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1、讲课基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的选择获取、目的基因的选择获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤: :有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的
2、基因在另一种生物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。一、目的基因的选择获取一、目的基因的选择获取: : 1 1、目的基因、目的基因: :主要是编码蛋白质的结构基因主要是编码蛋白质的结构基因; ;也可以是具有调控作用的因子。也可以是具有调控作用的因子。2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?从基因文库中获取。从基因文库中获取。利用利用PCRPCR技术扩增；技术扩增；化学方法直接合成。化学方法直接合成。人工合成：人工合成：从已有的物种中分离从已有的物种
3、中分离：把需要研究的基因称为目的基因。把需要研究的基因称为目的基因。基因工程所述的目的基因：基因工程所述的目的基因：（一）、从基因文库中直接获取：（一）、从基因文库中直接获取：1.1.什么是基因文库？什么是基因文库？ 将将某一物种的某一物种的生物不同的基因许生物不同的基因许多多DNADNA片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。 2.2.基因文库的分类基因文库的分类: :按
4、外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一个物种生物的含有一个物种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一个物种生物的只包含了一个物种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库3.3.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：简单的说：就是根据目的基因的有关信息进行分类。简单的说：就是根据目的基因的有关信息进行分类。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物色体上的位置、基因的转录产物mRNAmRNA、以及
5、基因翻、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。译产物等特性来构建基因文库。 4. 4. 构建基因文库构建基因文库 的方法的方法： 直接分离法直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )：反转录法：反转录法： 提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的用适当的 限制酶切限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库 . .直接分离法直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中
6、储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA(cDNA文库文库) )比较：比较：文文库库类类型型cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小较较小小较较大大基因中有无启动子基因中有无启动子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的全部某种生物的全部基因基因物种间的基因交流物种间的基因交流可可以以部分基因可以部分基因可以5.5.如何从基因文库中寻找目
7、的基因：如何从基因文库中寻找目的基因：简单的说：根据建立基因文库时的分类索引来寻找。简单的说：根据建立基因文库时的分类索引来寻找。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物色体上的位置、基因的转录产物mRNAmRNA、以及基因翻、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。译产物等特性来构建基因文库。 原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游不能编码蛋白质不能编码蛋
8、白质可调控遗传信息的表达可调控遗传信息的表达( (调控序列调控序列) )编码蛋白质编码蛋白质( (编码序列编码序列) )原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点 RNA RNA聚合酶是由多个肽链聚合酶是由多个肽链构成的蛋白质，能识别并与构成的蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合调控序列中的结合位点结合, ,催化转录形成催化转录形成RNARNA。与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点A G G U C A C G U C GA G G U C A C G U
9、 C GA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CRNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNARNARNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶真核细胞的基因结构真核细胞的
10、基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有：编码区含有：能够编码蛋白质的序列能够编码蛋白质的序列( (外显子外显子) )不能编码蛋白质的插入序列不能编码蛋白质的插入序列( (内含子内含子) )非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传
11、信息的表达( ( ( (调控序列调控序列调控序列调控序列) ) ) )外显子外显子外显子外显子( ( ( (能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质) ) ) )内含子内含子内含子内含子( ( ( (不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质) ) ) )非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5加加 工工转转 录录前体前体RNARNAmRNAmRNA加加 工工一个典型的真核细胞基因结构示意图一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与R
12、NARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1 12 23 34 45 5原核细胞基因原核细胞基因真核细胞基因真核细胞基因相同点相同点不同点不同点原核细胞基因与真核细胞基因的比较原核细胞基因与真核细胞基因的比较 都是由能够编码蛋白质的都是由能够编码蛋白质的都是由能够编码蛋白质的都是由能够编码蛋白质的编码区编码区编码区编码区和和和和具有调控作用的具有调控作用的具有调控作用的具有调控作用的非编码区非编码区非编码区非编码区组成。组成。组成。组成。编码区是编码区是编码区是编码区是连续连续连续连续的的的的编码区是编码区是编码区是编码区是间隔间隔间隔间隔的，的，的，的，是不连续的是不连续
13、的是不连续的是不连续的1、构建基因组、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（文库时，首先应分离细胞的（）A、染色体、染色体DNAB、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNAD、tRNA2 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（描述正确的是（ ）A A、某生物的全套基因就是一个基因文库；、某生物的全套基因就是一个基因文库；B B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNADNA片段，导入某个生物片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库；体内，则这个生物就是一个基因文库；C C、含有一种生物所有基
14、因的基因文库叫做基因组文库；、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库；D D、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫cDNAcDNA文库。文库。AC（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片段的片段的核酸合成核酸合成技术技术。通过此技术，可获取。通过此技术，可获取大量的目的基因。大量的目的基因。PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应:PCR技术技术:PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧
15、核苷酸；引物；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）；离子酶）；离子.原原理：理：前前提：提：原原 料料: : 过过 程：程：高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环预变性（预变性（增加增加DNADNA变性的概率变性的概率） PCRPCR技术具体过程技术具体过程：a a、高温、高温DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂
16、，形成断裂，形成_b b、低温退火、低温退火复性复性（55-6555-65）：系统温度降）：系统温度降低，引物与低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、适温延伸、适温延伸（70-7570-75）：在耐热）：在耐热DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq）的作用下，合成与模板互补的）的作用下，合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA。双链双链DNADNA链链 在生物体内双链在生物体内双链DNADNA解链能采用高温吗？解链能采用高温吗？PCR(多聚酶链式反应）结结 果：果：方方 式式: :以以_ _ 方式扩增，方式扩增，即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增
17、循环的次数）指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较：复制的比较：PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子例、多聚酶链式反应（例
18、、多聚酶链式反应（PCRPCR）是一种体外迅速扩增）是一种体外迅速扩增DNADNA片片段的技术。段的技术。PCRPCR过程一般经历下述三十多次循环：过程一般经历下述三十多次循环：9595下使模板下使模板DNADNA变性、解链变性、解链5555下复性（引物与下复性（引物与DNADNA模板链结合）模板链结合）7272下引物链延伸（形成新的脱下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关氧核苷酸链）。下列有关PCRPCR过程的叙述中过程的叙述中不正确不正确的的是：（是：（ ）A A变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实
19、现；解旋酶实现； B B复性过程中引物与复性过程中引物与DNADNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成；完成；C C延伸过程中需要延伸过程中需要DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP、四种核糖核苷酸；、四种核糖核苷酸；D DPCRPCR与细胞内与细胞内DNADNA复制相比所需要酶的最适温度较高。复制相比所需要酶的最适温度较高。答案；答案；C C目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录
20、合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使使使RNARNARNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链DNADNADNADNA，从而，从而，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸
21、的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：（3 3）、化学合成方法）、化学合成方法 ：二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1 1、构建基因表达载体的构建基因表达载体的目的目的：使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发目的基因能够表达和发挥作用。挥作用。2、操作环境：体外操作、操作环境：体外操作3 3、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：目的基因；目的基因；启动子；
22、启动子；终止子；终止子；标记基因。标记基因。启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来运载
23、体与基因表达载体等同吗？：运载体与基因表达载体等同吗？： 1 1、不同点：、不同点： “运载体运载体”泛指基因工程操作中能将外源基因送达受体细胞泛指基因工程操作中能将外源基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。的工具。如细菌质粒等。“运载体运载体” 强调它的运载基因功能，强调它的运载基因功能，只要能运载基因就算是运载体。只要能运载基因就算是运载体。 “基因表达载体基因表达载体”，是指能够运输目的基因、并且要保证目，是指能够运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。它强调的不仅是运的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。它强调的不仅是运输，更重要的是运输后能够使目的基因表达。输
24、，更重要的是运输后能够使目的基因表达。基因表达载体的构成：基因表达载体的构成： 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因。标记基因。2 2、相同点：、相同点：“基因表达载体基因表达载体”是在是在”运载体运载体”的基础上构建成的；的基础上构建成的； 运载体与基因表达载体都含有复制原点及外源基因运载体与基因表达载体都含有复制原点及外源基因。运载体运载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分部分DNADNA片段。片段。表达载体表达载体在在运载体运载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启目的基因、启动子、终
25、止子动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接酶连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携必需以表达载体的方式携带进去。带进去。复制原点与启动子复制原点与启动子：复制原点是：复制原点是DNADNA复制的固定起始点，复制的固定起始点， 启启动子动子是位于是位于结构基因结构基因 上游
26、上游 的的DNADNA序列，能活化序列，能活化RNARNA聚合酶，使聚合酶，使之与模板之与模板DNA DNA 相结合并具有相结合并具有转录起始转录起始的特异性。的特异性。 简单的说：简单的说：一个是一个是DNADNA复制开始，一个是转录开始。复制开始，一个是转录开始。注注 意：意：例、例、科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花
27、体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，基因表达载体应具植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，基因表达载体应具备的结构是备的结构是（）A、目的基因、启动子、目的基因、启动子B、目的基因、终止子
28、、目的基因、终止子C、目的基因、启动子、终止子、目的基因、启动子、终止子D、目的基因、启动子、终止子、标记基因、目的基因、启动子、终止子、标记基因答案答案:D:D例例、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：据图回答：图中基因组文库图中基因组文库 （填（填“小于小于”、“等于等于”或或“大于大于”）cDNAcDNA文库。文库。BB过程需要的酶是过程需要的酶是 ； 目的基因目的基因和和除从构建的文库中分离
29、外，还可以除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中分别利用图中 和和 为模板直接进行为模板直接进行PCRPCR扩增，扩增，该过程中所用酶的显著特点是该过程中所用酶的显著特点是。逆转录酶逆转录酶DNDcDNA耐高温耐高温三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化：转化：（一）转化概念：（一）转化概念： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入受体细胞内
30、，并且在受体细胞内维目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。持稳定和表达的过程。农杆菌特点及转化原理：农杆菌特点及转化原理： 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的TiTi质粒上的一段特殊的质粒上的一段特殊的T-
31、DNAT-DNA（可转移的（可转移的DNADNA）可转移至受体细可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的胞，并且整合到受体细胞染色体的DNADNA上。根据农杆菌的这种上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到特点，如果将目的基因插入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上，通过农杆菌上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的到植物细胞中染色体的DNADNA上，使目的基因的遗传特性得以稳上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。定维持和表达。 1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目
32、的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法：）农杆菌转化法：过过程程v基因枪转化法基因枪转化法 ：它的主：它的主要原理是将含目的基因的载要原理是将含目的基因的载体包被（吸附）在微小的金体包被（吸附）在微小的金属微粒属微粒( (钨粒或金粒钨粒或金粒) )表面表面, ,通过高压驱动力加速微粒穿通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁透植物细胞壁, ,导入受体组导入受体组织细胞内织细胞内, ,然后通过组织培然后通过组织培养再生出完整的植株养再生出完整的植株. .微粒微粒上的外源上的外源DNADNA进入细胞后进入细胞后, ,整整合到染色体上并得到表达合到染色体上并得到表达, ,从而实现基因的转化。从
33、而实现基因的转化。（2 2）基因枪法：）基因枪法：（3 3）花粉管通道法：）花粉管通道法：v花粉管通道法是利用开花植花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道物授粉后形成的花粉管通道,直直接将外源目的基因导入尚不具接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞期胚胎细胞,实现目的基因转化实现目的基因转化.2 2、将目的基因导入动物细胞：、将目的基因导入动物细胞：提纯含目的提纯含目的基因表达载体基因表达载体从母体取卵从母体取卵（受精卵（受精卵）通过显微注射仪注通过显微注射仪注射射 基因表达载体基因表达载体 对含目的基因的受精对含目的基因的受精卵进行
34、早期体外培养卵进行早期体外培养移植母体动物移植母体动物输卵管或子宫内输卵管或子宫内方方法：显微注射法法：显微注射法程程序：序：发育具有发育具有新性状动物新性状动物原核生物特点：原核生物特点：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体表达载体与感受态细胞混合与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子。分子。方方法：法：3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞吸附转化吸附转化繁殖快、单细胞、遗传物质少。繁殖快、单细胞、遗传物质少。条件：条件：缓冲液：缓冲液：Mg Mg 2+2+、ATPATP辅助因子、辅助因子、 DTTDTT（二硫苏糖醇）、血清蛋白
35、。（二硫苏糖醇）、血清蛋白。温度：温度：121216160c 0c 12-1612-16小时；小时； 或或7 78 80c 0c 2 23 3天。天。受体细胞能用结核杆菌吗？受体细胞能用结核杆菌吗？（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因：目的基因： （1 1）方法）方法: :DNADNA分子杂交分子杂交DNADNA分子杂交：来源不同的两条单链核酸分子分子杂交：来源不同的两条单链核酸分子, ,通过碱基互补通过碱基互补形成异源双螺旋分子的过程。形成异源双螺旋分子的过程。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴
36、定检查是否成功检查是否成功（2 2）过）过 程程: :A、首先取出转基因生物的基因组、首先取出转基因生物的基因组DNA；B、取含目的基因的、取含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,该段该段DNA称作基因探针；称作基因探针；C、使探针和转基因生物的基因组杂交、使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明表明染色体已插入染色体染色体已插入染色体DNA中。中。基因探针：指带有放射性标记，能与目的基因互补的已知指带有放射性标记，能与目的基因互补的已知核苷酸序列的一段单链核苷酸序列的一段单链DNA或或RNA。基因探针的条件：单链单链DNA或或RNA
37、；有易被检测的标记；有易被检测的标记；高度特异性。高度特异性。基因探针种类：基因基因DNA探针；探针；cDNA探针；探针；RNA探针。探针。归纳步骤DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 2 2、检测目的基因是否
38、转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法方法: :分分 子子 杂杂 交交过过程程:用用DNA探针和转基因生物的探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA。分子杂交分子杂交 用被标记的用被标记的目的基因探针目的基因探针从转基因生物从转基因生物 中提取中提取mRNAmRNA显示杂交带显示杂交带转录成功转录成功 未显示杂交带未显示杂交带转录失败转录失败 3 3、检测目的基因是否翻译成、检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质：方法方法:抗原抗原抗体杂交抗体杂交过程：过程：目的目的基因基因大肠杆菌大肠杆菌蛋白质蛋白质动物体内动
39、物体内抗体（）抗体（）转基因生物转基因生物蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）免疫免疫注入注入表达表达表达表达是否特异性结合是否特异性结合大肠杆菌大肠杆菌实验动物实验动物转基因生物转基因生物分别导入分别导入归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是
40、否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗原抗体杂交抗体杂交归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因
41、的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于处。（填处。（填“a”或或“b”）aa练习练习1：(20
42、08理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和有农杆菌转化法和法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是和和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用）为了确定耐盐转基因水稻是否培
43、育成功，既要用放射性同位素标记的放射性同位素标记的作探针进行分子杂作探针进行分子杂交检测，又要用交检测，又要用方法从个体水方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化和再分化脱分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌例、例、20092009年年1010月，我国自主研发的转基因抗月，我国自主研发的转基因抗虫水稻虫水稻“华恢华恢1 1号号”获得农业部颁发的安全获得农业部颁发的安全证书。下图表示该抗虫水稻主要培育流程，证书。下图表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答：据图回答：（1 1）过
44、程应用的主要生物技术是过程应用的主要生物技术是 。2）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入 人工改造时用限制酶人工改造时用限制酶处理，其目的是：第一，去处理，其目的是：第一，去除质粒上的除质粒上的 基因，保证基因，保证T TDNADNA进入水稻细胞进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于带有单一限制酶作用位点，有利于 。第三，。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。使质粒大
45、小合适，可以提高转化效率等。若用限制酶若用限制酶分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的的DNADNA分子，并构成重组分子，并构成重组TiTi质粒。分别以含四环素和卡那质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是在含察到的细胞生长的现象是在含 能够生长，而在含能够生长，而在含 中能生长。中能生长。答案：（答案：（1 1）植物组织培养）植物组织培养 （2 2）启动子启动子tettet和和tmrtmr目的目的基因（或外源基因（或外源DNADNA）准确插入）准
46、确插入卡那霉卡那霉素的培养基四环素的培养基素的培养基四环素的培养基解析：（解析：（1 1）过程表示植物细胞组织培养成过程表示植物细胞组织培养成植物体。（植物体。（2 2）基因表达载体应含有启动基因表达载体应含有启动子、终止子、目的基因、标记基因。子、终止子、目的基因、标记基因。从图从图看出限制酶看出限制酶能破坏能破坏tettet和和tmrtmr。由图看出由图看出限制酶限制酶已将四环素抗性基因破坏。已将四环素抗性基因破坏。1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基
47、因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练练 习：习：2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练练 习：习：3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性
48、末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练练 习习 ：4）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练练 习：习：5）基基因因工工程程是
49、是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练练 习：习：知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动
50、子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻片断，它能阻碍碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱
51、落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶
52、聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子
