培养而成或由细胞株转化而由肿瘤组织培养而成或由细胞株转化而来。可在体外无限制的传代，其染色体数不正常，成为异来。可在体外无限制的传代，其染色体数不正常，成为异倍体。适宜于许多动物病毒的生长，易于培养，可以建立倍体。适宜于许
30、多动物病毒的生长，易于培养，可以建立种子库，质量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情种子库，质量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情况应详细，并作系统鉴定合格后，方可用于繁殖病毒生产况应详细，并作系统鉴定合格后，方可用于繁殖病毒生产灭活疫苗。灭活疫苗。各种传代水平细胞系检查各种传代水平细胞系检查检验项目检验项目主细胞库主细胞库工作工作细胞库细胞库最高限制最高限制代次细胞代次细胞高于最高代次高于最高代次1010代的细胞代的细胞显微镜检查显微镜检查细菌和霉菌细菌和霉菌支原体支原体病毒病毒细胞鉴别细胞鉴别胞核学检查胞核学检查致瘤和致癌性致瘤和致癌性传代细胞的保存传代细胞的保存1) 1) 细胞保存
31、细胞保存 收集新鲜细胞，用细胞冷冻保护液收集新鲜细胞，用细胞冷冻保护液( (含含2020犊牛血犊牛血清、清、5 51010二甲基亚砜的营养液二甲基亚砜的营养液) )调整细胞浓度达调整细胞浓度达100100万一万一200200万万个细胞个细胞m1m1，分装于安瓿中，封口，分装于安瓿中，封口， 44预冷预冷30min30min，封口严密的，封口严密的安瓿移至安瓿移至-50-507070 C C冰箱中预冷，然后移至液氮罐内贮存，可保冰箱中预冷，然后移至液氮罐内贮存，可保存数年。存数年。 2) 2) 细胞复苏细胞复苏 将安瓶自液氮罐取出后立即放入将安瓶自液氮罐取出后立即放入37374040温水中，温水
32、中，在在lminlmin之内使细胞融化，换液培养至形成细胞单层。之内使细胞融化，换液培养至形成细胞单层。3) 3) 细胞运输细胞运输 单层细胞培养瓶装满生长液，以防液体振荡冲脱细单层细胞培养瓶装满生长液，以防液体振荡冲脱细胞，或只留少量生长液能覆盖单层，以防细胞干燥。细胞悬液装于胞，或只留少量生长液能覆盖单层，以防细胞干燥。细胞悬液装于冰盒保持温度在冰盒保持温度在15152525左右。左右。细胞培养方法细胞培养方法1 1）静止培养）静止培养 静止培养是指将制备好的细胞悬液分装在静止培养是指将制备好的细胞悬液分装在适宜的培养瓶中，密闭瓶口，置恒温培养箱内静止培养或适宜的培养瓶中，密闭瓶口，置恒温
33、培养箱内静止培养或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静止培养，形成细胞单层后，接种病毒悬液，止培养，形成细胞单层后，接种病毒悬液，37373838 C C左左右继续培养。右继续培养。2 2）转动培养）转动培养 将制备好的细胞悬液分装在玻璃或塑料转将制备好的细胞悬液分装在玻璃或塑料转瓶中，密闭瓶口，置转瓶机上，以每小时瓶中，密闭瓶口，置转瓶机上，以每小时5 51010转转动培转转动培养，细胞在转动培养时，贴附于瓶壁四周，长成细胞单层养，细胞在转动培养时，贴附于瓶壁四周，长成细胞单层后，接种病毒悬液，后，接种病毒悬液，37373838
34、 C C左右继续转动培养。左右继续转动培养。细胞培养方法细胞培养方法3 3）悬浮培养）悬浮培养 在悬浮培养罐中通过不断搅拌，并随时补在悬浮培养罐中通过不断搅拌，并随时补充营养液和校正充营养液和校正pHpH值，使细胞在悬浮的条件下培养生长。值，使细胞在悬浮的条件下培养生长。由于悬浮培养细胞能及时得到充足的营养和养气，细胞生由于悬浮培养细胞能及时得到充足的营养和养气，细胞生长速度快，产量高，可以得到大量的细胞。长速度快，产量高，可以得到大量的细胞。4 4）微载体培养）微载体培养 通过搅拌使微载体悬浮在培养液中，细通过搅拌使微载体悬浮在培养液中，细胞通过贴附在微载体固体颗粒表面上生长形成细胞单层，胞
35、通过贴附在微载体固体颗粒表面上生长形成细胞单层，细胞的浓度较大、生长快。微载体培养可采用通气搅拌法，细胞的浓度较大、生长快。微载体培养可采用通气搅拌法，也可采用转瓶培养法进行。也可采用转瓶培养法进行。1.2.3 1.2.3 鸡胚接种技术鸡胚接种技术鸡胚的选择鸡胚的选择 必须是来源于健康易感的种鸡群，其种蛋必必须是来源于健康易感的种鸡群，其种蛋必须新鲜，清洁。种鸡群必须定期监测，不得含有繁殖病毒须新鲜，清洁。种鸡群必须定期监测，不得含有繁殖病毒的相应抗体。的相应抗体。鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法1 1）尿囊腔途径）尿囊腔途径 取取9 91111日龄的鸡胚，在灯光照射下，在日龄的鸡
36、胚，在灯光照射下，在离气室约离气室约0.30.30.5cm0.5cm处无大血管的位置作一标记，作为接处无大血管的位置作一标记，作为接种部位，在气室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放种部位，在气室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放在蛋盘上，在待接种处垂直刺入针头约在蛋盘上，在待接种处垂直刺入针头约0.5cm0.5cm，接种，接种0.050.050.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封口，继续孵化。也可将气室病毒溶液，用石蜡封口，继续孵化。也可将气室向上放于蛋盘中，在气室距边缘约向上放于蛋盘中，在气室距边缘约0.5cm0.5cm处打一小孔。沿处打一小孔。沿受精卵长径平行方向刺入针头约受精卵长径平
37、行方向刺入针头约1cm1cm，注入接种物，注入接种物0.050.050.2ml0.2ml，用石蜡封孔，继续孵化。，用石蜡封孔，继续孵化。鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法2 2）绒毛尿囊膜途径）绒毛尿囊膜途径 在气室中心钻一小孔，直接从气室在气室中心钻一小孔，直接从气室处刺入针头约处刺入针头约0.5cm0.5cm，滴入，滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，继续垂病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。也可用直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。也可用人工气室法进行，在胚胎附近处和气室处各打一小孔，然人工气
38、室法进行，在胚胎附近处和气室处各打一小孔，然后用吸球紧贴气室小孔处轻轻吸气，造成负压，形成人工后用吸球紧贴气室小孔处轻轻吸气，造成负压，形成人工气室，接种气室，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。3 3）卵黄囊途径）卵黄囊途径 在气室中心钻一小孔，垂直刺入针头约在气室中心钻一小孔，垂直刺入针头约3cm3cm，注入接种物，注入接种物0.20.20.5ml0.5ml，用石蜡封口，继续孵化。，用石蜡封口，继续孵化。也可在气室外和卵长径的也可在气室外和卵长径的1/21/2处各打一小孔，并在中间孔处各打一小孔，并在中间孔处刺入针头约处刺入针头约1.5cm1.5
39、cm，接种，接种0.10.10.5ml0.5ml病毒溶液，用石蜡病毒溶液，用石蜡封孔。封孔。 鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法4 4）羊膜腔途径）羊膜腔途径 将气室端靠近胚胎侧的卵壳锯穿，在卵将气室端靠近胚胎侧的卵壳锯穿，在卵膜上滴入一滴无菌液体石蜡或生理盐水，避开血管，在气膜上滴入一滴无菌液体石蜡或生理盐水，避开血管，在气室处刺入针头约室处刺入针头约0.5cm0.5cm，在气室内的卵膜上滴入，在气室内的卵膜上滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。或在人工气室孔处呈囊膜，拔出针头。
40、或在人工气室孔处呈3030 角刺入针头约角刺入针头约0.5cm0.5cm，接种，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。5 5）静脉途径）静脉途径 画出直而粗的静脉处位置，卵壳，加一滴画出直而粗的静脉处位置，卵壳，加一滴液体石蜡，使卵膜透明。用长约液体石蜡，使卵膜透明。用长约1.5cm1.5cm的的4 4号针头插入血管号针头插入血管内注射接种物内注射接种物0.02-0.05ml0.02-0.05ml。接种后的检查及病毒的收获接种后的检查及病毒的收获接种后的检查及病毒的收获接种后的检查及病毒的收获接种后一般在接种后一般在3737 C C左右继续孵化左右继续
41、孵化2 27 7天，不必翻天，不必翻蛋。每日照蛋蛋。每日照蛋1 12 2次，弃去接种后次，弃去接种后2424小时内非特小时内非特异死亡的鸡胚，异死亡的鸡胚，2424小时后死亡的鸡胚随时捡出，小时后死亡的鸡胚随时捡出，置置4 48 8 C C冷却冷却4 42424小时。小时。观察期结束，所有活胚同样冷却处理。分别收获观察期结束，所有活胚同样冷却处理。分别收获收获胚体、卵黄囊、尿囊液、绒毛尿囊膜等。收收获胚体、卵黄囊、尿囊液、绒毛尿囊膜等。收获期间注意检查胚胎、绒毛尿囊膜的病变情况、获期间注意检查胚胎、绒毛尿囊膜的病变情况、尿囊液是否浑浊等。尿囊液是否浑浊等。几种病毒接种途径及收获材料几种病毒接种
42、途径及收获材料病毒病毒胚龄胚龄接种接种途径途径培养培养温度温度培养培养时间时间鸡胚鸡胚变化变化收获收获材料材料鸡新城疫鸡新城疫9 91111尿囊腔尿囊腔3737左右左右3 35 5天天出血、死出血、死亡、血凝亡、血凝尿囊液尿囊液鸡痘鸡痘10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM鸡传染性鸡传染性喉气管炎喉气管炎10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM狂犬狂犬6 67 7卵黄囊卵黄囊3737左右左右8 81010天天卵黄囊卵黄囊乙脑乙脑6 68 8卵黄囊卵黄囊3737左右左右3 3天天死亡死亡鸡胚鸡胚1.2.4 1.
43、2.4 1.2.4 1.2.4 动物接种技术动物接种技术动物接种技术动物接种技术 2.4.1 2.4.1 动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法1 1）脑内接种）脑内接种 给小鼠和地鼠脑内接种时，用左手大拇指和食指固定给小鼠和地鼠脑内接种时，用左手大拇指和食指固定头部，消毒左侧眼与耳之间上部注射部位，并于眼后角、耳前缘及颅头部，消毒左侧眼与耳之间上部注射部位，并于眼后角、耳前缘及颅前后中线所构成之位置中间刺入针头前后中线所构成之位置中间刺入针头2 23mm3mm，乳鼠接种，乳鼠接种0.01-0.02ml0.01-0.02ml，成年鼠和地鼠为，成年鼠和地鼠为0.03-0.05ml0.03-
44、0.05ml。给豚鼠和家兔进行脑内接种时，先。给豚鼠和家兔进行脑内接种时，先作麻醉或人工固定，在颅前后中线旁边作麻醉或人工固定，在颅前后中线旁边5mm5mm平行线与动物瞳孔横线交平行线与动物瞳孔横线交叉处消毒，用锥刺穿颅骨，然后用针头刺入叉处消毒，用锥刺穿颅骨，然后用针头刺入4 410mm10mm，接种，接种0.1-0.1-0.025ml0.025ml。绵羊脑内接种时，先固定在接种台上，剪去头顶部的毛，。绵羊脑内接种时，先固定在接种台上，剪去头顶部的毛，并用硫化钡脱毛，碘酊消毒后，在颅顶部中线左或右侧，用锥钻一小并用硫化钡脱毛，碘酊消毒后，在颅顶部中线左或右侧，用锥钻一小孔，硬脑膜下或脑内接种
45、孔，硬脑膜下或脑内接种1ml1ml，立即用火棉胶封闭接种孔。，立即用火棉胶封闭接种孔。动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法2 2）皮内接种）皮内接种 常用于大动物。在背部、颈部、腹部、耳部及尾根部常用于大动物。在背部、颈部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用针头斜先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用针头斜面向外，与皮肤面平行刺入面向外，与皮肤面平行刺入2 23mm3mm，接种，接种0.1-0.2ml0.1-0.2ml。注射剂量较大。注射剂量较大时，可分点注射。牛、羊舌面皮内注射时，先固定
46、动物，抓住动物舌时，可分点注射。牛、羊舌面皮内注射时，先固定动物，抓住动物舌头并固定，然后接种。头并固定，然后接种。3 3）皮下注射）皮下注射 豚鼠和家兔可选择腹部及大腿内侧皮肤松弛处，小鼠豚鼠和家兔可选择腹部及大腿内侧皮肤松弛处，小鼠可选择尾根部或背部，碘酊消毒皮肤处，用针头水平方向挑起皮肤，可选择尾根部或背部，碘酊消毒皮肤处，用针头水平方向挑起皮肤，刺入刺入1.5-2cm1.5-2cm，缓慢注入接种物，缓慢注入接种物0.2-1ml0.2-1ml。动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法4 4）静脉接种）静脉接种 小鼠尾静脉注射时，先将小鼠尾巴
47、在小鼠尾静脉注射时，先将小鼠尾巴在50505555 C C水中浸泡水中浸泡1 1分钟，使尾静脉扩张，用鼠缸扣住鼠体，分钟，使尾静脉扩张，用鼠缸扣住鼠体，露出尾部，用左手拇指和中指将鼠尾拉直，以食指托住尾露出尾部，用左手拇指和中指将鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端处平行刺入针头，再向部，消毒注射部位后由靠近尾尖端处平行刺入针头，再向下刺入静脉，慢慢注入下刺入静脉，慢慢注入0.1-1ml0.1-1ml接种物。家兔耳静脉注射接种物。家兔耳静脉注射时，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精时，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位静脉棉球涂擦注射部位
48、静脉1 1分钟，使静脉扩张，再用左手拇分钟，使静脉扩张，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入针头缓慢注射指及中食指抓住耳尖部，刺入针头缓慢注射1 15ml5ml接种物。接种物。鸡翅下肱静脉注射时，侧卧固定，张开翅膀，拔去注射部鸡翅下肱静脉注射时，侧卧固定，张开翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用针头斜面朝上刺入静脉注射位的羽毛，碘酊消毒，用针头斜面朝上刺入静脉注射1 15ml5ml接种物。接种物。动物接种途径和接种方法动物接种途径和接种方法5 5）腹腔接种）腹腔接种 家兔和豚鼠先在腹股沟处刺入皮下，家兔和豚鼠先在腹股沟处刺入皮下，进针少许后再刺入腹腔注射进针少许后再刺入腹腔注射0.5-5ml
49、0.5-5ml。小鼠腹腔接。小鼠腹腔接种时，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其头种时，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其头背部，翻转鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚夹背部，翻转鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚夹于小指和无名指之间，右手将针头平行刺入腿根于小指和无名指之间，右手将针头平行刺入腿根处腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射处腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射0.5-1ml0.5-1ml。动物接种后的观察及含毒组织的收获动物接种后的观察及含毒组织的收获动物接种后的观察及含毒组织的收获动物接种后的观察及含毒组织的收获动物接种后应每天观察，注意动物的活动、饮食、粪便与动物接种后应每天观察，注意动物的活
50、动、饮食、粪便与尿液及皮毛体表等情况，还应根据接种微生物的特性及动尿液及皮毛体表等情况，还应根据接种微生物的特性及动物性别、年龄等的不同而有所侧重，如体温曲线、特征性物性别、年龄等的不同而有所侧重，如体温曲线、特征性临床症状的出现及注射部位的特征性变化等。根据观察结临床症状的出现及注射部位的特征性变化等。根据观察结果，选出接种后符合要求的反应特征的动物，按照规定方果，选出接种后符合要求的反应特征的动物，按照规定方法剖杀动物，收集含毒血液或采集含毒组织、器官等。法剖杀动物，收集含毒血液或采集含毒组织、器官等。1.31.3、工业化大规模繁殖病原的方法、工业化大规模繁殖病原的方法大量培养细菌的方法大
51、量培养细菌的方法 （1 1） 固体培养基表面培养法固体培养基表面培养法 此法是将溶此法是将溶化的肉汤琼脂培养基，分装于大扁瓶化的肉汤琼脂培养基，分装于大扁瓶( (大型克氏瓶大型克氏瓶) )，灭菌后平放使凝固，经培养观察无污染，在无，灭菌后平放使凝固，经培养观察无污染，在无菌室接入种子液，使均匀分布于表面，平放温室菌室接入种子液，使均匀分布于表面，平放温室静置培养，然后倾去凝集水，收集菌苔制成菌悬静置培养，然后倾去凝集水，收集菌苔制成菌悬浮液。浮液。 大量培养细菌的方法大量培养细菌的方法（2 2） 液体静置培养法液体静置培养法 此法适于一般菌苗的生产，培养此法适于一般菌苗的生产，培养容器可用大玻
52、瓶也可用培养罐容器可用大玻瓶也可用培养罐( (或称发酵罐或称发酵罐) )，按容器的深，按容器的深度，装入适量培养基，一般是容器深度的度，装入适量培养基，一般是容器深度的1 12 22 23 3为宜，为宜，经高压蒸汽灭菌之后，冷至室温接入细菌种子，保持适宜经高压蒸汽灭菌之后，冷至室温接入细菌种子，保持适宜温度静置培养。温度静置培养。 （3 3）液体深层通气培养法）液体深层通气培养法 使用培养罐（反应缸），使用培养罐（反应缸），带有搅拌器和通气系统，或自动控制装置，用人工控制培带有搅拌器和通气系统，或自动控制装置，用人工控制培养温度和通气量。培养基与佐剂（氢氧化铝胶、油佐剂等）养温度和通气量。培养
53、基与佐剂（氢氧化铝胶、油佐剂等）均可在缸内消毒，在缸内进行细菌的培养及灭活、加佐剂均可在缸内消毒，在缸内进行细菌的培养及灭活、加佐剂配苗与分装等，可大量生产出质量较好的菌苗。配苗与分装等，可大量生产出质量较好的菌苗。工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法（1 1） 单层转瓶培养单层转瓶培养 是在转鼓条件下发展起来的，是在转鼓条件下发展起来的，专用于大量生产细胞的一种设备，能自动调温、调专用于大量生产细胞的一种设备，能自动调温、调速和报警，靠一台马达驱动，转瓶架分上、中、下速和报警，靠一台马达驱动，转瓶架分上、中、下几层，每层可放
54、一排几层，每层可放一排1 1万万1.51.5万万m1m1的转瓶，转瓶是的转瓶，转瓶是搁置在滚轴上，以每小时搁置在滚轴上，以每小时9 91515转的转速转动。国际转的转速转动。国际上普遍使用无毒塑料转瓶，直径为上普遍使用无毒塑料转瓶，直径为151520cm20cm，长度，长度为为303080cm80cm，多为一次性使用。，多为一次性使用。工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法（2 2） 培养罐培养培养罐培养 培养罐罐体结构均为不锈钢培养罐罐体结构均为不锈钢质，可以自动调温、调质，可以自动调温、调pHpH值，用无级马达、磁搅值，用无级马达、磁搅拌、消泡、控制氧压、自动补液、换液、自动
55、高拌、消泡、控制氧压、自动补液、换液、自动高压灭菌、自动计算呼吸商等。深层悬浮培养法能压灭菌、自动计算呼吸商等。深层悬浮培养法能控制一致的细胞培养条件，可大规模生产，细胞控制一致的细胞培养条件，可大规模生产，细胞培养物可通过高速离心弃去培养液，使病毒更加培养物可通过高速离心弃去培养液，使病毒更加纯净，可减少异性蛋白质的含量。纯净，可减少异性蛋白质的含量。工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法（3 3）微载体细胞培养系统）微载体细胞培养系统 微载体的直径在微载体的直径在6060250 250 mm，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成，如聚苯乙
56、烯、聚丙烯酰胺等。此法兼合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此法兼有悬浮培养法和单层培养法的优点，容易大量培有悬浮培养法和单层培养法的优点，容易大量培养细胞，特别是适合那些不能被悬浮培养法培养养细胞，特别是适合那些不能被悬浮培养法培养的二倍体细胞和原代细胞。的二倍体细胞和原代细胞。工业化大规模培养病毒的方法工业化大规模培养病毒的方法（4 4） 生物反应器生物反应器 反应器控制系统由高性能、智能化的反应器控制系统由高性能、智能化的微机控制仪及附属功能电路和器件所组成，实现了空气、微机控制仪及附属功能电路和器件所组成，实现了空气、氧气、氮气和氧气、氮气和C02C02气体与气体与pHpH值、溶氧的关
57、联控制，能准确值、溶氧的关联控制，能准确控制温度、转速、控制温度、转速、pHpH值、溶解氧浓度和液位。细胞培养用值、溶解氧浓度和液位。细胞培养用生物反应器可连续进行培养，随时采样观察，生产效率提生物反应器可连续进行培养，随时采样观察，生产效率提高高200200300300，大大降低产品的成本；有完善的由计算，大大降低产品的成本；有完善的由计算机控制的检测及培养系统，保证了运行的安全；体积小，机控制的检测及培养系统，保证了运行的安全；体积小，减少了生产车间所需的净化空间面积；自动化程度高，大减少了生产车间所需的净化空间面积；自动化程度高，大大降低了污染率。大降低了污染率。 3、灭活工艺、灭活工艺
58、 3.13.1、 灭活剂灭活剂（1 1） 甲醛溶液甲醛溶液 （福尔马林）（福尔马林） 常用的甲醛溶液约含常用的甲醛溶液约含37%37%甲醛气体甲醛气体（重量计），为强还原剂，能与微生物蛋白质的氨基酸结合，形成具（重量计），为强还原剂，能与微生物蛋白质的氨基酸结合，形成具有其它性质的化合物，而扰乱微生物的代谢，适当浓度可使微生物丧有其它性质的化合物，而扰乱微生物的代谢，适当浓度可使微生物丧失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于灭活细菌的浓度为失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于灭活细菌的浓度为0.1%0.8%0.1%0.8%，用于灭活病毒时浓度为，用于灭活病毒时浓度为0.05%0.
59、2%0.05%0.2%。必要时在甲醛灭。必要时在甲醛灭活后加入焦亚硫酸钠以终止反应。活后加入焦亚硫酸钠以终止反应。（2 2） 烷化剂类烷化剂类 为一类含有烷基分子去一个氢原子的化合物，它为一类含有烷基分子去一个氢原子的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入形成烷基取代物，其灭活作用主能与另一种化合物作用，将烷基引入形成烷基取代物，其灭活作用主要是烷化病毒要是烷化病毒DNADNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋链交联，防碍链交联，防碍RNARNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂，使病毒完全丧的合成，从而抑制细胞的有丝分裂，使病毒完全丧失感
60、染力，但不损伤保护性抗原，广泛用于病毒的灭活。常用的为失感染力，但不损伤保护性抗原，广泛用于病毒的灭活。常用的为BEIBEI和和AEIAEI。3.13.1、 灭活剂灭活剂（3 3） 丙烯内脂（丙烯内脂（BPLBPL） 本品为无色有刺激气味的液本品为无色有刺激气味的液体，对皮肤、粘膜有强刺激性，并具有致癌性。水中溶解体，对皮肤、粘膜有强刺激性，并具有致癌性。水中溶解度度3737（V/VV/V），能与丙酮、醚和氯仿混合。吸入空气中），能与丙酮、醚和氯仿混合。吸入空气中的水分子时缓缓分解成羟基丙酸，其水溶液迅速全部分解，的水分子时缓缓分解成羟基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于密封保存
61、在玻璃瓶中于4 48 8 C C保存较稳定。保存较稳定。（4 4）硫柳汞钠盐）硫柳汞钠盐 又称乙基汞硫代水杨酸钠，本品为剧又称乙基汞硫代水杨酸钠，本品为剧毒品，能溶于水和醇，在空气中稳定，在日光下不稳定。毒品，能溶于水和醇，在空气中稳定，在日光下不稳定。对细菌、霉菌和病毒有一定的灭活作用，用于灭活疫苗的对细菌、霉菌和病毒有一定的灭活作用，用于灭活疫苗的抑菌剂、消毒剂或灭活剂，常用终浓度为抑菌剂、消毒剂或灭活剂，常用终浓度为0.02%0.02%0.01%0.01%。3.13.1、 灭活剂灭活剂（5 5）苯酚）苯酚 又名石炭酸，为羟基与芳烃族（苯环与稠丙又名石炭酸，为羟基与芳烃族（苯环与稠丙环）直
62、接连接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品环）直接连接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品有毒、腐蚀性及特殊气味，其灭活机制是使微生物蛋白质有毒、腐蚀性及特殊气味，其灭活机制是使微生物蛋白质变性和抑制特异酶系统，使其失去活性或感染性。常作为变性和抑制特异酶系统，使其失去活性或感染性。常作为细菌灭活疫苗的抑菌剂、消毒剂或灭活剂，用量为细菌灭活疫苗的抑菌剂、消毒剂或灭活剂，用量为0.30.30.5%0.5%。（6 6）结晶紫）结晶紫 别名甲基青莲或甲紫，为一种碱性染料，别名甲基青莲或甲紫，为一种碱性染料，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其阳离子与微生易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其阳
63、离子与微生物蛋白质带阴电的羟基形成弱电力的化合物，防碍微生物物蛋白质带阴电的羟基形成弱电力的化合物，防碍微生物的正常代谢，也可扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太的正常代谢，也可扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太高，不利于微生物的增殖。高，不利于微生物的增殖。3.23.2、灭活方法、灭活方法1 1）物理灭活方法）物理灭活方法 有热灭活、射线照射灭活和超声波有热灭活、射线照射灭活和超声波裂解等方法。采用热灭活方法牛副结核灭活疫苗和草裂解等方法。采用热灭活方法牛副结核灭活疫苗和草鱼出血病灭活疫苗。超声波裂解应放冰浴中间断进行，鱼出血病灭活疫苗。超声波裂解应放冰浴中间断进行，以免升温过高影响微生物的抗
64、原性。以免升温过高影响微生物的抗原性。60Co60Co照射处理，照射处理，应根据被照射物的容量大小选择照射物与钴源的距离应根据被照射物的容量大小选择照射物与钴源的距离和剂量。和剂量。2 2）化学灭活方法）化学灭活方法 早在早在2020世纪初，就开始用甲醛减毒世纪初，就开始用甲醛减毒制备破伤风类毒素，之后有用甲醛或苯酚灭活制成犬制备破伤风类毒素，之后有用甲醛或苯酚灭活制成犬瘟热疫苗。瘟热疫苗。2020世纪世纪3030年代，用结晶紫成功地研制出猪年代，用结晶紫成功地研制出猪瘟疫苗。瘟疫苗。19571957年，采用年，采用 丙烯内脂研制成功了口蹄疫丙烯内脂研制成功了口蹄疫灭活疫苗等。灭活疫苗等。4
65、4、佐剂配制、佐剂配制4.14.1、佐剂作用、佐剂作用 对抗原的作用对抗原的作用 佐剂吸附抗原后增加抗原的表佐剂吸附抗原后增加抗原的表面积，并改变活性基因的构型，因而增强抗原的免面积，并改变活性基因的构型，因而增强抗原的免疫原性；佐剂和抗原被巨噬细胞吞噬，对抗原加工疫原性；佐剂和抗原被巨噬细胞吞噬，对抗原加工处理，赋予较强的免疫原性，增强处理，赋予较强的免疫原性，增强T T细胞和细胞和B B细胞的细胞的协同作用；延长抗原在组织内的贮存时间，是抗原协同作用；延长抗原在组织内的贮存时间，是抗原缓慢降解和缓慢释放。缓慢降解和缓慢释放。4.14.1、佐剂作用、佐剂作用对机体的作用对机体的作用 引起巨噬
66、细胞、淋巴细胞及浆细胞等细胞引起巨噬细胞、淋巴细胞及浆细胞等细胞浸润，促进其繁殖，增强其活性；加速淋巴细胞的转化成浸润，促进其繁殖，增强其活性；加速淋巴细胞的转化成效应细胞；增加细胞膜的活性和胞浆变化，分泌辅助性因效应细胞；增加细胞膜的活性和胞浆变化，分泌辅助性因子；改变细胞功能，巨噬细胞表现为数量增多、膜表面积子；改变细胞功能，巨噬细胞表现为数量增多、膜表面积增大、产生大量辅助因子和前列腺素等调节因子，增大、产生大量辅助因子和前列腺素等调节因子，T T细胞细胞和和B B细胞表现为数目增多、进入细胞增殖周期，膜表面成细胞表现为数目增多、进入细胞增殖周期，膜表面成分发生改变，产生大量辅助因子（分
67、发生改变，产生大量辅助因子（LKLK），），B B细胞则分化为细胞则分化为浆细胞，分泌大量的抗体。浆细胞，分泌大量的抗体。4.24.2、佐剂标准、佐剂标准无致癌或辅助致癌作用，不能诱导或促进肿瘤形成；无致癌或辅助致癌作用，不能诱导或促进肿瘤形成；无毒性，纯度高，注射、口服等对动物安全，无任何毒、无毒性，纯度高，注射、口服等对动物安全，无任何毒、副作用；副作用；符合相关的质量标准；符合相关的质量标准；具有一定的吸附力；具有一定的吸附力；能在动物体内降解吸收，不易在组织中长期存留而诱发组能在动物体内降解吸收，不易在组织中长期存留而诱发组织损伤；织损伤；不诱发自身超敏反应及与血清抗体结合形成有害的免
68、疫复不诱发自身超敏反应及与血清抗体结合形成有害的免疫复合物；合物；不含有与动物发生交叉反应的抗原物质；不含有与动物发生交叉反应的抗原物质；性能稳定，佐剂抗原混合物储存后不分解、不变质、不产性能稳定，佐剂抗原混合物储存后不分解、不变质、不产生有害物质。生有害物质。4.34.34.34.3、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型1 1）不溶性铝盐佐剂）不溶性铝盐佐剂 包括氢氧化铝胶、各种明矾和磷酸包括氢氧化铝胶、各种明矾和磷酸铝等，与抗原混合后成为凝胶状态，注射动物后可较长期铝等，与抗原混合后成为凝胶状态，注射动物后可较长期存留在机体内，持续释放抗原，显著提高抗体滴度。存留在机体内，持续释
69、放抗原，显著提高抗体滴度。 这这类佐剂在兽用生物制品中广泛采用，类佐剂在兽用生物制品中广泛采用，规程规程现有的灭活现有的灭活疫苗中大多数用氢氧化铝胶作为佐剂，如牛多杀性巴氏杆疫苗中大多数用氢氧化铝胶作为佐剂，如牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗等。铝胶的质量对产品菌病灭活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗等。铝胶的质量对产品的质量有直接影响，因此的质量有直接影响，因此规程规程中明确规定了氢氧化铝中明确规定了氢氧化铝胶质量标准。胶质量标准。2 2）油佐剂）油佐剂 早期有弗氏佐剂，以羊毛脂为乳化剂，具有亲油亲水早期有弗氏佐剂，以羊毛脂为乳化剂，具有亲油亲水性，乳化作用较好，但制出的乳剂非常粘稠。国外
70、所用的性，乳化作用较好，但制出的乳剂非常粘稠。国外所用的油佐剂中广泛采用的是矿物油和缩水甘露醇单油酸酯油佐剂中广泛采用的是矿物油和缩水甘露醇单油酸酯（ArlacelArlacel A A）。国内广泛选用注射白油、司本）。国内广泛选用注射白油、司本-80-80和吐温和吐温-80-80作为油佐剂。作为油佐剂。 规程规程中明确规定了注射白油（轻质矿物油）的质中明确规定了注射白油（轻质矿物油）的质量标准，要求其性状（相对密度、粘度）、酸度、重金属、量标准，要求其性状（相对密度、粘度）、酸度、重金属、铅、砷、稠环芳烃、固形石蜡及易碳化物等项检验均应符铅、砷、稠环芳烃、固形石蜡及易碳化物等项检验均应符合规
71、定。合规定。 乳化剂不同、矿物油不同、乳化剂配合比例不同及乳乳化剂不同、矿物油不同、乳化剂配合比例不同及乳化方法不同，均影响着乳剂的性状和稳定性。目前常用的化方法不同，均影响着乳剂的性状和稳定性。目前常用的剂型为油包水和水包油包水型。剂型为油包水和水包油包水型。4.34.34.34.3、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型3 3）蜂胶佐剂）蜂胶佐剂 蜂胶是蜜蜂采集植物分泌的树脂，混入蜜蜂胶是蜜蜂采集植物分泌的树脂，混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉和其他一些有机与无机蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉和其他一些有机与无机物的一种天然物质，具有广谱的生物活性。蜂胶作为疫苗物的一种天然物质
72、，具有广谱的生物活性。蜂胶作为疫苗佐剂需进行纯化，蜂胶佐剂具有良好的免疫增强作用，能佐剂需进行纯化，蜂胶佐剂具有良好的免疫增强作用，能增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。特异性和非特异性免疫力。4.34.3、佐剂的类型、佐剂的类型4 4）人工合成佐剂）人工合成佐剂 研究最多的属胞壁酰二肽（研究最多的属胞壁酰二肽（MDPMDP）及其）及其衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多种衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多种MDPMDP的类似物的类似物和衍生物，这类佐剂和抗原形成油包水乳剂，接种动物具和衍生物，这类佐剂和
73、抗原形成油包水乳剂，接种动物具有有效的佐剂活性，但作为水溶液接种动物后，迅速排出，有有效的佐剂活性，但作为水溶液接种动物后，迅速排出，其佐剂活性受到限制。海藻糖合成衍生物有海藻糖其佐剂活性受到限制。海藻糖合成衍生物有海藻糖-6-6，6-6-双霉菌酸酯（双霉菌酸酯（TDMTDM），又称索状因子，最初从分枝杆），又称索状因子，最初从分枝杆菌细胞中发现。菌细胞中发现。TDMTDM有多种生物学活性，抗感染和抗肿瘤。有多种生物学活性，抗感染和抗肿瘤。4.34.34.34.3、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型、佐剂的类型5 5）微生物及其代谢产物佐剂）微生物及其代谢产物佐剂 为细菌的菌体成分，具有为细菌
74、的菌体成分，具有明显的佐剂作用。如革兰氏阴性菌外膜脂多糖（明显的佐剂作用。如革兰氏阴性菌外膜脂多糖（LPSLPS）、）、分枝菌的胞壁成分、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸（分枝菌的胞壁成分、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸（LTALTA）、）、蛋白毒素等。蛋白毒素等。 6 6）免疫刺激复合物佐剂（）免疫刺激复合物佐剂（ISCOMISCOM） 是由两歧性抗原与是由两歧性抗原与QuilQuil A A和胆固醇和胆固醇1 1：1 1：1 1的分子混匀共价结合而成的一种的分子混匀共价结合而成的一种较高免疫活性的脂质小泡。较高免疫活性的脂质小泡。QuilQuil A A是从皂树皮提取的一种是从皂树皮提取的一种糖苷，纯化的糖
75、苷，纯化的QuilQuil A A能与病毒被膜蛋白或细菌和寄生虫的能与病毒被膜蛋白或细菌和寄生虫的外膜蛋白的疏水基结合。外膜蛋白的疏水基结合。ISCOMISCOM现已广泛用于多种细菌、现已广泛用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗。病毒和寄生虫病的疫苗。 4.34.3、佐剂的类型、佐剂的类型7 7）细胞因子类佐剂）细胞因子类佐剂 多种细胞因子是有效的免疫多种细胞因子是有效的免疫增强剂，能增强由病毒、细菌和寄生虫疫苗产生增强剂，能增强由病毒、细菌和寄生虫疫苗产生的保护作用。这类细胞因子主要有白细胞介素的保护作用。这类细胞因子主要有白细胞介素-2-2、白细胞介素白细胞介素-1-1、 - -干扰素及白细
76、胞介素干扰素及白细胞介素-12-12。8 8）其它佐剂）其它佐剂 这类佐剂主要有非离子阻断共聚物这类佐剂主要有非离子阻断共聚物表面活性剂、核酸及其类似物佐剂和左旋咪唑等。表面活性剂、核酸及其类似物佐剂和左旋咪唑等。 4.4 4.4 制苗工艺制苗工艺 1 1）用铝胶作佐剂）用铝胶作佐剂 配苗时，将灭活的菌液和氢氧化铝胶配苗时，将灭活的菌液和氢氧化铝胶以一定的比例（以一定的比例（3 3：1919：1 1）混合，再加入适量的硫柳汞）混合，再加入适量的硫柳汞和苯酚充分振荡而成。用明矾作佐剂配苗时，按灭活的菌和苯酚充分振荡而成。用明矾作佐剂配苗时，按灭活的菌液量加入明矾溶液液量加入明矾溶液1 12 2，
77、充分振荡，然后沉淀而成。，充分振荡，然后沉淀而成。2 2）用油佐剂配苗，以白油、司本和硬脂酸铝为油相，以）用油佐剂配苗，以白油、司本和硬脂酸铝为油相，以含含24%24%吐温的抗原液为水相，按水相与油相吐温的抗原液为水相，按水相与油相1 1：1111：4 4（V/VV/V）的比例配制。在胶体磨或乳剂缸内配制成油包水）的比例配制。在胶体磨或乳剂缸内配制成油包水或水包油包水疫苗。或水包油包水疫苗。3 3）蜂胶作佐剂）蜂胶作佐剂 配苗时，在灭活的抗原液（病毒液或菌配苗时，在灭活的抗原液（病毒液或菌液）中加入蜂胶乙醇浸液，使每液）中加入蜂胶乙醇浸液，使每mlml抗原液中含蜂胶抗原液中含蜂胶10mg10m
78、g，变加变振荡，成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。变加变振荡，成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。（二）活疫苗制备技术（二）活疫苗制备技术 弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱（无）毒菌（毒）株或异种菌（毒）株或基因工程弱毒疫（无）毒菌（毒）株或异种菌（毒）株或基因工程弱毒疫苗株生产的，对原宿主动物无致病性或引起亚临床感染，苗株生产的，对原宿主动物无致病性或引起亚临床感染，但能使接种动物产生免疫力，以抵抗由该种病原引起的疾但能使接种动物产生免疫力，以抵抗由该种病原引起的疾病。弱毒疫苗又称活疫苗，大多数采用冷冻干燥技术生产病。弱毒疫苗又称活疫苗，大多数采
79、用冷冻干燥技术生产成冻干疫苗，少数为液体（湿）疫苗。弱毒疫苗具有用量成冻干疫苗，少数为液体（湿）疫苗。弱毒疫苗具有用量少、成本低、免疫力产生快、免疫期长等优点。少、成本低、免疫力产生快、免疫期长等优点。 1 1、菌（毒）种的选育、菌（毒）种的选育1.11.1、 菌种的选育菌种的选育1 1） 自然弱毒菌株自然弱毒菌株 自然界中存在着具有免疫原性的自自然界中存在着具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生产活疫苗。如布鲁氏菌病猪然弱毒株，可以用于生产活疫苗。如布鲁氏菌病猪2 2号株号株就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。2 2） 人工传代致
80、弱菌株人工传代致弱菌株 在培养基中或非宿主体内等连续在培养基中或非宿主体内等连续传代减弱病原的致病性，以制作活疫苗。如致弱的兔、山传代减弱病原的致病性，以制作活疫苗。如致弱的兔、山羊、绵羊牛传染性胸膜肺炎菌株、布鲁氏菌羊型羊、绵羊牛传染性胸膜肺炎菌株、布鲁氏菌羊型5 5号菌株、号菌株、乳兔肺致弱的猪支原体肺炎疫苗株等。乳兔肺致弱的猪支原体肺炎疫苗株等。1.11.1、 菌种的选育菌种的选育3 3） 改变培养环境致弱菌株改变培养环境致弱菌株 在体外培养传代病原菌时，在体外培养传代病原菌时，某些突变株在正常环境中不易生长发育而死亡，但改变培某些突变株在正常环境中不易生长发育而死亡，但改变培养温度（提
81、高或降低），或在培养基中加入有抑制病原的养温度（提高或降低），或在培养基中加入有抑制病原的化学物质，有利于某些突变株的发育，如在培养基中加醋化学物质，有利于某些突变株的发育，如在培养基中加醋酸铊分离培育出了抗醋酸铊的猪副伤寒沙门氏菌和马流产酸铊分离培育出了抗醋酸铊的猪副伤寒沙门氏菌和马流产沙门氏菌弱毒菌株。沙门氏菌弱毒菌株。4 4） 诱变菌株诱变菌株 射线处理病原微生物或在体外的培养基中射线处理病原微生物或在体外的培养基中加入化学诱变剂，都能提高微生物的突变率，从而有助于加入化学诱变剂，都能提高微生物的突变率，从而有助于弱毒株的培育。如用黄色素培养基培育猪丹毒弱毒菌株。弱毒株的培育。如用黄色素
82、培养基培育猪丹毒弱毒菌株。许多疫苗的温度敏感株（许多疫苗的温度敏感株（tsts）都经过诱变选择的。）都经过诱变选择的。1.21.2、毒种的选育、毒种的选育 1 1） 自然弱毒株自然弱毒株 选用自然界中具有免疫原性的天然弱选用自然界中具有免疫原性的天然弱毒株，可以用于生产动物用活疫苗。如毒株，可以用于生产动物用活疫苗。如NDVLaNDVLa SotaSota株和株和B1B1株，鸡马立克氏病血清株，鸡马立克氏病血清IIII型（型（SB1SB1、Z4Z4）毒株，已成功地）毒株，已成功地用于制作活疫苗。用于制作活疫苗。2 2） 同属异种的微生物同属异种的微生物 选择与病原同属不同种，但具选择与病原同属
83、不同种，但具有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作为有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作为疫苗株，如火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病，山羊痘细胞疫苗株，如火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病，山羊痘细胞致弱毒株预防绵羊痘和羊接触传染性脓疱皮炎等。致弱毒株预防绵羊痘和羊接触传染性脓疱皮炎等。1.21.2、毒种的选育、毒种的选育3 3） 人工传代致弱毒株人工传代致弱毒株 在培组织或细胞培养中、在培组织或细胞培养中、鸡胚内或非宿主体内等连续传代减弱病原的致病鸡胚内或非宿主体内等连续传代减弱病原的致病性，以制作活疫苗，如猪瘟活疫苗。性，以制作活疫苗，如猪瘟活疫苗。4 4） 基因工程疫苗株的构
84、建基因工程疫苗株的构建 利用基因工程技术利用基因工程技术改造微生物，构建基因工程弱毒活疫苗株。改造微生物，构建基因工程弱毒活疫苗株。1 1）基）基因缺失疫苗株因缺失疫苗株 2 2）重组载体疫苗株。）重组载体疫苗株。1.31.3、菌（毒）种的鉴定、菌（毒）种的鉴定1 1） 免疫抑制试验免疫抑制试验 当疫苗毒可能存在免疫抑制当疫苗毒可能存在免疫抑制作用时，如鸡传染性法氏囊病、猪繁殖与呼吸综作用时，如鸡传染性法氏囊病、猪繁殖与呼吸综合症等，应对毒种进行免疫抑制试验。靶动物接合症等，应对毒种进行免疫抑制试验。靶动物接种菌（毒）种后，与未接种的动物同时观察免疫种菌（毒）种后，与未接种的动物同时观察免疫器
85、官或组织的变化，或同时再免疫接种其它疫苗，器官或组织的变化，或同时再免疫接种其它疫苗，观察两组的疫苗抗体产生情况和观察两组的疫苗抗体产生情况和/ /或抗强毒攻击的或抗强毒攻击的保护情况。保护情况。1.31.3、菌（毒）种的鉴定、菌（毒）种的鉴定2 2） 毒力返强试验毒力返强试验 用基础菌（毒）种较早代次，用基础菌（毒）种较早代次，按实际接种途径大剂量接种各种最易感日龄的靶按实际接种途径大剂量接种各种最易感日龄的靶动物，一定时间后，采集含菌（毒）靶组织制成动物，一定时间后，采集含菌（毒）靶组织制成悬液，再接种另一组易感的靶动物，如此至少传悬液，再接种另一组易感的靶动物，如此至少传5 5代次，观察
86、每次传代动物的反应情况，并比较第代次，观察每次传代动物的反应情况，并比较第一代和最后一代动物的反应和毒力或致病性增强一代和最后一代动物的反应和毒力或致病性增强的趋势情况。的趋势情况。3 3） 外源病毒检验外源病毒检验禽源种毒禽源种毒1) 1) 鸡胚接种检查法鸡胚接种检查法 将种毒中和后分别经尿囊腔和绒毛尿囊膜途径将种毒中和后分别经尿囊腔和绒毛尿囊膜途径接种接种9 91111日龄的日龄的SPFSPF鸡胚鸡胚1010枚，鸡胚应发育正常，绒毛尿囊膜无病变，枚，鸡胚应发育正常，绒毛尿囊膜无病变，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集阴性。鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集阴性。2) 2) 鸡接种检查法鸡接种检查法 将种毒接种
87、适宜日龄的将种毒接种适宜日龄的SPFSPF雏鸡雏鸡2020只，点眼、滴鼻只，点眼、滴鼻接种接种1010头份；肌肉注射头份；肌肉注射100100头份，接种后头份，接种后2121日，重复接种日，重复接种1 1次，第一次次，第一次接种后接种后4242日采血，测定相关病原的抗体。观察期间不应由种毒引起的日采血，测定相关病原的抗体。观察期间不应由种毒引起的特异性局部或全身和呼吸道症状或死亡。特异性局部或全身和呼吸道症状或死亡。3) 3) 细胞接种检查法细胞接种检查法 将种毒中和后接种将种毒中和后接种CEFCEF后，培养后，培养5 57 7日，不应有日，不应有特异的细胞病变（特异的细胞病变（CPECPE）
88、产生，并不应出现吸附红细胞现象。此外禽）产生，并不应出现吸附红细胞现象。此外禽白血病病毒的检验（白血病病毒的检验（COFELCOFEL或或ELISAELISA）和）和REVREV（IFAIFA）应为阴性。）应为阴性。3 3） 外源病毒检验外源病毒检验非禽源种毒非禽源种毒 1) 1) 荧光抗体检查法荧光抗体检查法 先用相应的阳性血清中和种毒后，接种细胞连先用相应的阳性血清中和种毒后，接种细胞连传传2 2代，视被检的种毒不同，选用不同的细胞和不同的荧光抗体。经代，视被检的种毒不同，选用不同的细胞和不同的荧光抗体。经荧光抗体染色后，不应出现特异的荧光。荧光抗体染色后，不应出现特异的荧光。2) 2)
89、绿猴肾绿猴肾( (verovero) )传代细胞检查法传代细胞检查法 将中和后的接种将中和后的接种verovero细胞，连传细胞，连传2 2代，不应出现代，不应出现CPECPE，同时进行红细胞（豚鼠、鸡和人红细胞混合物），同时进行红细胞（豚鼠、鸡和人红细胞混合物）吸附试验和荧光抗体试验，均应为阴性。吸附试验和荧光抗体试验，均应为阴性。3) 3) 致细胞病变和红细胞吸附试验检查法致细胞病变和红细胞吸附试验检查法 经接种传代培养经接种传代培养7 7日的细胞，日的细胞，用适宜染色液对细胞单层进行染色，检查后不应出现包涵体、巨细胞用适宜染色液对细胞单层进行染色，检查后不应出现包涵体、巨细胞或其它由外源
90、病原引起的或其它由外源病原引起的CPECPE。此外不应出现红细胞吸附现象。此外不应出现红细胞吸附现象。2、制苗用主要原材料、制苗用主要原材料1 1）SPFSPF鸡或鸡胚鸡或鸡胚 所有禽用病毒性活疫苗及其种毒制备所所有禽用病毒性活疫苗及其种毒制备所用的鸡胚必须符合用的鸡胚必须符合兽用生物制品质量标准兽用生物制品质量标准中有关标准，中有关标准，即必须来源于即必须来源于SPFSPF鸡。生产禽用疫苗用鸡。生产禽用疫苗用SPFSPF鸡应在隔离环境鸡应在隔离环境中饲养，使用全价营养的无菌饲料。必须经中饲养，使用全价营养的无菌饲料。必须经1717种病原（种病原（1313种病毒，种病毒，2 2种细菌，种细菌，
91、2 2种支原体的检测，结果阴性方可使用。种支原体的检测，结果阴性方可使用。2 2）试验动物）试验动物 当采用动物及其动物组织生产病毒性活疫当采用动物及其动物组织生产病毒性活疫苗时，要求制苗用动物应按照实验动物的来源、品种、品苗时，要求制苗用动物应按照实验动物的来源、品种、品系不同、动物级别不同和实验目的不同，分开饲养，饲喂系不同、动物级别不同和实验目的不同，分开饲养，饲喂质量合格的全价饲料。质量合格的全价饲料。农业部关于加强兽用生物制品生产农业部关于加强兽用生物制品生产农业部关于加强兽用生物制品生产农业部关于加强兽用生物制品生产检验原料监督管理的通知检验原料监督管理的通知检验原料监督管理的通知
92、检验原料监督管理的通知 (2006.11.22 (2006.11.22 (2006.11.22 (2006.11.22 农医发农医发农医发农医发2006l02006l02006l02006l0号令号令号令号令) ) ) ) 20082008年年1 1月月1 1日起，农业部将对日起，农业部将对GMPGMP疫苗生产企业疫苗生产企业疫苗菌疫苗菌( (毒毒) )种制备与鉴定、活疫苗生产以及疫苗种制备与鉴定、活疫苗生产以及疫苗检验使用无特定病原体检验使用无特定病原体(SPF(SPF级级) )鸡、鸡胚情况进行鸡、鸡胚情况进行全面监督检查。对达不到标准要求的，将根据全面监督检查。对达不到标准要求的，将根据兽
93、药管理条例兽药管理条例规定进行处理。规定进行处理。3 3）其它原材料）其它原材料血清、化学试剂和生物制剂血清、化学试剂和生物制剂 细胞培养用血清能提供人工细胞培养用血清能提供人工合成培养液必须的物质，对细胞附着和保护有明显的作用，合成培养液必须的物质，对细胞附着和保护有明显的作用，各种动物的血清都能应用，实验室常用新生犊牛血清，既各种动物的血清都能应用，实验室常用新生犊牛血清，既可大量采集，又有良好的细胞培养效果。也可应用马血清、可大量采集，又有良好的细胞培养效果。也可应用马血清、大牛血清、绵羊血清或鸡、兔血清等。用成年动物血清培大牛血清、绵羊血清或鸡、兔血清等。用成年动物血清培养细胞，效果大
94、都不如犊牛血清，常含有抗病毒抗体或其养细胞，效果大都不如犊牛血清，常含有抗病毒抗体或其它抑制病毒的物质，抑制病毒的生长。它抑制病毒的物质，抑制病毒的生长。3、疫苗原液的繁殖、疫苗原液的繁殖1 1）制苗用菌液的制备）制苗用菌液的制备 液体培养基按培养基量的一定比例接入二级液体培养基按培养基量的一定比例接入二级种子菌液，在种子菌液，在3737 C C左右摇动培养或通气培养，当菌液混浊或左右摇动培养或通气培养，当菌液混浊或pHpH下降下降时，停止培养，冷却后收获菌液或离心后收获菌泥，适当稀释后置时，停止培养，冷却后收获菌液或离心后收获菌泥，适当稀释后置2828 C C保存备用。固体培养基培养时，将检
95、验合格的二级种子接种保存备用。固体培养基培养时，将检验合格的二级种子接种于琼脂培养基上布匀，置适宜的温度下培养一定时间，经检查合格后于琼脂培养基上布匀，置适宜的温度下培养一定时间，经检查合格后加入稳定剂将菌苔洗下，过滤，加入稳定剂将菌苔洗下，过滤，2828 C C静置沉淀。静置沉淀。2 2）制苗用病毒液的制备）制苗用病毒液的制备 将一定量的生产毒种接种动物、组织、鸡将一定量的生产毒种接种动物、组织、鸡胚或细胞，每天观察接种动物的反应，接种鸡胚的观察鸡胚的死亡或胚或细胞，每天观察接种动物的反应，接种鸡胚的观察鸡胚的死亡或感染情况，接种细胞的既可静止培养，也可转瓶培养，每天观察细胞感染情况，接种细
96、胞的既可静止培养，也可转瓶培养，每天观察细胞病变，待病毒繁殖充分后收获含毒器官、组织或含毒细胞液，收获的病变，待病毒繁殖充分后收获含毒器官、组织或含毒细胞液，收获的含毒组织或细胞液。含毒组织或细胞液。4 4、疫苗配制与冻干、疫苗配制与冻干1 1）液体（湿）苗的配制）液体（湿）苗的配制 疫苗原液或半成品检验合格后，疫苗原液或半成品检验合格后，将菌（毒）液混合，按规定头份定量分装，每头份疫苗不将菌（毒）液混合，按规定头份定量分装，每头份疫苗不得低于规定的最低标准。得低于规定的最低标准。 2 2）冻干苗的配制）冻干苗的配制 按疫苗原液量加入一定比例的保护按疫苗原液量加入一定比例的保护（稳定）剂，病毒
97、性组织苗需预先制成乳剂后，加入一定（稳定）剂，病毒性组织苗需预先制成乳剂后，加入一定比例的保护（稳定）剂，充分混合后，按规定头份定量分比例的保护（稳定）剂，充分混合后，按规定头份定量分装，分装过程中应随时振摇，分装结束后迅速进行冷冻真装，分装过程中应随时振摇，分装结束后迅速进行冷冻真空干燥。冻干后在真空状态下在冻干柜内自动压塞，出箱空干燥。冻干后在真空状态下在冻干柜内自动压塞，出箱后压上铝帽。后压上铝帽。5、疫苗保护剂、疫苗保护剂1 1）冻干疫苗保护剂（稳定剂）冻干疫苗保护剂（稳定剂） 防止疫苗在冻干过程中活性物质失去结构水防止疫苗在冻干过程中活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶；保护微生物
98、中活性物质的活性与抗原性；降低细胞及阻止结构水形成结晶；保护微生物中活性物质的活性与抗原性；降低细胞内外的渗透压差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥状态下的活力和复苏时迅速内外的渗透压差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥状态下的活力和复苏时迅速恢复活力；对疫苗的免疫效果无影响；对微生物的保护性能（尤其是耐热性恢复活力；对疫苗的免疫效果无影响；对微生物的保护性能（尤其是耐热性能）良好；冻干产品的物理性状（外观、色泽、溶解性等）符合要求。常用能）良好；冻干产品的物理性状（外观、色泽、溶解性等）符合要求。常用的有：的有：5%5%蔗糖（乳糖）脱脂乳、明胶蔗糖、蔗糖（乳糖）脱脂乳、明胶蔗糖、40%40%蔗糖明胶、聚
99、乙烯吡咯烷酮乳蔗糖明胶、聚乙烯吡咯烷酮乳糖和糖和SPGASPGA。2 2）液体疫苗保护剂）液体疫苗保护剂 甘油甘油 甘油作为保护剂广泛用于活疫苗，如甘油作为保护剂广泛用于活疫苗，如5050甘油盐水，可以杀灭大甘油盐水，可以杀灭大多数细菌，而病毒却可存活多数细菌，而病毒却可存活 二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO） 二甲基亚砜可以减少冷冻过程中微小冰晶的形成，二甲基亚砜可以减少冷冻过程中微小冰晶的形成，因而保护冷冻的病毒。因而保护冷冻的病毒。不同微生物保护剂的主要成分不同微生物保护剂的主要成分微生物类型微生物类型冻干保护剂主要成分冻干保护剂主要成分细菌细菌10%10%蔗糖、蔗糖、5%5%蔗
100、糖脱脂乳、蔗糖脱脂乳、5%5%蔗糖、蔗糖、1.5%1.5%明胶；明胶；1020%1020%脱脂乳、含脱脂乳、含1%1%谷氨酸钠的谷氨酸钠的10%10%脱脂乳；脱脂乳；5%5%牛血清白蛋白的蔗糖；灭活马血清等牛血清白蛋白的蔗糖；灭活马血清等厌氧菌厌氧菌含含0.1%0.1%谷氨酸钠的谷氨酸钠的10%10%脱脂乳，脱脂乳，10 %10 %脱脂乳，脱脂乳，7.5%7.5%葡萄糖血清等葡萄糖血清等病毒病毒常用下列物质的不同浓度或按不同比例混合组成冻干保护剂：常用下列物质的不同浓度或按不同比例混合组成冻干保护剂：明胶、血清、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡明胶、血清、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、
101、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、乳酸钙、海萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、乳酸钙、海藻糖、硫脲等藻糖、硫脲等支原体支原体50%50%马血清、马血清、1%1%牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、5%5%脱脂乳、脱脂乳、7.5%7.5%葡萄糖马血清等葡萄糖马血清等立克次体立克次体10%10%脱脂乳脱脂乳酵母菌酵母菌马血清或含马血清或含7.5%7.5%葡萄糖马血清、含葡萄糖马血清、含1%1%谷氨酸钠的谷氨酸钠的10%10%脱脂乳等脱脂乳等（三）疫苗质量改进新技术（三）疫苗质量改进新技术 1、疫苗质量中问题、疫苗质量中问题 弱毒活疫苗：冻干保护剂；毒力偏强
102、；外源病原弱毒活疫苗：冻干保护剂；毒力偏强；外源病原污染。污染。 灭活疫苗灭活疫苗:抗原繁殖、浓缩和纯化技术落后，抗原抗原繁殖、浓缩和纯化技术落后，抗原纯度不够，副反应太大；油佐剂灭活苗稳定性差，纯度不够，副反应太大；油佐剂灭活苗稳定性差，副反应大；免疫效果差。副反应大；免疫效果差。 2 2、改进新技术、改进新技术1 1）分子设计与基因工程技术）分子设计与基因工程技术 亚单位疫苗、基因缺失疫亚单位疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、苗、活载体疫苗、DNADNA疫苗转基因植物疫苗等。疫苗转基因植物疫苗等。2 2）抗原缓释技术）抗原缓释技术 将抗原制成聚合物，增加抗原效能、将抗原制成聚合物，增加抗原效
103、能、延长疫苗免疫期。延长疫苗免疫期。3 3）新型免疫佐剂）新型免疫佐剂 减少副反应，提高细胞免疫调节作用。减少副反应，提高细胞免疫调节作用。4 4）新型生物发酵技术）新型生物发酵技术 传统的生物发酵罐变为生物反应传统的生物发酵罐变为生物反应器，实现了程序化操作。器，实现了程序化操作。5 5）现代细胞工程技术）现代细胞工程技术 利用细胞反应器进行细胞微载体利用细胞反应器进行细胞微载体培养和悬浮培养。培养和悬浮培养。三、三、 兽用诊断试剂的制备兽用诊断试剂的制备 兽用诊断制品中使用的微生物都具有抗原性，根兽用诊断制品中使用的微生物都具有抗原性，根据抗原与抗体特异性结合或核酸碱基配对的原理，据抗原与
104、抗体特异性结合或核酸碱基配对的原理，利用微生物及其代谢产物或动物血液及组织材料利用微生物及其代谢产物或动物血液及组织材料制成的可用于畜禽疾病诊断的制品称为诊断用生制成的可用于畜禽疾病诊断的制品称为诊断用生物制品，包括诊断抗原、诊断血清、标记抗体及物制品，包括诊断抗原、诊断血清、标记抗体及核酸探针等。核酸探针等。（一）诊断抗原的制备（一）诊断抗原的制备1 1、诊断抗原类型、诊断抗原类型 按性质可将诊断抗原分颗粒性按性质可将诊断抗原分颗粒性抗原和可溶性抗原。按照诊断试验的种类可将诊抗原和可溶性抗原。按照诊断试验的种类可将诊断抗原分为凝集反应抗原、补体结合反应抗原、断抗原分为凝集反应抗原、补体结合反
105、应抗原、酶联免疫吸附试验抗原、中和试验抗原、琼扩试酶联免疫吸附试验抗原、中和试验抗原、琼扩试验抗原、变态反应抗原及对流免疫电泳抗原等。验抗原、变态反应抗原及对流免疫电泳抗原等。1 1、诊断抗原类型、诊断抗原类型1 1）凝集反应抗原）凝集反应抗原 此类抗原多为颗粒性抗原，在有电解此类抗原多为颗粒性抗原，在有电解质的情况下，与特异性抗体结合形成肉眼可见的凝集块，质的情况下，与特异性抗体结合形成肉眼可见的凝集块，称凝集反应。参与凝集反应的抗原为凝集原，抗体为凝集称凝集反应。参与凝集反应的抗原为凝集原，抗体为凝集素。凝集反应有直接凝集反应和间接凝集反应。直接凝集素。凝集反应有直接凝集反应和间接凝集反应
106、。直接凝集试验只适用于不产生自凝现象的细菌，所以应用面较窄。试验只适用于不产生自凝现象的细菌，所以应用面较窄。间接凝集反应是将病原微生物的可溶性抗原物质吸附在颗间接凝集反应是将病原微生物的可溶性抗原物质吸附在颗粒性载体如红细胞、胶乳颗粒、炭素颗粒等的表面，制备粒性载体如红细胞、胶乳颗粒、炭素颗粒等的表面，制备成可产生凝集反应的颗粒性抗原成分。成可产生凝集反应的颗粒性抗原成分。用红细胞作抗原载用红细胞作抗原载体的凝集反应称间接血凝试验。相反将免疫球蛋白连接到体的凝集反应称间接血凝试验。相反将免疫球蛋白连接到红细胞的表面，即为反相间接血凝试验。红细胞的表面，即为反相间接血凝试验。2 2）补体结合反
107、应抗原）补体结合反应抗原在补体结合试验中有两个反应系统：即检验系统和指示系在补体结合试验中有两个反应系统：即检验系统和指示系统（溶血系统）。检验系统包括已知的抗原（或抗体）、统（溶血系统）。检验系统包括已知的抗原（或抗体）、被检的抗体（或抗原）和补体。指示系统包括绵羊红细胞、被检的抗体（或抗原）和补体。指示系统包括绵羊红细胞、溶血素和补体。补体是两个系统共用的。溶血素和补体。补体是两个系统共用的。如果检验系统中如果检验系统中抗原与抗体形成复合物，则补体被结合不再游离，随后加抗原与抗体形成复合物，则补体被结合不再游离，随后加入的指示系统不发生溶血现象。反之若抗原与抗体不相应，入的指示系统不发生溶
108、血现象。反之若抗原与抗体不相应，则不能结合补体，补体即参与溶血系统反应，导致溶血现则不能结合补体，补体即参与溶血系统反应，导致溶血现象。根据指示系统的溶血情况可以间接测定特异性抗原与象。根据指示系统的溶血情况可以间接测定特异性抗原与抗体是否存在及其含量，从而对抗原或抗体进行定性或定抗体是否存在及其含量，从而对抗原或抗体进行定性或定量。量。3 3）酶联免疫吸附试验抗原）酶联免疫吸附试验抗原 将抗原或抗体吸附于固相载将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果，包括直接法、间接法、双抗体夹心法、光度计判定
109、结果，包括直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。竞争法等。4 4）中和试验抗原）中和试验抗原 中和试验是一种常用的诊断试验方法，中和试验是一种常用的诊断试验方法，既可用于定性试验，又可用于定量试验。既可用于定性试验，又可用于定量试验。既有固定血清既有固定血清稀释病毒方法（稀释病毒方法（ 法），又有固定病毒法），又有固定病毒稀释血清（稀释血清（ 法）法）。5 5）免疫沉淀试验抗原）免疫沉淀试验抗原 当可溶性抗原与其相应的抗体在当可溶性抗原与其相应的抗体在溶液中或琼脂凝胶中扩散接触时，形成的抗原抗体复合溶液中或琼脂凝胶中扩散接触时，形成的抗原抗体复合物成为肉眼可见的不溶性沉淀物，即为免疫沉淀反应
110、。物成为肉眼可见的不溶性沉淀物，即为免疫沉淀反应。6 6）变态反应抗原）变态反应抗原某些细胞内寄生菌、病毒、真菌、寄生虫等，感某些细胞内寄生菌、病毒、真菌、寄生虫等，感染后可引起以细胞免疫为主的染后可引起以细胞免疫为主的IVIV型变态反应。由型变态反应。由于这种反应具有高度的特异性和敏感性，因此临于这种反应具有高度的特异性和敏感性，因此临床上常利用变态反应作为某些传染病的诊断方法。床上常利用变态反应作为某些传染病的诊断方法。如鼻疽菌素、结核菌素、布氏菌水解素、提纯副如鼻疽菌素、结核菌素、布氏菌水解素、提纯副结核菌素等。结核菌素等。2 2、诊断抗原的制备、诊断抗原的制备基本技术路线包括：选择抗原
111、性良好的菌（毒）株基本技术路线包括：选择抗原性良好的菌（毒）株 生产用菌（毒）种的制备与鉴定生产用菌（毒）种的制备与鉴定 制备细菌抗原用培制备细菌抗原用培养基或制备病毒抗原用细胞或动物等原材料的选择养基或制备病毒抗原用细胞或动物等原材料的选择 细菌（固体或液体）的培养或病毒液的繁殖、收获细菌（固体或液体）的培养或病毒液的繁殖、收获抗原液的灭活抗原液的灭活 抗原的提纯、浓缩抗原的提纯、浓缩 除菌过滤除菌过滤 抗原的检验抗原的检验 抗原的分装与冻干抗原的分装与冻干保存。保存。不同的微生物制备诊断抗原的方法不同，不同的抗原制备不同的微生物制备诊断抗原的方法不同，不同的抗原制备方法也有差异。有些抗原需
112、要较复杂的工艺，如变态反应方法也有差异。有些抗原需要较复杂的工艺，如变态反应抗原、免疫沉淀试验抗原的制备往往需要提纯和浓缩抗原，抗原、免疫沉淀试验抗原的制备往往需要提纯和浓缩抗原，以增加抗原反应的特异性和敏感性。中和试验抗原制备比以增加抗原反应的特异性和敏感性。中和试验抗原制备比较简单，一般不需提纯与浓缩。较简单，一般不需提纯与浓缩。（二）诊断血清的制备（二）诊断血清的制备诊断血清是一类含有特异性抗体、用于诊断或鉴定微生物诊断血清是一类含有特异性抗体、用于诊断或鉴定微生物的生物制剂，包括各种诊断血清、分群血清或分型血清等。的生物制剂，包括各种诊断血清、分群血清或分型血清等。1 1、免疫动物的选
113、择、免疫动物的选择 制备免疫血清的动物多为家兔、豚制备免疫血清的动物多为家兔、豚鼠、马、牛、羊及鸡等。免疫前，须经确认无传染病并健鼠、马、牛、羊及鸡等。免疫前，须经确认无传染病并健康者方可使用。禽类血清有抗补体成分，在制备补体结合康者方可使用。禽类血清有抗补体成分，在制备补体结合试验用抗血清时应选用哺乳动物。试验用抗血清时应选用哺乳动物。2 2、免疫抗原的制备、免疫抗原的制备 制备免疫血清的抗原，多为微生物制备免疫血清的抗原，多为微生物体或其毒素体或其毒素( (类毒素类毒素) )，或其提取物等纯化完全抗原。免疫，或其提取物等纯化完全抗原。免疫抗原的提纯和浓缩，是制出高效价血清的先决条件。抗原的
114、提纯和浓缩，是制出高效价血清的先决条件。3 3、免疫方法和免疫程序、免疫方法和免疫程序免疫原注射多采用皮下或肌肉途径注射，大量抗原注射则免疫原注射多采用皮下或肌肉途径注射，大量抗原注射则以静脉途径较好，但抗毒素免疫则不采用静脉途径，应以以静脉途径较好，但抗毒素免疫则不采用静脉途径，应以背部多点注射为宜。背部多点注射为宜。有一些用球蛋白抗原制备抗抗体血清时，须要加适当佐剂有一些用球蛋白抗原制备抗抗体血清时，须要加适当佐剂注射，如用弗氏完全或不完全佐剂，背部皮下多点注射，注射，如用弗氏完全或不完全佐剂，背部皮下多点注射，第一次免疫加完全佐剂，以后多次免疫只能使用不完全佐第一次免疫加完全佐剂，以后多
115、次免疫只能使用不完全佐剂，隔剂，隔710710天加强免疫一次，可以获得较好的抗抗体血天加强免疫一次，可以获得较好的抗抗体血清。清。4 4、血清采集与提取、血清采集与提取最后一次大剂量注射抗原后最后一次大剂量注射抗原后8 81010天进行第一次采天进行第一次采血。采血量可按动物体重每公斤采血。采血量可按动物体重每公斤采10ml10ml左右。动左右。动物采血应在上午空腹时进行，前一天下午不喂精物采血应在上午空腹时进行，前一天下午不喂精料，只喂草料及水。料，只喂草料及水。3 34 4天后进行第二次采血。天后进行第二次采血。采血后采血后3535天再次注射大量抗原，如此循环进行天再次注射大量抗原，如此循
116、环进行采血及注射抗原。采血及注射抗原。5 5、免疫血清的检验与标化、免疫血清的检验与标化1 1）免疫血清的检验：诊断用血清的检验主要是特异性、）免疫血清的检验：诊断用血清的检验主要是特异性、敏感性和效价的测定。作标记抗体用血清，免疫球蛋白含敏感性和效价的测定。作标记抗体用血清，免疫球蛋白含量应达到一定的绝对值。量应达到一定的绝对值。2 2 ）免疫血清的标化：诊断用阳性血清，特别是分群血清）免疫血清的标化：诊断用阳性血清，特别是分群血清和分型血清等，均须标化成为标准品或参考标准品，有些和分型血清等，均须标化成为标准品或参考标准品，有些还须用国际标准品进行标化，定出国际单位还须用国际标准品进行标化
117、，定出国际单位(1U)(1U)。6 6、标记抗体的制备、标记抗体的制备标记抗体技术主要有荧光抗体技术、免疫酶组化染色技术、标记抗体技术主要有荧光抗体技术、免疫酶组化染色技术、酶联免疫吸附试验、放射免疫测定、免疫胶体金技术等。酶联免疫吸附试验、放射免疫测定、免疫胶体金技术等。猪瘟荧光抗体的制备方法猪瘟荧光抗体的制备方法 将高免血清用饱和硫酸铵盐析将高免血清用饱和硫酸铵盐析法提取免疫球蛋白法提取免疫球蛋白G G（IgGIgG），用），用2 2（W/VW/V）抗体蛋白液按）抗体蛋白液按8080：1 1的重量比与异硫氰酸荧光素（的重量比与异硫氰酸荧光素（FITCFITC）在）在1010 C C左右结左
118、右结合合6 6小时。通过小时。通过SephadexG50SephadexG50柱层析，除去未结合的游离荧柱层析，除去未结合的游离荧光素，测定荧光抗体染色效价和蛋白浓度，蛋白浓度不应光素，测定荧光抗体染色效价和蛋白浓度，蛋白浓度不应超过超过0.125mg/ml0.125mg/ml为合格。为合格。四、兽用生物制品检测技术四、兽用生物制品检测技术（一）兽用生物制品检验技术标准（一）兽用生物制品检验技术标准1 1、兽用活疫苗检验技术标准：、兽用活疫苗检验技术标准：物理性状：液体疫苗应无异物、摇不散的凝块、絮状物、物理性状：液体疫苗应无异物、摇不散的凝块、絮状物、霉团、变质；冻干疫苗无干缩、瓶破裂、瓶口
119、密封不严。霉团、变质；冻干疫苗无干缩、瓶破裂、瓶口密封不严。纯粹检验：所有制品不应污染细菌、霉菌。病毒组织苗如纯粹检验：所有制品不应污染细菌、霉菌。病毒组织苗如有细菌污染，非病原菌每头份不超过有细菌污染，非病原菌每头份不超过1 1个；病毒性活疫个；病毒性活疫苗不应污染支原体和外源病毒，尤其是明确规定禽源活苗不应污染支原体和外源病毒，尤其是明确规定禽源活疫苗必须用疫苗必须用COFALCOFAL试验检测不应有禽白血病病毒的污染。试验检测不应有禽白血病病毒的污染。鉴别检验：应能被特异抗血清所中和。鉴别检验：应能被特异抗血清所中和。1 1、兽用活疫苗检验技术标准、兽用活疫苗检验技术标准安全检验：安全检
120、验：在专用动物舍进行，一般使用在专用动物舍进行，一般使用1010个头份的疫苗进个头份的疫苗进行行, ,无论是本动物或非本动物进行的安全检验，必须全部无论是本动物或非本动物进行的安全检验，必须全部符合规定。规定用多种动物进行安全检验的制品，任何一符合规定。规定用多种动物进行安全检验的制品，任何一种动物结果不符合规定者，均判不合格。种动物结果不符合规定者，均判不合格。效力检验：效力检验：1 1）病毒滴定或细菌计数：应保证比最小免疫原）病毒滴定或细菌计数：应保证比最小免疫原性的数量大，且在规定的有效期内均不应低于规定标准。性的数量大，且在规定的有效期内均不应低于规定标准。2 2）动物免疫方法：测定免
121、疫动物的血清抗体或免疫攻毒）动物免疫方法：测定免疫动物的血清抗体或免疫攻毒进行判定。进行判定。水份测定：不应超过水份测定：不应超过4%4%。真空度测定：每瓶疫苗均应有真空。真空度测定：每瓶疫苗均应有真空。2 2 2 2、兽用灭活疫苗检验技术标准、兽用灭活疫苗检验技术标准、兽用灭活疫苗检验技术标准、兽用灭活疫苗检验技术标准 物理性状：油乳剂灭活疫苗的外观应为乳白色均匀乳剂，单相苗物理性状：油乳剂灭活疫苗的外观应为乳白色均匀乳剂，单相苗 为油包水，双相苗为水包油包水剂型；为油包水，双相苗为水包油包水剂型；3737放置放置2121天天 不破乳；单相苗的粘度在不破乳；单相苗的粘度在1010秒以内，双相
122、苗的粘度在秒以内，双相苗的粘度在 5 5秒以内。秒以内。无菌检验：不应污染细菌、霉菌；不得含有活的本菌和本毒。无菌检验：不应污染细菌、霉菌；不得含有活的本菌和本毒。安全检验：安全检验：在专用动物舍进行，一般使用在专用动物舍进行，一般使用2 2个头份的疫苗进行个头份的疫苗进行 检验，检验，无论是本动物或非本动物进行的安全检验，无论是本动物或非本动物进行的安全检验， 必须全部符合规定。必须全部符合规定。2 2、兽用灭活疫苗检验技术标准、兽用灭活疫苗检验技术标准效力检验：多用本动物进行相关的效力试验（接种效力检验：多用本动物进行相关的效力试验（接种/ /攻毒或攻毒或检测血清抗体），当对照组攻毒成立或
123、抗体阴性时，疫苗检测血清抗体），当对照组攻毒成立或抗体阴性时，疫苗免疫组的保护力或抗体水平须符合标准规定。免疫组的保护力或抗体水平须符合标准规定。甲醛、苯酚、硫柳汞含量测定：甲醛含量不应超过甲醛、苯酚、硫柳汞含量测定：甲醛含量不应超过0.2%0.2%；苯；苯酚含量不应超过酚含量不应超过0.5%0.5%；硫柳汞含量不应超过；硫柳汞含量不应超过0.01%0.01%。 （二）（二）（二）（二）兽用生物制品质量检测技术兽用生物制品质量检测技术兽用生物制品质量检测技术兽用生物制品质量检测技术 1.1.物理化学、生物学技术的应用物理化学、生物学技术的应用 2.2.免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用
124、3.3.分子生物学技术的应用分子生物学技术的应用1 1、物理化学、生物学技术应用物理化学、生物学技术应用物理化学、生物学技术应用物理化学、生物学技术应用v物理学方法：兽用生物制品的检验大量采用物理物理学方法：兽用生物制品的检验大量采用物理学方法，如物理性状检验、真空度测定和水分测学方法，如物理性状检验、真空度测定和水分测定等。定等。v化学分析方法：灭活疫苗中甲醛、硫柳汞和苯酚化学分析方法：灭活疫苗中甲醛、硫柳汞和苯酚含量测定采用的是化学分析滴定方法。含量测定采用的是化学分析滴定方法。v生物学技术：微生物培养方法：如无菌检验、支生物学技术：微生物培养方法：如无菌检验、支原体污染的检验及效力检验中
125、活菌计数或病毒含原体污染的检验及效力检验中活菌计数或病毒含量测定均采用微生物培养方法，细菌或支原体培量测定均采用微生物培养方法，细菌或支原体培养用适宜培养基进行，病毒的培养用鸡胚或适宜养用适宜培养基进行，病毒的培养用鸡胚或适宜的细胞进行；动物接种方法：如安全检验用本动的细胞进行；动物接种方法：如安全检验用本动物或非本动物接种方法进行。物或非本动物接种方法进行。2. 2. 2. 2. 免疫免疫免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用v血凝与血凝抑制试验：血凝试验是利用具有血凝性病毒选择性的血凝与血凝抑制试验：血凝试验是利用具有血凝性病毒选择性的凝集动物红细胞的特性
126、来测定病毒的效价。主要用于凝集动物红细胞的特性来测定病毒的效价。主要用于NDND、细小病毒等活、细小病毒等活疫苗的病毒含量测定及活疫苗中污染具有血凝性病毒的检测。血凝抑制疫苗的病毒含量测定及活疫苗中污染具有血凝性病毒的检测。血凝抑制试验利用病毒凝集红细胞的特性能被相应抗体抑制来测定相应抗体的效试验利用病毒凝集红细胞的特性能被相应抗体抑制来测定相应抗体的效价，常用在具有血凝性病毒疫苗如产蛋下降综合征、猪和犬细小病毒病价，常用在具有血凝性病毒疫苗如产蛋下降综合征、猪和犬细小病毒病等灭活疫苗及等灭活疫苗及NDND疫苗免疫动物后血清抗体的检测（效力检验）。疫苗免疫动物后血清抗体的检测（效力检验）。v间
127、接血凝和反向间接血凝试验间接血凝和反向间接血凝试验：间接血凝是将抗原致敏红细胞，反间接血凝是将抗原致敏红细胞，反向间接血凝试验是将抗体致敏红细胞。向间接血凝试验是将抗体致敏红细胞。前者用于仔猪大肠菌前者用于仔猪大肠菌K88K88、K99K99双双价基因工程灭活疫苗、猪囊虫病灭活疫苗的效力检验或间接血凝诊断试价基因工程灭活疫苗、猪囊虫病灭活疫苗的效力检验或间接血凝诊断试剂的检验。后者多用于疫苗的抗原含量或相关诊断试剂的检验。以胶乳剂的检验。后者多用于疫苗的抗原含量或相关诊断试剂的检验。以胶乳为载体的胶乳凝集试验用于猪伪狂犬病诊断试剂盒的检验。为载体的胶乳凝集试验用于猪伪狂犬病诊断试剂盒的检验。2
128、. 2. 2. 2. 免疫免疫免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用v中和试验中和试验：为常用的免疫学方法，既可定性，又可定量。既有固定为常用的免疫学方法，既可定性，又可定量。既有固定血清血清稀释病毒（稀释病毒（ 法），又有固定病毒法），又有固定病毒稀释血清（稀释血清（ 法）。法）。将将特异性血清与相应疫苗病毒混合，使病毒失去感染宿主的能力（中特异性血清与相应疫苗病毒混合，使病毒失去感染宿主的能力（中和）。用血清和）。用血清病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察其病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察其是否感染来判断疫苗的效力、疫苗病毒的特异性或是否污
129、染外源病是否感染来判断疫苗的效力、疫苗病毒的特异性或是否污染外源病原。原。v动物中和试验：主要用于牛瘟、猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗（乳鼠）等动物中和试验：主要用于牛瘟、猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗（乳鼠）等活疫苗的鉴别检验及其检验用动物的筛选、梭菌疫苗的效力检验和活疫苗的鉴别检验及其检验用动物的筛选、梭菌疫苗的效力检验和定型血清效价测定。定型血清效价测定。v鸡胚中和试验：主要用于禽用病毒性活疫苗的特异性检验和病毒性鸡胚中和试验：主要用于禽用病毒性活疫苗的特异性检验和病毒性活疫苗的外源病毒检测及疫苗的效力检验。活疫苗的外源病毒检测及疫苗的效力检验。v细胞中和试验：主要用于猪伪狂犬细胞中和试验：主要用于猪伪狂犬
130、 、犬多联活疫苗、鸡传染性法氏、犬多联活疫苗、鸡传染性法氏囊病活疫苗等效力检验、特异性检验、抗体效价测定囊病活疫苗等效力检验、特异性检验、抗体效价测定 及外源病原及外源病原检检测。测。2. 2. 2. 2. 免疫免疫免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用v补补体体结结合合试试验验：在在补补体体结结合合试试验验反反应应系系统统中中，当当抗抗原与抗体发生特原与抗体发生特 异异反反应应时时，抗抗原原抗抗体体复复合合物物结结合合一一定定量量的的补补体体，而而指指示示系系统统( (致致敏敏红红细细胞胞）的的溶溶血血作作用用也也需需要要补补体体的的参参与与。因因此此在在补
131、补体体结结合合试试验验中中根根据据指指示示系系统统溶溶血血程程度度可可知知反反应应系系统统中中抗抗原原与与抗抗体体的的关关系系。在在兽兽用用生生物物制制品品的的检检验验中中，补补体体结结合合试试验验主主要要用用于于细细菌菌性性疾疾病病如如布布鲁鲁氏氏菌菌病病、副副结结核核、衣衣原原体体病病、钩钩端端螺螺旋旋体体病病、伊伊氏氏锥锥虫虫病病、鼻鼻疽疽等等补补体体结结合合试试验验抗抗原原的的检检测测及及马马传传贫贫活活疫疫苗苗的的抗抗原原性性检检验验、禽禽用用活活疫疫苗苗及及其其种种毒毒中中禽白血病病毒污染的检测。禽白血病病毒污染的检测。2. 2. 免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用v对对流流
132、免免疫疫电电泳泳：用用于于检检测测水水貂貂阿阿留留申申病病对对流流免免疫疫电电泳泳抗抗原原与阳性血清的特异性。与阳性血清的特异性。v酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验（ELISAELISA）：已已知知抗抗原原或或抗抗体体与与相相应应的的诊诊断断抗抗体体或或抗抗原原在在酶酶联联板板中中或或玻玻片片上上发发生生特特异异性性结结合合，在在酶酶标标记记抗抗体体和和酶酶底底物物的的参参与与下下，呈呈现现颜颜色色反反应应。 ELISAELISA试试验验包包括括直直接接法法、间间接接法法、双双抗抗体体夹夹心心法法。用用于于马马传传染染性性贫贫血血、蓝蓝舌舌病病、大大肠肠杆杆菌菌病病、猪猪旋旋毛毛虫虫病病、牛牛
133、副副结结核核、猪猪瘟瘟等等疫疫病病的的酶酶联联诊诊断断试试剂剂的的特特异异性性检检验验和和（或或）效效价价测测定定、马传贫活疫苗的效价测定。马传贫活疫苗的效价测定。2. 2. 2. 2. 免疫免疫免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用血清学技术的应用v斑斑点点试试验验（DotELISADotELISA）：是是根根据据已已知知疫疫病病特特异异性性标标准准阳阳性性血血清清能能与与相相应应疫疫病病的的斑斑点点酶酶联联诊诊断断试试剂剂于于硝硝酸酸纤纤维维膜膜等等固固相相材材料料上上发发生生特特异异性性结结合合反反应应，在在酶酶标标记记单单克克隆隆抗抗体体和和酶酶底底物物的的参参与与下
134、下，呈呈现现颜颜色色反反应应的的原原理理，用用于于日日本本血血吸吸虫虫病病和和马马传传贫贫DotELISADotELISA诊断试剂的特异性、非特异性检验和效价测定。诊断试剂的特异性、非特异性检验和效价测定。v荧荧光光抗抗体体染染色色技技术术：将将抗抗体体标标记记上上荧荧光光素素，利利用用抗抗原原抗抗体体反反应应的的特特异异性性，在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察荧荧光光来来检检查查未未知知抗抗原原。常常用用于于猪猪瘟瘟荧荧光光抗抗体体的的特特异异性性检检验验、马马立立克克氏氏病病多多价价活活疫疫苗苗的的效效价价测测定定、非非禽禽源源细细胞胞（或细胞系）及其制品的外源病毒检验。（或细胞系）及其
135、制品的外源病毒检验。2. 2. 免疫免疫血清学技术的应用血清学技术的应用v琼琼脂脂扩扩散散试试验验：用用于于口口蹄蹄疫疫病病毒毒感感染染相相关关抗抗原原、马马传传贫贫、牛牛白白血血病病、蓝蓝舌舌病病琼琼脂脂扩扩散散抗抗原原及及阳阳性性血清的特异性检验和效价测定。血清的特异性检验和效价测定。v其其它它：胶胶体体金金免免疫疫检检测测技技术术用用在在鸡鸡传传染染性性法法氏氏囊囊病病诊诊断断试试剂剂的的检检测测；生生物物素素亲亲和和素素系系统统结结合合荧荧光光抗抗体体染染色色技技术术和和酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验用用于于诊诊断断制制品中。品中。3 3、分子生物学技术的应用、分子生物学技术的应用v
136、单单克克隆隆抗抗体体技技术术 在在诊诊断断制制品品的的检检验验中中广广泛泛使使用用。许许多多疫疫苗苗尤尤其其是是 多多价价疫疫苗苗如如马马立立克克氏氏病病多多价价活活疫疫苗苗的的病病毒毒含含量量测测定定（蚀蚀斑斑计计数数）和和鉴鉴别别检检验验等等也也采采用用单单克克隆隆抗抗体体技技术术（荧荧光光抗抗体体染染色色技技术术或或酶酶联联免免疫疫染染色色技技术术）进进行行，以以区区别别不不同同型型或或亚亚型型的的病病毒毒。日日本本血血吸吸虫虫病病、马马传传贫贫、猪瘟等诊断制品均采用单克隆抗体技术进行制品的特异性检验。猪瘟等诊断制品均采用单克隆抗体技术进行制品的特异性检验。 vPCRPCR扩扩增增技技术术 用用于于仔仔猪猪大大肠肠菌菌K88K88、K99K99双双价价基基因因工工程程灭灭活活疫疫苗苗和和仔仔猪猪大大肠肠菌菌K88K88、LTBLTB双双价价基基因因工工程程活活疫疫苗苗工工程程菌菌的的鉴鉴定定。其其它它如如种种毒毒的的鉴定、病毒性活疫苗中外源病毒污染的检测。鉴定、病毒性活疫苗中外源病毒污染的检测。v核酸探针、核酸杂交技术核酸探针、核酸杂交技术 用于诊断制品的检验。用于诊断制品的检验。谢谢！谢谢！
