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1、成才之路成才之路 生物生物路漫漫其修远兮路漫漫其修远兮 吾将上下而求索吾将上下而求索人教版人教版 选修选修3 基因工程基因工程专题一专题一第一节第一节DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一目目 标标 定定 位位1预预 习习 导导 学学2要要 点点 精精 析析3思思 维维 升升 华华4知知 识识 构构 建建5课课 时时 作作 业业7应应 用用 探探 究究6目目 标标 定定 位位1认认同同基基因因工工程程的的诞诞生生和和发发展展离离不不开开理理论论研研究究和和技技术术创创新。新。2简简述述DNA重重组组技技术术所所需需三三种种基基本本工工具具的的作作用用。(重重、难难点点)3简述基
2、因工程中载体需要具备的条件。简述基因工程中载体需要具备的条件。(重点重点)预预 习习 导导 学学一、基因工程的概念一、基因工程的概念基基因因工工程程是是指指按按照照人人们们的的愿愿望望，进进行行严严格格的的设设计计，并并通通过过_和和转转基基因因等等技技术术，赋赋予予生生物物以以新新的的遗遗传传特特性性，从从而而创创造造出出更更符符合合人人们们需需要要的的新新的的生生物物类类型型和和生生物物产产品品。由由于于基基因因工工程程是是在在_水水平平上上进进行行设设计计和和施施工工的的，因因此此又又叫叫做做_。二、二、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1工具简介工具简介(1)“分子手术刀分子手
3、术刀”_(2)“分子缝合针分子缝合针”_(3)“分子运输车分子运输车”_体外体外DNA重组重组 分子分子 DNA重组技术重组技术 DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1)来源：主要是从来源：主要是从_中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。(2)功功能能：能能够够识识别别双双链链DNA分分子子的的某某种种特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，并并且且使使每每一一条条链链中中特特定定部部位位的的两两个个核核苷苷酸酸之之间间的的_断断开开，因因此此具具有有_性性。大大多多数数限限制制酶酶的的识识别别序序列列由由_
4、个个核核苷苷酸酸组组成成。经经限限制制酶酶切切割割产产生生的的DNA片片段段末末端端通通常常有有两两种种形形式式：_和和_。前前者者是是限限制制酶酶在在它它识识别别序序列列的的_将将DNA的的两两条条链链切切开开产产生生的的，后后者者是是限限制制酶酶在在它它识识别别序序列列的的_切切开开产生的。产生的。原核生物原核生物磷酸二酯键磷酸二酯键专一专一6黏性末端黏性末端平末端平末端中轴线两侧中轴线两侧中轴线处中轴线处3DNA连接酶连接酶(1)分分类类：根根据据酶酶的的来来源源不不同同，可可分分为为两两类类：一一类类是是从从大大肠肠杆杆菌菌中中分分离离得得到到的的，称称为为_；另另一一类类是是从从_中
5、分离出来的，称为中分离出来的，称为T4DNA连接酶。连接酶。(2)两种两种DNA连接酶的比较：连接酶的比较：相同点：都缝合相同点：都缝合_键。键。EcoliDNA连接酶连接酶T4噬菌体噬菌体磷酸二酯磷酸二酯黏性末端黏性末端平末端平末端黏性末端黏性末端平末端平末端比较低比较低有一个至多个限制酶切割位点有一个至多个限制酶切割位点 有特殊的遗传标记基因有特殊的遗传标记基因 质粒质粒动植物病毒动植物病毒结构简单结构简单独立于细菌拟核独立于细菌拟核DNA之外之外自我复制自我复制思维激活思维激活1不不同同的的限限制制酶酶具具有有不不同同的的识识别别序序列列，说说明明限限制制酶酶具具有有什么特点？什么特点？
6、2作作为为运运载载工工具具的的载载体体，要要求求必必须须对对受受体体细细胞胞无无害害，为为什么？什么？答案答案1专一性专一性2载载体体如如果果对对受受体体细细胞胞有有害害，其其一一旦旦被被导导入入受受体体细细胞胞，就会影响受体细胞的生命活动，甚至破坏受体的生命活动。就会影响受体细胞的生命活动，甚至破坏受体的生命活动。要要 点点 精精 析析一、对基因工程概念的理解一、对基因工程概念的理解基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入
7、表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物知识贴士：知识贴士：基因工程得以实现的理论基础：基因工程得以实现的理论基础：所所有有生生物物的的DNA都都是是以以4种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸为为基基本本单单位位，构构成成独独特特的的双双螺螺旋旋结结构构，这这为为不不同同种种生生物物DNA拼拼接接成成功功提提供供物物质质基础。基础。所所有有生生物物共共用用一一套套遗遗传传密密码码子子，为为某某生生物物的的基基因因能能够够在在其他生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供可能。其他生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供可能。二、基因工程的工具二、基因工程的工具1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1)来源：这
8、类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。来源：这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)种种类类：迄迄今今已已从从近近300种种不不同同的的微微生生物物中中分分离离出出了了约约4000种限制酶。种限制酶。(3)特特点点：主主要要切切割割外外源源DNA，而而对对自自身身的的DNA不不起起作作用用，达达到到保保护护自自身身的的目目的的；只只能能识识别别双双链链DNA分分子子中中特特定定的的核苷酸序列；核苷酸序列；只能在特定的部位进行切割。只能在特定的部位进行切割。(4)结果：形成黏性末端或平末端。结果：形成黏性末端或平末端。(5)实质：使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。实质：使特定部位
9、的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。知识贴士：知识贴士：若若限限制制酶酶切切割割后后形形成成的的是是黏黏性性末末端端，则则形形成成的的两两个个黏黏性性末端是反向重复序列。末端是反向重复序列。大大多多数数限限制制酶酶的的识识别别序序列列为为6个个核核苷苷酸酸组组成成，例例如如EcoRI、SmaI限限制制酶酶识识别别序序列列由由6个个核核苷苷酸酸组组成成，也也有有少少数数限限制制酶酶的的识别序列由识别序列由4、5或或8个核苷酸组成。个核苷酸组成。2DNA连接酶连接酶以以下下是是两两种种限限制制酶酶切切割割后后形形成成的的DNA片段，分析回答问题。片段，分析回答问题。导学号导学号 65500000解解
10、析析分分析析以以上上4个个DNA片片段段，可可清清楚楚分分析析出出为为平平末末端端，连连接接酶酶应应用用T4DNA连连接接酶酶；为为黏黏性性末末端端且且相相同同，连连接时应用接时应用EcoliDNA连接酶。连接酶。答答案案(1)平平T4DNA连连接接酶酶(2)黏黏性性EcoliDNA连接酶连接酶已已知知某某种种限限制制性性内内切切酶酶在在一一线线性性DNA分分子子上上有有3个个酶酶切切位位点点，如如右右图图中中箭箭头头所所指指。如如果果该该线线性性DNA分分子子在在3个个酶酶切切位位点点上上都都被被该该酶酶切切断断，则则会会产产生生a、b、c、d四四种种不不同同长长度度的的DNA片片段段。现现
11、有有多多个个上上述述线线性性DNA分分子子，若若在在每每个个DNA分分子子上上至至少少有有1个个酶酶切切位位点点被被该该酶酶切切断断，则则从从理理论论上上讲讲，经经该该酶酶酶酶切切后后，这这些些线线性性DNA分分子子最最多多能能产产生生长长度度不不同同的的DNA片片段段种种类类数数是是()A3B4C9D12导学号导学号 65500001答案答案C解解析析每每一一种种限限制制性性内内切切酶酶切切割割DNA后后会会留留下下特特征征性性的的黏黏性性末末端端，同同时时一一次次切切割割后后，会会把把DNA分分割割成成两两个个片片段段，且且不不同同的的限限制制酶酶切切后后的的片片段段不不一一样样，如如果果
12、将将题题图图中中的的三三个个切切割割位位点点自自左左至至右右依依次次标标为为甲甲、乙乙、丙丙，只只在在甲甲处处切切，可可产产生生两两个个片片段段，即即a和和右右边边的的bcd段段，如如果果只只在在乙乙处处切切，就就有有ab和和cd段段，如如果果只只在在丙丙处处切切，就就有有abc和和d段段，在在甲甲、乙乙两两处处同同时时切切，就就有有a、b和和cd段段，在在乙乙、丙丙处处同同时时切切，就就有有ab和和c、d段段，在在甲甲、丙丙两两处处同同时时切切，就就有有a、bc、d段段三三种种片片段段，在在甲甲、乙乙、丙丙三三处处同同时时切切，就就有有a、b、c、d四四种种片片段段。所所以以本本题题应应该该
13、选选C。3“分子运输车分子运输车”载体载体(1)作作用用：一一是是用用它它作作为为运运载载工工具具，将将目目的的基基因因转转移移到到宿宿主主细细胞胞中中去去；二二是是利利用用它它在在宿宿主主细细胞胞内内对对目目的的基基因因进进行行大大量量的的复复制制(称为克隆称为克隆)。(2)作为载体必须具备的条件：作为载体必须具备的条件：具具有有一一个个或或多多个个限限制制酶酶切切割割位位点点，该该切切割割位位点点必必须须位位于于载体本身必需的基因序列之外。载体本身必需的基因序列之外。能能够够自自我我复复制制或或整整合合到到染染色色体体DNA上上后后随随染染色色体体DNA复制。复制。带有标记基因，便于筛选。
14、带有标记基因，便于筛选。本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。大小适中，便于操作。大小适中，便于操作。但但实实际际上上，天天然然载载体体一一般般不不会会同同时时具具备备上上述述条条件件，所所以以在在基基因因工工程程中中需需要要对对载载体体进进行行人人工工改改造造。现现在在所所用用的的质质粒粒几几乎乎都都是人工改造的。是人工改造的。质质粒粒是是基基因因工工程程最最常常用用的的载载体体，它的主要特点是它的主要特点是()能自主复制能自主复制不能自主复制不能自主复制结构很小结构很小 是蛋白质是蛋白质是环状是环状RNA 是环状是环状DNA能能“友好友好”地地“借居借
15、居”ABCD导学号导学号 65500002解解析析质质粒粒存存在在于于细细菌菌和和酵酵母母菌菌等等生生物物中中，是是一一种种很很小小的的环环状状DNA，上上面面有有标标记记基基因因，便便于于在在受受体体细细胞胞中中检检测测。质质粒粒在在受受体体细细胞胞中中能能随随受受体体细细胞胞DNA的的复复制制而而复复制制，能能进进行行目目的的基基因的扩增和表达。因的扩增和表达。答案答案C质质粒粒是是基基因因工工程程最最常常用用的的载载体体，下下列列关关于于质质粒粒的的说说法法正正确确的是的是()A质粒在宿主细胞内都要整合到染色体质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上上B质粒是独立于细菌拟核质粒是独立于细
16、菌拟核DNA之外的小型细胞器之外的小型细胞器C基因工程操作中的质粒一般都是经过人工改造的基因工程操作中的质粒一般都是经过人工改造的D质粒上碱基之间数量存在质粒上碱基之间数量存在AGUC答案答案C导学号导学号 65500003解解析析基基因因工工程程使使用用的的载载体体需需有有一一至至多多个个酶酶切切位位点点，具具有有自自我我复复制制的的能能力力，存存在在标标记记基基因因，对对受受体体细细胞胞安安全全，且且分分子子大大小小适适合合。而而自自然然存存在在的的质质粒粒DNA分分子子并并不不完完全全具具备备上上述述条条件件，都都要要进进行行人人工工改改造造后后才才能能用用于于基基因因工工程程操操作作。
17、而而质质粒粒进进入入宿宿主主细细胞胞后后不不一一定定都都要要整整合合到到染染色色体体DNA上上，如如宿宿主主细细胞胞是是细细菌菌细细胞胞则则不不需需整整合合。质质粒粒是是小小型型环环状状双双链链DNA分分子子而而不不是是细细胞胞器器，也不会有碱基也不会有碱基U。思思 维维 升升 华华1与遗传有关的各种酶的比较与遗传有关的各种酶的比较名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程与应用过程与应用作用位点作用位点(如下图如下图)DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA片片段段基因工程基因工程a限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶能够识别双链能够识别双链DNA分子的某种分子的某种特定核苷酸序列，特定核苷酸序列
18、，并且使每一条链并且使每一条链中特定部位的两中特定部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开a名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程与应用过程与应用作用位点作用位点(如下图如下图)DNA聚合酶聚合酶在脱氧核苷酸链在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧上添加单个脱氧核苷酸核苷酸DNA的复制的复制aRNA聚合酶聚合酶在核糖核苷酸链在核糖核苷酸链上添加单个核糖上添加单个核糖核苷酸核苷酸转录转录a解旋酶解旋酶使核碱基间氢键使核碱基间氢键断裂形成单脱氧断裂形成单脱氧核苷酸链核苷酸链DNA复复制及转录制及转录b逆转录酶逆转录酶以以RNA为模板为模板合成合成DNA逆转录、逆转录、基因工程基因工
19、程特特别别提提醒醒：DNA连连接接酶酶和和DNA聚聚合合酶酶的的作作用用都都是是催催化化形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，而而不不是是氢氢键键，氢氢键键是是分分子子间间的的静静电电吸吸引引力力，不不需需要要通通过过酶酶的的催催化化形形成成。DNA连连接接酶酶只只能能在在两两个个DNA片片段段间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，而而DNA聚聚合合酶酶只只能能将将单单个个核核苷苷酸酸加加到到已已有有DNA片片段段上上，且且需需要要以以一一条条DNA链链为为模模板板。目目前前发发现现的的DNA连接酶不具有连接单链连接酶不具有连接单链DNA的能力。的能力。2限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用原
20、原核核生生物物容容易易受受到到自自然然界界外外源源DNA的的入入侵侵，但但是是，生生物物在在长长期期的的进进化化过过程程中中形形成成一一套套完完善善的的防防御御机机制制，以以防防止止外外来来病病原原微微生生物物的的侵侵害害。限限制制酶酶在在细细菌菌内内会会将将外外源源DNA切切割割掉掉，以以保保证证自自身身的的安安全全。而而限限制制酶酶不不会会切切断断自自身身DNA，是是因因为为在在原原核核生生物物细细胞胞中中，其其DNA分分子子或或者者不不具具备备这这种种限限制制酶酶的的识识别别序序列列，或或者者通通过过甲甲基基化化酶酶将将甲甲基基转转移移到到所所识识别别序序列列的的碱碱基基上上，使使限限制
21、制酶酶不不能将其切开。能将其切开。知知 识识 构构 建建应应 用用 探探 究究目目前前基基因因工工程程所所用用的的质质粒粒载载体体主主要要是是以以天天然然细细菌菌质质粒粒的的各各种种元元件件为为基基础础重重新新组组建建的的人人工工质质粒粒，pBR322质质粒粒是是较较早早构构建建的质粒载体，其主要结构如下图所示。的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。导学号导学号 65500004(2)pBR322分分子子中中有有单单个个EcoR I限限制制酶酶作作用用位位点点，EcoR I只只能能识识别别序序列列GAATTC，并并只只能
22、能在在G与与A之之间间切切割割。若若在在某某目目的的基基因因的的两两侧侧各各有有1个个EcoR I的的切切点点，请请画画出出目目的的基基因因两两侧侧 被被 限限 制制 酶酶 EcoR I切切 割割 后后 所所 形形 成成 的的 黏黏 性性 末末 端端 ：_。(3)pBR322分分子子中中另另有有单单个个的的BamH I限限制制酶酶作作用用位位点点，现现将将经经BamHI处处理理后后的的质质粒粒与与用用另另一一种种限限制制酶酶Bgl处处理理得得到到的的目目的的基基因因，通通过过DNA连连接接酶酶作作用用恢恢复复_键键，成成功功获得了重组质粒，说明获得了重组质粒，说明_(4)为为了了检检测测上上述
23、述重重组组质质粒粒是是否否导导入入原原本本无无ampR和和tetR的的大大肠肠杆杆菌菌，将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基上上培培养养，得得到到如如图图二二的的菌菌落落。再再将将灭灭菌菌绒绒布布按按到到培培养养基基上上，使使绒绒布布面面沾沾上上菌菌落落，然然后后将将绒绒布布按按到到含含四四环环素素的的培培养养基基上上培培养养，得得到到如如图图三三的的结结果果(空空圈圈表表示示与与图图二二对对照照无无菌菌落落的的位位置置)。与与图图三三空空圈圈相相对对应应的的图图二二中中的的菌菌落落表表现现型型是是_，图图三三结结果显示，多数大肠杆菌导入的是果显示，多数大肠杆菌导入
24、的是_。(3)DNA连连接接酶酶催催化化两两个个DNA片片段段形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键；而而通通过过DNA连连接接酶酶作作用用能能将将两两个个DNA分分子子片片段段连连接接，表表明明经经两两种种限限制酶制酶(BamH I和和Bgl)切割得到的切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。片段，其黏性末端相同。(4)由由题题意意知知：由由于于与与图图三三空空圈圈相相对对应应的的大大肠肠杆杆菌菌能能在在含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基上上生生长长，而而不不能能在在含含四四环环素素的的培培养养基基上上生生长长，故故可可推推知知与与图图三三空空圈圈相相对对应应的的图图二二中中的的菌菌落落能能抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素，但但不不能能抗抗四四环环素素。由由图图二二、图图三三结结果果显显示示，多多数数大大肠肠杆杆菌菌都都能能抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素，而而经经限限制制酶酶BamH I作作用用后后，标标记记基基因因tetR被被破破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。质粒。
