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1、流式细胞术流式细胞术 Flow Cytometry（FCMFCM）什么是流式细胞仪流式细胞仪实物BD FACSVantageBD-Calibur 1.发展历史发展历史n n1934Moldavann n1973Steinkamp一、一、概述概述2. 2. 2. 2. 定定定定义义义义：对对对对在在在在高高高高速速速速流流流流动动动动的的的的鞘鞘鞘鞘液液液液包包包包括括括括下下下下对对对对特特特特异异异异荧荧荧荧光标记的细胞、粒子进行光标记的细胞、粒子进行光标记的细胞、粒子进行光标记的细胞、粒子进行分析和分选分析和分选分析和分选分析和分选的技术的技术的技术的技术. . . .3. 3. 3. 3
2、. 特点特点特点特点uu测测测测量量量量速速速速度度度度快快快快，每每每每秒秒秒秒钟钟钟钟能能能能测测测测数数数数千千千千个个个个乃乃乃乃至至至至上上上上万万万万个个个个细胞细胞细胞细胞uu可进行多参数测量可进行多参数测量可进行多参数测量可进行多参数测量uu在在在在分分分分析析析析的的的的同同同同时时时时可可可可把把把把具具具具有有有有指指指指定定定定特特特特征征征征的的的的细细细细胞胞胞胞分分分分离离离离出来，即分选技术。出来，即分选技术。出来，即分选技术。出来，即分选技术。凡凡凡凡是是是是能能能能被被被被荧荧荧荧光光光光素素素素标标标标记记记记的的的的细细细细胞胞胞胞或或或或颗颗颗颗粒粒粒
3、粒都都都都可可可可用用用用流流流流式式式式细细细细胞仪检测。胞仪检测。胞仪检测。胞仪检测。前前前前提提提提这这这这种种种种荧荧荧荧光光光光素素素素能能能能被被被被流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪所所所所配配配配置置置置的的的的激激激激光光光光光光光光源激发源激发源激发源激发在在在在生生生生物物物物检检检检测测测测技技技技术术术术中中中中流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪是是是是不不不不可可可可多多多多得得得得的的的的一一一一机机机机多用多用多用多用的仪器。的仪器。的仪器。的仪器。4.应用范围应用范围二、流式细胞仪的工作原理和基本结构二、流式细胞仪的工作原理和基本结构待待待待测测测
4、测细细细细胞胞胞胞以以以以单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的悬悬悬悬液液液液，经经经经特特特特异异异异性性性性荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料染染染染色色色色，放放放放入入入入样样样样品品品品管管管管，吸入流动室。吸入流动室。吸入流动室。吸入流动室。流流流流动动动动室室室室充充充充满满满满鞘鞘鞘鞘液液液液，作作作作用用用用：约约约约束束束束样样样样品品品品在在在在喷喷喷喷嘴嘴嘴嘴中中中中心心心心，防防防防止止止止样样样样品品品品靠靠靠靠近近近近喷喷喷喷孔孔孔孔壁壁壁壁堵堵堵堵塞塞塞塞喷喷喷喷孔孔孔孔。细细细细胞胞胞胞排排排排成成成成单单单单列列列列由由由由喷喷喷喷嘴中心喷出，形成细胞液柱
5、。嘴中心喷出，形成细胞液柱。嘴中心喷出，形成细胞液柱。嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。基本结构基本结构n n流动室和液流系统；流动室和液流系统；流动室和液流系统；流动室和液流系统；n n激光源和光学系统；激光源和光学系统；激光源和光学系统；激光源和光学系统；n n光电管和检测系统；光电管和检测系统；光电管和检测系统；光电管和检测系统；n n计算机和分析系统。计算机和分析系统。计算机和分析系统。计算机和分析系统。 三、
6、流式细胞仪可检测到的细胞参数n n非荧光信号非荧光信号颗粒度颗粒度细胞大小细胞大小= =前向角散射光（前向角散射光（前向角散射光（前向角散射光（FSCFSCFSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 = =侧向角散射光（侧向角散射光（侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSCSSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性相对复杂性相对复杂性相对复杂性血液涂片血液涂片外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图n n荧光信号荧光信号n n荧光强度
7、（荧光强度（荧光强度（荧光强度（FLFL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。uu有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）uu高高高高FLFL细胞与低细胞与低细胞与低细胞与低FLFL细胞区分
8、开来（强弱）细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）n n一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm488nm），可测出），可测出），可测出），可测出三个三个三个三个FLFL，即，即，即，即FL1FL1、FL2FL2、FL3FL3，大型的流式细胞仪装有两个，大型的流式细胞仪装有两个，大型的流式细胞仪装有两个，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（或三个激光光源（或三个激光光源（或三个激光光源（488nm488nm、633nm633nm和和和和325nm325nm
9、），可测出），可测出），可测出），可测出6 6个个个个FLFL。n n荧光信号与细胞特性荧光信号与细胞特性 荧光染料被激发而发射的光信号。荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色定量染色 荧光信号大小荧光信号大小 被标记组分含量的定量被标记组分含量的定量 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光光信号分离，导向光信号分离，导向各探测通道接收并转化为电信号。各探测通道接收并转化为电信号。光信号收集光信号收集三三数据处理及数据处理及流式报告FSC SSC FL1 FL2 FL3对数
10、对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）n n流流流流式式式式报报报报告告告告的的的的图图图图一一一一般般般般分分分分为为为为四四四四种种种种，即即即即散散散散点点点点图图图图、直直直直方方方方图图图图、密密密密度度度度图图图图和和和和二二二二维维维维等等等等高高高高图图图图等等等等。最最最最常常常常用用用用的的的的为为为为散散散散点点点点图和直方图。图和直方图。图和直方图。图和直方图。n n几个概念：几个概念：几个概念：几个概念：n n%Gated%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳阳性细胞百分比。反映细胞群体
11、中阳阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。性细胞的数量。性细胞的数量。性细胞的数量。n nMeanMean：平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。n nGeoMeanGeoMean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为几何平均荧光强度，在阳性细胞为几何平均荧光强度，在阳性细胞为几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。偏态分布时一般用该
12、值。偏态分布时一般用该值。偏态分布时一般用该值。散点图 密度图二维等高图直方图图 报告中常见的几种流式细胞图图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=点图分析点图分析点图分析点图分析流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=直方图分析直方图分析图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 五、 流式细胞术的应用n n细胞结构细胞结构细胞结构细胞结构n n细胞大小细胞大小细胞大小细胞大小n n细胞颗粒度细胞颗粒度细胞颗粒度细胞颗粒度n n细胞表面积细胞表面积细胞表面积细胞表面积n n核浆比例核浆比例核浆比例核浆比例n nDNADN
13、A含量与细胞含量与细胞含量与细胞含量与细胞周期周期周期周期n nRNARNA含量含量含量含量n n蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量n n 细胞功能细胞功能细胞功能细胞功能 细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面/ / / /胞浆胞浆胞浆胞浆/ / / /核的特异性抗核的特异性抗核的特异性抗核的特异性抗原原原原 细胞活性细胞活性细胞活性细胞活性 细胞内细胞内细胞内细胞内/ / / /外的细胞因子外的细胞因子外的细胞因子外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化蛋白磷酸化蛋白磷酸化蛋白磷酸化 pHpHpHpH值值值值 钙离子
14、浓度钙离子浓度钙离子浓度钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 一）一）细胞细胞DNA含量检测含量检测细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用PIPI（Propidiumiodide碘化丙啶），碘化丙啶），染色，因为染色，因为染色，因为染色，因为PIPI特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞DNADNA，荧光强度，荧光强度，荧光强度，荧光强度与与与与PIPI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，的结合量呈良好的
15、线性关系，根据这个原理，可测出细胞的可测出细胞的可测出细胞的可测出细胞的DNADNA含量。用于细胞周期、细胞倍含量。用于细胞周期、细胞倍含量。用于细胞周期、细胞倍含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。体以及凋亡的检测。体以及凋亡的检测。体以及凋亡的检测。单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 DNA细胞周期分析细胞周期分析细胞周期细胞周期G2MGG0 0GG1 1s 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNADNA分析分析分析分析DNA含量含量细细胞胞数数量量2N2N
16、4N4N2倍体倍体异倍体异倍体4倍体倍体肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体含量与凋亡关系含量与凋亡关系n nDNADNA亚亚亚亚G1G1峰的检测：利用峰的检测：利用峰的检测：利用峰的检测：利用PIPI染色，检测具有染色，检测具有染色，检测具有染色，检测具有亚亚亚亚GG1 1期期期期DNADNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。n n凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNADNA降降降降解，
17、分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的的的的DNADNA片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体DNADNA含量含量含量含量减少，成为亚减少，成为亚减少，成为亚减少，成为亚2 2倍体。倍体。倍体。倍体。二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研
18、究1.肿瘤诊断肿瘤诊断n nDNADNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志异倍体的出现是癌变的一个重要标志异倍体的出现是癌变的一个重要标志异倍体的出现是癌变的一个重要标志n n细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征学特征学特征学特征n n利用流式细胞仪进行细胞周期分析和利用流式细胞仪进行细胞周期分析和利用流式细胞仪进行细胞周期分析和利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNADNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括
19、监测癌前病倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。2倍体倍体异倍体异倍体4倍体倍体肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体2.凋亡研究凋亡研究n n在在在在GG0 0/G/G1 1峰峰峰峰前前前前出出出出现现现现一一一一个个个个亚亚亚亚二二二二倍倍倍倍体体体体峰峰峰峰，即即即即凋凋凋凋亡峰。亡峰。亡峰。亡峰。n n检检检检测测测测调调调调亡亡亡亡，可可可可进进进进行行行行抗抗抗抗肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤药药药药物物物物研研研研究究究究和和和和某某某某些些些
20、些因因因因素素素素对对对对细细细细胞胞胞胞的的的的损损损损伤伤伤伤机机机机理的研究。理的研究。理的研究。理的研究。AnnexinVAssay图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 图图FCM测
21、试细胞周测试细胞周期分布和凋亡期分布和凋亡根据凋亡细胞的特点来检测根据凋亡细胞的特点来检测n n在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受
22、到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏n n凋亡细胞的凋亡细胞的凋亡细胞的凋亡细胞的FSCFSC？SSCSSC？n n细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，FSCFSC？，？，？，？，SSCSSC？n nCD3(T细细胞胞，CD4、CD8)、CD19（B细细胞胞）、CD16、CD56（NK细细胞胞），原原发发性性或或继继发发性性免免疫疫缺缺陷陷病病、自自身身免免疫疫性性疾疾病病、淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖病病、肿肿瘤瘤疗疗效效观观察与预后判断、移植免疫检测等。察与预后判断、移植免疫检测等。
23、三）三）淋巴细胞分类淋巴细胞分类流式细胞术检测细胞表型 流流式式细细胞胞术术白白血血病病免免疫疫分分型型是是利利用用荧荧光光素素标标记记的的单单克克隆隆抗抗体体作作分分子子探探针针，多多参参数数分分析析白白血血病病细细胞胞的的免免疫疫表表型型，了了解解被被测测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分分析析白白血血病病免免疫疫表表型型,快快速速、特特异异、准准确确，重重复复性性好好，能能区区分分细细胞胞起起源源、划划分分其其分分化化发发育育阶阶段段等等，对对白白血血病病的的诊诊断断与与分分型型、治治疗疗方方案案选选择择与与预预后后判判断断、发发病机理研究等
24、有重要价值。病机理研究等有重要价值。四）四）白血病的免疫分型白血病的免疫分型五）五）细胞内蛋白的分析：细胞内蛋白的分析：n n细细胞胞破破膜膜后后将将细细胞胞内内某某一一蛋蛋白白成成分分进进行行荧荧光光标标记记，用用流流式式细细胞胞仪仪进进行行测测量量分分析析，同同表表型型分分析析一一样样，可可以以测测量量出出这这种种阳阳性性细细胞胞的的数数量量和和这这种种蛋蛋白白的的相相对对含含量。荧光探针多为量。荧光探针多为FITC。荧光信号荧光信号n n使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色使用不同荧光标记的单克隆抗体染色
25、，做多色分析分析分析分析n n荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光样本制备荧光样本制备双色直接染色双色直接染色端粒（荧光蛋白）端粒（荧光蛋白）六）细胞内钙离子测定六）细胞内钙离子测定1101101101106 6 6 6/ml/ml/ml/ml的细胞悬液，的细胞悬液，的细胞悬液，的细胞悬液，加入终浓度为加入终浓度为加入终浓度为加入终浓度为1-5mol/ml Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM1-5mol/ml
26、 Fluo-3/AM，充分混匀，充分混匀，充分混匀，充分混匀，室温避光作用室温避光作用室温避光作用室温避光作用60606060分钟。分钟。分钟。分钟。以以以以HEPESHEPESHEPESHEPES缓冲的缓冲的缓冲的缓冲的HanksHanksHanksHanks平衡盐溶液洗三次，重悬于平衡盐溶液洗三次，重悬于平衡盐溶液洗三次，重悬于平衡盐溶液洗三次，重悬于0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。同样的溶液，上流式细胞仪检测。同样的溶液，上流式细胞仪检测。同样的溶液，上流式细胞仪检测。根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内
27、钙离子根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。的浓度。的浓度。的浓度。FCM检测胞内钙离子、膜电位和线粒体功能M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即：所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。六六.分选：分选：n n用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，n n用于分选的效率较
28、高的仪器国内较少，台式机用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟一般分选速度为每秒钟一般分选速度为每秒钟一般分选速度为每秒钟300300300300个细胞，个细胞，个细胞，个细胞，n n大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞大型机分选速度可达到每秒上万个细胞488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto te
29、st tubesFALS SensorFluorescence detectorn n对比-流式细胞仪是一种特殊的显微镜流式细胞仪是一种特殊的显微镜流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜显微镜显微镜流动的细胞流动的细胞流动的细胞流动的细胞静止的细胞样本静止的细胞样本静止的细胞样本静止的细胞样本数量大数量大数量大数量大数量少数量少数量少数量少高速分选高速分选高速分选高速分选样本难以再利用样本难以再利用样本难以再利用样本难以再利用细胞群体特征量分布细胞群体特征量分布细胞群体特征量分布细胞群体特征量分布揭示细胞内部结构信息揭示细胞内部结构信息揭示细胞内部结构信息揭示细胞内部结构信息流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳多参数多参数多参数多参数单参数单参数单参数单参数量化的分布量化的分布量化的分布量化的分布平均值平均值平均值平均值容易检测各个参数间的容易检测各个参数间的容易检测各个参数间的容易检测各个参数间的相关性相关性相关性相关性不容易不容易不容易不容易谢谢谢谢大大家家
