生物化学PPT课件

《生物化学PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学PPT课件（103页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第一部分第一部分第一部分第一部分生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子第一章第一章 蛋白质蛋白质2021/6/161第一章第一章 蛋白质蛋白质u 本章内容简介本章内容简介u 掌握内容讲授掌握内容讲授u 本章要点回顾本章要点回顾u 本章习题本章习题2021/6/162蛋蛋白白质质（Protein，Pr）生生活活细细胞胞内内含含量量最最丰丰富富、功功能能最最复复杂杂、参参与与几几乎乎所所有有生生命命活活动动过过程程。即即蛋蛋白白质质是是生生命命活活动动的的体体现现者者催催化化功功能能、调调节节功功能能、转转运运功功能能、贮贮存存功功能能、运运动动功功能能、结结构构功功能能、支支架架功功能能、防御

2、和进攻异常功能防御和进攻异常功能2021/6/163本章主要介绍了氨基酸（本章主要介绍了氨基酸（AA）、）、Pr的基础知识。的基础知识。重点掌握重点掌握AA、Pr的结构组成、性质的特点及与的结构组成、性质的特点及与功能之间的依存关系。功能之间的依存关系。了解了解常见常见的活性肽；的活性肽；了解了解蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化的常用方法。的常用方法。2021/6/164第一章第一章 蛋白质蛋白质u1.11.1 氨基酸氨基酸u1.21.2 肽键肽键u1.3 1.3 生理活性肽生理活性肽u1.41.4 Pr Pr的分离和纯化的分离和纯化u1.51.5 Pr Pr的结构与功能的结构与功能2021/6/

3、165第一章第一章 蛋白质蛋白质1.1 1.1 氨基酸氨基酸u1.1.11.1.1 AA AA的构型的构型u1.1.21.1.2 AA AA的酸碱性质与的酸碱性质与p pK K值值u1.1.31.1.3 AA AA的茚三酮反应的茚三酮反应2021/6/166氨基酸（氨基酸（Amino acid,AAAmino acid,AA）是蛋）是蛋白质的基本结构单位白质的基本结构单位. .构成构成PrPr具具有遗传编码的氨基酸残基有有遗传编码的氨基酸残基有2020种种蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸。P2P2图图1-11-12021/6/167Aminoacidsarethebuildingblocksofpro

4、teins1919种氨基酸具有种氨基酸具有一级一级氨基氨基(-NH3+)和羧基和羧基(-COO-)结合到结合到C，同时结合到，同时结合到C上的是上的是H和各种侧链和各种侧链R；Pro具有具有二级二级氨基氨基(-NH2+,-亚氨基酸亚氨基酸) )2021/6/168二十种常见蛋白质二十种常见蛋白质AAAA的分类与的分类与结构特点结构特点据营养据营养学分类学分类必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类脂肪族脂肪族AAAA【中性、含羟基或巯基中性、含羟基或巯基( (一氨基一羧基一氨基一羧基) )、酸性酸性( (一氨基二羧基一氨基二羧基) )、碱性碱性( (二氨基一羧基二氨基一羧基)

5、 )】芳香族芳香族AA (PheAA (Phe、TyrTyr、Trp)Trp)杂环杂环AA (HisAA (His、Pro)Pro)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA(种种/9种种)不带电荷不带电荷（种（种/6种种）带电荷带电荷：正电荷：正电荷（种）负电荷（种）（种）负电荷（种）人的必需氨基酸人的必需氨基酸MetTrpLysValIleLeuPheThr 假假 设设 来来 借借 一一 两两 本本 书书ArgArg、HisHis（半必需（半必需AAAA）2021/6/169甘氨酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸丙氨酸（Ala,A）缬氨酸缬氨酸（Val,V）亮

6、氨酸亮氨酸（Leu,L）异亮氨酸异亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸含羟基或硫含羟基或硫(巯基巯基)脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸（Ser,S）苏氨酸苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸（Met,M）2021/6/1610酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺（Gln,Q）2021/6/1611碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸（Lys,K）精氨酸精氨酸（Arg,R）组氨酸组氨酸（His,H）杂环杂环2021/6/1612杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸

7、组氨酸（His,H）脯氨酸脯氨酸（Pro,P）2021/6/1613芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸色氨酸（Trp,W）2021/6/1614非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸(Gly-Ala-Val-Leu-Ile-Phe-Met-Pro-Trp疏水性逐渐增大疏水性逐渐增大) )2021/6/1615极性不带电荷极性不带电荷R基团氨基酸基团氨基酸2021/6/1616带电荷带电荷R基团氨基酸基团氨基酸Ser-Thr-Asn-Gln-Tyr-Cys-Asp-Glu-His-Lys-Arg极极性性AAAA的的R R基团亲水性逐渐增强基团亲

8、水性逐渐增强2021/6/1617二十种氨基酸的结构特点二十种氨基酸的结构特点含支链含支链AA：Val、Leu，Ile含羟基的含羟基的AA：Ser、Thr含硫的含硫的AA：Cys(含巯基含巯基)、Met(含硫甲基含硫甲基)含苯环的含苯环的AA：Phe、Trp、Tyr含胍基的含胍基的AA：Arg含咪唑基的含咪唑基的AA：His亚氨基酸：亚氨基酸：Pro含酰胺的含酰胺的AA：Asn、Gln含吲哚基的含吲哚基的AA：Trp含含-氨基的氨基的AA：Lys2021/6/16181.除除R为为H（Gly）外）外,其余其余AA均具有均具有不对称不对称-碳原子碳原子AA有有D/L-构型构型,但构成但构成Pr的

9、的AA均为均为L-氨基酸氨基酸,在生在生物界有物界有D-氨基酸的存在。氨基酸的存在。2.AA具有具有不对称不对称-碳碳原子原子AA具有具有旋光性旋光性3.各种各种AA的区别的区别在于侧在于侧链链R基基上上AAAA的结构通式的结构通式2021/6/1619AA的酸碱性质的酸碱性质 p3-4AA既含有氨基，可接受既含有氨基，可接受H H+ +，又含有羧基可电，又含有羧基可电离出离出H H+ +，所以氨基酸具有，所以氨基酸具有酸碱两性性质酸碱两性性质。通。通常情况下，氨基酸以常情况下，氨基酸以偶离子偶离子兼（两）性兼（两）性离子的形式离子的形式存在，如下图所示：存在，如下图所示： 2021/6/16

10、20AA的的等等电电点点AAAA在在酸酸性性环环境境中中主主要要以以阳阳离离子子H H2 2A A+ +的的形形式式存存在在, ,在在碱碱性性环环境境中中主主要要以以阴阴离离子子A A- -的的形形式式存存在在. .在在某某一一pHpH环环境境下下, ,以以偶偶离离子子形形式式存存在在, ,在在电电场场中中既既不不向向阴阴极极也也不不向向阳阳极极移移动动该该AAAA的的等等电电点点(isoelectricpoint，pI)，其其定定义为义为AAAA所带正负电荷相等时的溶液所带正负电荷相等时的溶液pHpH。p32021/6/1621与茚三酮的反应：除与茚三酮的反应：除Pro外，可与外，可与其它其

11、它AA生成生成蓝紫色蓝紫色化合物。化合物。Pro在在此反应中并不释放此反应中并不释放NH3，直接生成，直接生成黄色黄色化合物。在化合物。在570nm（蓝紫色）（蓝紫色）或或440nm（黄色）定量测定（黄色）定量测定（0.5-50g/ml） 与与茚三酮反应茚三酮反应2021/6/16222021/6/1623脯氨酸与茚三酮反应的产物：脯氨酸与茚三酮反应的产物：N N+ +黄色化合物黄色化合物2021/6/1624肽键肽键（peptidebond）：一个：一个AAAA的的-COOH和相邻的另一个和相邻的另一个AAAA的的-NH2脱水形成的脱水形成的共共价键价键。具有。具有部分双键部分双键性质性质不

12、能自由旋不能自由旋转转，呈呈平面平面结构结构2021/6/1625N N端端C C端端R RH HH HOOC CC Ca aN NC Ca aC CR ROON NOOC CN NC Ca aC CR ROON NC Ca aH HH HH HH HC Ca aH H肽链中从一个肽链中从一个CC原子到另一个原子到另一个CC原子之间共包含原子之间共包含的的6 6个个原子（原子（CC、C C、O O、N N、H H、CC）在空间共处）在空间共处于于同一个平面同一个平面肽肽/ /酰胺平面酰胺平面，是蛋白质空间构，是蛋白质空间构象的基本结构单位象的基本结构单位2021/6/1626肽键肽键/酰胺平面

13、与酰胺平面与-碳原子的二面角（碳原子的二面角（ 和和 ）二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的两相邻酰胺平面之间，能以共同的C C为定点为定点而旋转，绕而旋转，绕C C-N-N键旋转的角度称键旋转的角度称角，绕角，绕C-C-C C键旋转的角度称键旋转的角度称角。角。和和称作二面角，称作二面角，亦称构象角。亦称构象角。2021/6/1627脑脑啡啡肽肽：为为5 5肽肽，具具有有镇镇痛痛作作用用。有有两两种种类类型型MetMet脑啡肽脑啡肽和和LeuLeu脑啡肽脑啡肽2021/6/1628第一章第一章 蛋白质蛋白质1.4 Pr1.4 Pr的分离和纯化的分离和纯化u1.4.11.4.1 Pr

14、Pr分离、提纯一般程序分离、提纯一般程序u1.4.21.4.2 Pr Pr的溶解度分级沉淀的溶解度分级沉淀u1.4.31.4.3 目的蛋白的精制目的蛋白的精制2021/6/1629一一.分离纯化蛋白质的意义分离纯化蛋白质的意义 1.1.研究蛋白质的结构与功能：研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性要求纯度高，不变性2.2.提取活性的酶或蛋白质：提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态必须保持天然活性状态3.3.作为药物或食品添加剂：作为药物或食品添加剂：纯度达到规定要求纯度达到规定要求二、蛋白质提纯的总目标：二、蛋白质提纯的总目标：增增加加制制品品纯纯度度或或比比活活力力，设设法法除除去

15、去变变性性的的蛋蛋白白质质和和其其他杂蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。他杂蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。2021/6/1630蛋白质分离纯化的一般程序（蛋白质分离纯化的一般程序（温和条件温和条件）1.1.前处理前处理 生物组织生物组织 破碎、溶解、离心分离破碎、溶解、离心分离 蛋白质提取液蛋白质提取液2.2.粗分离粗分离 盐析、等电点沉淀、透析、超滤、有机溶剂分级分离盐析、等电点沉淀、透析、超滤、有机溶剂分级分离3.3.细分级细分级 层析、电泳、超速离心层析、电泳、超速离心 精制精制 精制品精制品4.4.结晶结晶 结晶或冻干粉结晶或冻干粉 适宜介质适宜介质2021/6/163

16、1u选择合适原料：选择合适原料：动物、植物组动物、植物组 织、基因工程表达产物织、基因工程表达产物u采用不同方法将采用不同方法将细胞破碎细胞破碎u得到含有得到含有目的蛋白的粗提液目的蛋白的粗提液控制提纯条件以避免控制提纯条件以避免PrPr变性变性2021/6/1632uPrPr在水中的溶解度在水中的溶解度取决于取决于PrPr的水合度的水合度u常用常用加入无机盐加入无机盐的方法来控制水合度的方法来控制水合度u盐溶盐溶: :当溶液中无机盐的浓度从零增加时当溶液中无机盐的浓度从零增加时, Pr, Pr的的溶解度有所增加溶解度有所增加（带电层使（带电层使PrPr分子彼此排分子彼此排斥而与水分子间的相互

17、作用加强）斥而与水分子间的相互作用加强）u盐析盐析: :当盐浓度继续增加到某一点时当盐浓度继续增加到某一点时, Pr, Pr开始开始沉淀沉淀（PrPr分子表面的水化层被移去溶解盐离分子表面的水化层被移去溶解盐离子，使子，使PrPr分子内部的疏水基团暴露出来而聚分子内部的疏水基团暴露出来而聚集沉淀）集沉淀）2021/6/1633u常用的中性盐为常用的中性盐为硫酸铵硫酸铵u不同蛋白质不同蛋白质由于所带电荷和水化程度不由于所带电荷和水化程度不同，盐析时所需同，盐析时所需盐浓度也不同盐浓度也不同，因此可，因此可以将不同蛋白质加以分离以将不同蛋白质加以分离u盐析顺序的先后差异达到分级沉淀盐析顺序的先后差

18、异达到分级沉淀 p7p7图图1-61-62021/6/1634+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉蛋蛋白白质质溶溶液液等等电电点点沉沉淀淀作作用用示示意意图图2021/6/1635透析与超滤简易装置透析与超滤简易装置2021/6/1636u层析层析: :离子交换层析离子交换层析、凝凝胶过滤层析胶过滤层析、亲和层析亲和层析、疏

19、水层析疏水层析u电泳电泳：SDS-PAGESDS-PAGE电泳、电泳、毛细管电泳毛细管电泳u超速离心超速离心: :密度梯度离心密度梯度离心2021/6/1637离子交换层析：以离子交换层析：以离子交换树脂离子交换树脂为支持为支持物，物，树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。聚合物。AAAA在树脂上结合的在树脂上结合的牢固程度牢固程度即即AAAA与树脂与树脂间的亲和力间的亲和力，主要决定于它们之间的，主要决定于它们之间的静静电吸引电吸引和和AAAA的的R R基团与树脂基质之间的基团与树脂基质之间的疏

20、水作用疏水作用。2021/6/1638阳离子交换树脂：活性基团是酸性的阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基，如磺酸基-SO3H强酸型强酸型；羧基；羧基-COOH弱酸型弱酸型 阴离子交换树脂：活性基团是碱性的阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如，如OH-2021/6/1639离离子子交交换换原原理理及及流流程程示示意意图图+2021/6/1640基本步骤：基本步骤： 装柱装柱 上样上样 分步洗脱分步洗脱 分步收集分步收集强酸型阳强酸型阳离子交换离子交换树脂树脂pH23，使所有氨，使所有氨基酸基酸带正正电荷荷，正电荷大小顺序：正电荷大小顺序：碱性碱性AA中性中性AA酸性酸性AA逐步提高逐步提

21、高洗洗脱液脱液pH和离和离子强度子强度分离分离AA混合物经常使用混合物经常使用强酸型阳离子强酸型阳离子交换树脂交换树脂，pH23上柱上柱,此时此时AA主要以主要以阳离子阳离子形式存在形式存在,与与树脂上的阳离子交换而被树脂上的阳离子交换而被“挂挂”在树脂上。在树脂上。2021/6/1641由于由于AA与树脂之间还有与树脂之间还有疏水相互作用疏水相互作用，因此，因此，除除Asn、Gln、Trp外外17种种AA的洗出顺序为：的洗出顺序为：Asp-Thr-Ser-Glu-Pro-Gly-Ala-Cys-Val-Met-Ile-Leu-Tyr-Phe-Lys-His-ArgpH3时，时，AA与树脂之间

22、的静电吸引大小顺序为：与树脂之间的静电吸引大小顺序为：碱性碱性AA2+中性中性AA+酸性酸性AA0因此因此AA的洗出的洗出顺序为顺序为酸性酸性AA中性中性AA碱性碱性AA。2021/6/1642凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理2021/6/1643亲和层析法亲和层析法2021/6/1644由于蛋白质分子中氨基酸残基的由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链侧链上存上存在游离的在游离的氨基氨基和游离的和游离的羧基羧基，因此蛋白质，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的也具有特定的等电点（等电点（pIpI）。蛋白质的两性解离与等电点蛋白质的两性解离与

23、等电点pH=pI净电荷净电荷=0pHpI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+H+OH-+H+OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+2021/6/1645+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电通电+电泳现象电泳现象电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同分子大小不同的蛋白质所带的蛋白质所带净电荷密度不同净电荷密度不同，迁移率即不同迁移率即不同，在电，在电泳时可以分开。泳时可以分开。2021/6/1646纸电泳（醋酸纤维薄膜电泳法）纸电泳（醋酸纤维薄膜电泳法）2021/6/1647SDS-PAGE凝胶电泳法凝胶电泳法低浓

24、度浓缩胶低浓度浓缩胶高浓度分离胶高浓度分离胶2021/6/1648第一章第一章 蛋白质蛋白质1.5 Pr1.5 Pr的结构和功能的结构和功能u1.5.11.5.1 Pr Pr的结构的结构u1.5.21.5.2 Pr Pr结构的研究方法结构的研究方法u1.5.31.5.3 Pr Pr的变性与复性的变性与复性2021/6/16491.5.1 Pr1.5.1 Pr的结构的结构u、 PrPr结构的结构的一般概念一般概念u、 PrPr的的一级结构一级结构u、 PrPr的的二级结构二级结构u、 PrPr的的超二级结构超二级结构和和结构域结构域u、 PrPr的的三级结构三级结构u、 PrPr的的四级结构四级

25、结构和和PrPr体系体系u、 维持维持PrPr空间结构的作用力空间结构的作用力2021/6/16502021/6/1651蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构（primarystructure）共价共价/ /初级结构，包括组成蛋白质的多肽初级结构，包括组成蛋白质的多肽链的数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多链的数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链链内或链间二硫键的数目和位置。肽链链内或链间二硫键的数目和位置。肽肽键键是主要连接键，多肽链是一级结构的主是主要连接键，多肽链是一级结构的主体。体。其中最重要是其中最重要是AAAA在肽链中的排列顺序在肽链中的排列顺序，如改变不仅影响蛋白质的高级结构，而且如改变

26、不仅影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生理功能。将直接影响其生理功能。2021/6/1652肽（链肽（链）（）（peptidechain）1 1）2/32/3个个AA组成的肽叫组成的肽叫二二/ /三肽三肽；多个；多个AA组成的肽叫组成的肽叫多肽多肽；AAAA借肽键连成长链称为借肽键连成长链称为肽链肽链2 2）肽链）肽链两端两端有自由有自由-NH-NH2 2称为称为N-N-末端末端（氨基末端（氨基末端, ,H H）和）和自由自由-COOH端称为端称为C-C-末端末端（羧基末端（羧基末端, ,OH）；有）；有开链肽开链肽和和环链肽环链肽；3 3）构成肽链的）构成肽链的AA已残缺不全，称为已残缺

27、不全，称为氨基酸残基氨基酸残基；4 4）肽链中的）肽链中的AA排列顺序一般排列顺序一般-NH2端开始，由端开始，由N N指向指向C C，即即多肽链有方向性多肽链有方向性，N N端为头，端为头，C C端为尾；端为尾；5 5）-S-S-S-S-键键也包括在也包括在一级结构一级结构中，是连接多肽中，是连接多肽链内和链链内和链间间的主要桥键；二硫键数目越多的主要桥键；二硫键数目越多PrPr结构的稳定性越强。结构的稳定性越强。2021/6/1653N N 末端：多肽链中有自由氨基的一端末端：多肽链中有自由氨基的一端C C 末端：多肽链中有自由羧基的一端末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端多肽链有两

28、端氨基酸的顺序是氨基酸的顺序是N 端端C 端的端的排列顺序。如上述五肽可排列顺序。如上述五肽可表示为：表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Glu 丝氨酰酰缬氨酰酰酪氨酰酰天冬氨酰酰谷氨酸酸COOH2021/6/1654常见二级结构构象单元有常见二级结构构象单元有3 3类：规则的二类：规则的二级结构（级结构（-螺旋螺旋、-折叠折叠）、部分规则）、部分规则的二级结构（的二级结构（-转角转角）、无规则的二级）、无规则的二级结构（结构（无规卷曲无规卷曲）等）等PrPr二级结构的概念：二级结构的概念：secondarystructure, ,多肽多肽链骨架的局部空间结构即链骨架的局部空间结构即主链

29、主链折叠形成由折叠形成由氢键氢键维系的有规则的构象。维系的有规则的构象。2021/6/1655-螺旋螺旋（-Helix）: : 是最常见最典型是最常见最典型含量最丰富的二级结构元件含量最丰富的二级结构元件（secondarystructrueelement）A:多个肽键平面通过多个肽键平面通过- -碳原子碳原子旋转旋转, ,主链绕主链绕一条固定轴形成一条固定轴形成右手螺旋右手螺旋, ,每隔每隔3.63.6个个AA残残基螺旋上升一圈基螺旋上升一圈, ,螺距为螺距为0.54nm, ,每个每个AA沿沿轴上升轴上升0.15nm, ,上升时每个上升时每个AA沿轴旋转沿轴旋转100,100,AAAA侧链侧

30、链R R分布在螺旋外侧分布在螺旋外侧2021/6/16562021/6/1657B:氢键氢键（hydrogenbond）相邻螺圈之间借相邻螺圈之间借肽键中肽键中CO和和N-H形成许多形成许多链内氢健链内氢健，即第，即第n n个个AA残基中的残基中的CO 和后面第和后面第n+4n+4个个AA残基的残基的N-H之间形成氢键，这是之间形成氢键，这是稳定稳定-螺旋的主要键螺旋的主要键CnC(NHCCO)3NCn+4OHHR3.63.613 13 ( (n ns s) )n n表示螺旋上升一圈的表示螺旋上升一圈的AAAA残基数目残基数目S S表示形成一对氢键封闭环内共价结构的表示形成一对氢键封闭环内共价

31、结构的原子数目原子数目2021/6/16582021/6/1659-折叠折叠(-pleated sheets)(-pleated sheets)，又称又称-片层片层, ,是肽链比是肽链比-螺旋伸螺旋伸展的重复性结构展的重复性结构, ,其主要作用力也其主要作用力也是是氢键氢键，氢键可以在不同肽链之，氢键可以在不同肽链之间形成间形成, ,也可以在同一肽链的不同也可以在同一肽链的不同肽段之间形成；按肽段之间形成；按-折叠的走向折叠的走向分为分为平行式平行式和和反平行式反平行式两种。两种。2021/6/1660C C端端2021/6/16612021/6/1662N1CHCC2CHNHO=C3CHNC

32、4CHNRRHOHRROHO-转角经常出转角经常出现在连接反平现在连接反平行行-折叠片的折叠片的端头。端头。- -转角转角(-turn):指指Pr的多肽链在形成空间的多肽链在形成空间构象时经常会出现构象时经常会出现180180的回折的回折，回折处的结，回折处的结构的柔性介于规则与无规则结构之间。构的柔性介于规则与无规则结构之间。2021/6/1663细胞色素细胞色素C的三级结构的三级结构无规卷曲无规卷曲randomcoil:有些多肽区段有些多肽区段具有比部分规则结具有比部分规则结构更大的柔性构更大的柔性, ,形形成成没有一定规律的没有一定规律的松散肽链结构松散肽链结构. .但但此结构也不是随机

33、此结构也不是随机出现的出现的, ,具有特定具有特定生物功能生物功能. .无规则卷曲无规则卷曲2021/6/1664超二级结构（模体超二级结构（模体/ /花式）花式）Super-secondarystructure, , 由由2 2个或几个结个或几个结构单元被连接起来，进一步组合成有特殊构单元被连接起来，进一步组合成有特殊几何排列的局域空间结构。在结构层次上几何排列的局域空间结构。在结构层次上高于二级结构高于二级结构, ,但但不具有蛋白质的功能不具有蛋白质的功能。常。常见组合方式有：见组合方式有：、。 2021/6/1665超二级结构类型超二级结构类型2021/6/1666结构域结构域（stru

34、cturaldomain）多肽链在二级或超二多肽链在二级或超二级结构基础上形成三级结构的级结构基础上形成三级结构的局部折叠区局部折叠区，是是相对独立的紧密球状实体相对独立的紧密球状实体，称为结构域。，称为结构域。其对于一些简单的球状蛋白质分子来说，还其对于一些简单的球状蛋白质分子来说，还是一个独立的功能单位或功能域（是一个独立的功能单位或功能域（fuctionaldomain）2021/6/16672021/6/16682021/6/1669多肽链在二级、超二级结构和结构域的多肽链在二级、超二级结构和结构域的基础再进一步折叠，形成基础再进一步折叠，形成包括主、侧链包括主、侧链在内的专一排布在内

35、的专一排布称为三级结构。此时分称为三级结构。此时分子内能降低结构子内能降低结构更稳定更稳定。折叠时的趋势。折叠时的趋势是大多数的是大多数的亲水的亲水的R侧基侧基分布于球形结分布于球形结构的构的表面表面，而，而疏水的疏水的R侧基侧基分布于球形分布于球形结构的结构的内部内部，形成，形成疏水的核心疏水的核心。PrPr的三级结构的三级结构（tertiarystructure）2021/6/1670肌肌红红蛋蛋白白三三级级结结构构2021/6/1671Mb的结构的结构2021/6/1672 二条或二条以上具有独立的三级结构的多肽链二条或二条以上具有独立的三级结构的多肽链(亚基，亚基，subunit)彼此

36、借彼此借非共价键（次级键）非共价键（次级键）相结相结合形成合形成四级结构。四级结构。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。亚亚基可以相同（均一四级结构），亦可以不同（非基可以相同（均一四级结构），亦可以不同（非均一四级结构）均一四级结构）亚基单独存在时没有完整的生物活性，亚基单独存在时没有完整的生物活性，只有形只有形成完整四级结构的寡聚体才有生物功能。成完整四级结构的寡聚体才有生物功能。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构（quaternarystructure）以以血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)为例：为例：2021/6/16732021/6/167

37、4HbHb的四级结构的四级结构2021/6/1675血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)2021/6/1676共价键共价键次级键次级键化学键化学键 肽键肽键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水作用疏水作用盐键盐键范德华力范德华力三、四级结构三、四级结构蛋白质分子中重要的化学键蛋白质分子中重要的化学键共价键与次级键共价键与次级键2021/6/1677维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用疏水相互作用2021/6/1678维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力多肽链多肽链2021/6

38、/16791.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法u1 1、 PrPr分子中分子中多肽链数目的确定多肽链数目的确定u2 2、 多肽链的分离：多肽链的分离：肽链的拆开肽链的拆开、 末端分析末端分析、氨基酸组成分析（离、氨基酸组成分析（离 子交换层析子交换层析自动分析仪）自动分析仪）u3 3、 多肽链的降解多肽链的降解 4 4、 肽段的分离肽段的分离u5 5、 肽段氨基酸序列测定肽段氨基酸序列测定u6 6、 肽段在多肽链中肽段在多肽链中次序的测定次序的测定u7 7、 二硫键定位二硫键定位2021/6/16801.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法 根据根据

39、PrPr的摩尔数和其的摩尔数和其N/C-N/C-末端末端的摩尔数相比来确定：一条多的摩尔数相比来确定：一条多肽链、多条相同多肽链、多条肽链、多条相同多肽链、多条不同多肽链不同多肽链p18p182021/6/16811.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法 经末端的分析，若该经末端的分析，若该Pr含有两条以上含有两条以上的肽链，而且肽链之间是通过的肽链，而且肽链之间是通过非共价非共价键键连接，使用连接，使用Pr变性剂变性剂（如（如8M尿素、尿素、6M盐酸胍）将其盐酸胍）将其变性后分开变性后分开；若；若Pr肽肽链之间通过链之间通过共价键共价键（如二硫键）相连，（如二硫键）相连，

40、则可采取则可采取过甲酸氧化法过甲酸氧化法或或巯基乙醇还巯基乙醇还原法原法将其分开将其分开p182021/6/1682二硫键可被二硫键可被氧化剂（过甲酸）氧化剂（过甲酸）或或还原剂还原剂（巯基化合物（巯基化合物巯基乙醇）巯基乙醇）打开。打开。磺基丙氨酸磺基丙氨酸2021/6/16831.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-和和C-末端残基末端残基:N-末端分析：末端分析：丹磺酰氯法丹磺酰氯法、2，4二硝基氟苯法二硝基氟苯法、Edman降解法、氨肽酶法；降解法、氨肽酶法；C-末端分析：末端分析：肼解法肼解法、羧肽酶羧肽酶法法；p182021/6/16

41、84H2NCHCOOH + RNCH3CH3O=S=OCl5-5-二甲氨基萘磺二甲氨基萘磺( (丹丹磺磺) )酰氯（酰氯（DNS-ClDNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨基酸氨基酸(具荧光性具荧光性)与与丹磺酰氯丹磺酰氯反应反应灵敏度高的灵敏度高的酰基化酰基化反应，反应，常用于测定蛋白质常用于测定蛋白质N端端AA+ HCl2021/6/1685与与2,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)反应反应sanger反反应，应，测定测定Pr的的N端端AA种类种类烃基化反应烃基化反应DNFBDNFBDNP-AA(黄色黄色)+HF弱碱中弱碱中氨基酸氨基酸20

42、21/6/1686肼解法肼解法：Pr/多肽多肽+NH2NH2氨基酸氨基酸肼化物肼化物C-C-末端末端AAAA苯甲醛苯甲醛非水溶性二苯基衍生物非水溶性二苯基衍生物水溶性水溶性C-C-末端末端AAAA在上清液中在上清液中离心法离心法 C-C-末端末端AA+DNFBAA+DNFBDNP-AADNP-AA乙醚乙醚提取提取层析层析鉴定鉴定GlnGln、AsnAsn、CysCys等等被破坏不易测出，被破坏不易测出，ArgArg转变为转变为OrnOrn。2021/6/1687羧羧 肽肽 酶酶 法法 羧肽酶羧肽酶（carboxypeptidase）是肽链外切酶，专）是肽链外切酶，专一性地从一性地从C-末端开始

43、逐个向里切，被末端开始逐个向里切，被释放的释放的AA数目和种类随反应时间而变化数目和种类随反应时间而变化有羧肽酶有羧肽酶A、B、C、Y四种：四种：羧肽酶羧肽酶A：能释放：能释放除除Pro、Arg、Lys之外之外的所有的所有C-末端残基；末端残基；羧肽酶羧肽酶B：只水解：只水解碱性碱性AA（Arg、Lys）为为C-末端末端残基的肽键；残基的肽键；羧肽酶羧肽酶A和羧肽酶和羧肽酶B混合能释放除混合能释放除Pro之外的任一之外的任一C-末端残基；末端残基；羧肽酶羧肽酶Y：可以作用于任一：可以作用于任一C-末端残基；末端残基；2021/6/16881.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究

44、方法常用常用化学法化学法和和酶解法酶解法将多肽链裂解成较小的将多肽链裂解成较小的肽段肽段化学法：化学法：用用CNBr断裂，只断裂断裂，只断裂Met形成的肽形成的肽键的键的C端一侧端一侧，反应加入，反应加入70%甲酸，可使卷曲甲酸，可使卷曲的多肽链松散开来，有利于和的多肽链松散开来，有利于和CNBr作用作用酶解法：酶解法：一般用一般用蛋白水解酶蛋白水解酶，是肽链内切酶，是肽链内切酶，能切断肽链内部某些能切断肽链内部某些AA形成的肽键。常用的形成的肽键。常用的有有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、胃蛋白酶胃蛋白酶等等2021/6/1689a a：胰蛋白酶胰蛋白

45、酶：专一性强，只断裂：专一性强，只断裂ArgArg和和LysLys形成的肽形成的肽键的键的C C端一侧端一侧，得到的是以，得到的是以ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的末端残基的肽段，产生的肽段，产生的肽段数目肽段数目等于多肽链中等于多肽链中ArgArg和和LysLys的总的总数加数加1 1。b b：胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶：作用于：作用于PhePhe、TyrTyr、TrpTrp芳香族芳香族和和疏水疏水AAAA形成的肽键的形成的肽键的C C端一侧端一侧，但水解前者速度比后，但水解前者速度比后者快。者快。最适最适pH8pH89 9。c c：胃蛋白酶胃蛋白酶：专一性与胰凝乳蛋白酶类似

46、，但要求：专一性与胰凝乳蛋白酶类似，但要求断裂点两侧都是疏水断裂点两侧都是疏水AAAA，最适最适pH2pH2，由于二硫键在酸，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此性条件下稳定，因此确定二硫键位置确定二硫键位置常用此酶来水解。常用此酶来水解。2021/6/16901.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法通常用凝胶过滤、凝胶电泳、高通常用凝胶过滤、凝胶电泳、高效液相色谱等方法分离提纯效液相色谱等方法分离提纯用用EdmanEdman化学降解法化学降解法、酶解法、根、酶解法、根据核苷酸序列推定法来测序据核苷酸序列推定法来测序2021/6/1691与异硫氰酸苯酯与异硫氰酸苯酯（PITC）

47、的反应的反应Edman反应，反应，重复测定重复测定Pr多肽链多肽链N端端AA种类种类（多肽顺序自动分析仪）多肽顺序自动分析仪）烃基化反应烃基化反应PITCPITC+苯硫乙内酰脲苯硫乙内酰脲AA(PTH-AA)+AA(PTH-AA)+多肽（多肽（n-1n-1）弱碱中弱碱中(400C)H+苯氨基硫甲酰苯氨基硫甲酰AA(PTC-AA(PTC-肽肽) )多肽多肽（n n）2021/6/16921.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法使用两种以上的方法（使用两种以上的方法（指断裂点指断裂点不一样不一样）将肽链降解成几套重叠）将肽链降解成几套重叠的肽段，测各肽段的的肽段，测各肽段的AA

48、AA顺序，然顺序，然后使用后使用片段重叠法片段重叠法推测出完整肽推测出完整肽链的链的AAAA顺序。顺序。2021/6/1693利用两套或多套肽段的氨基酸顺序利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。肽链的氨基酸顺序。2021/6/16941.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法一般采用一般采用胃蛋白酶胃蛋白酶水解水解, ,所得肽段所得肽段混合物用混合物用对角线电泳法对角线电泳法来分离确来分离确定二硫键的位置。定二硫键的位置。2021/6/1695 对角线电泳动态图解对角线电泳动态图解 2021/6/16961

49、.5.3 Pr1.5.3 Pr的变性与复性的变性与复性蛋白质变性：蛋白质变性：蛋白质立体蛋白质立体/ /空间结构受到破坏，空间结构受到破坏，肽链伸展开称为变性，蛋白质若干理化性质改肽链伸展开称为变性，蛋白质若干理化性质改变并导致其生理活性丧失。变并导致其生理活性丧失。其实质是非共价键其实质是非共价键受到破坏。受到破坏。可逆变性：可逆变性：在适当条件下，蛋白质构象由变性在适当条件下，蛋白质构象由变性状态恢复到天然状态状态恢复到天然状态不可逆变性：不可逆变性：除去变性因素后，蛋白质构象不除去变性因素后，蛋白质构象不能由变性状态恢复到天然状态能由变性状态恢复到天然状态2021/6/16971.5.3

50、 Pr1.5.3 Pr的变性与复性的变性与复性蛋白质变性的方式：蛋白质变性的方式：热变性，热变性，分子内能增加分子内能增加pH改变改变破坏破坏蛋白质颗粒之间的蛋白质颗粒之间的静电作用静电作用表面活性剂表面活性剂破坏破坏蛋白质分子内蛋白质分子内疏水作用疏水作用抢夺、破坏蛋白质内部的抢夺、破坏蛋白质内部的氢键氢键2021/6/16981.5.3 Pr1.5.3 Pr的变性与复性的变性与复性蛋白质复性：蛋白质复性：当无活性的伸展的当无活性的伸展的蛋白质进入有利于折叠的最适环蛋白质进入有利于折叠的最适环境里，则伸展的肽链就会自动折境里，则伸展的肽链就会自动折叠成天然的折叠肽，并恢复全部叠成天然的折叠肽

51、，并恢复全部活性活性2021/6/1699加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固凝固凝固的蛋白质一定发生变性凝固的蛋白质一定发生变性2021/6/16100本章要点回顾本章要点回顾20种种AA的的3个字母代表符号个字母代表符号AA的酸碱性质及的酸碱性质及等电点等电点肽键的结构肽键的结构盐溶、盐析盐溶、盐析、离子交换层析、凝胶过滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、层析、SDSPAGE电泳、超速离心电泳、超速离心蛋白质的蛋白质的结构层次结构层次蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定变性、复性变性、复性2021/6/16101本章习题本章习题1.1.默写默写2020种蛋白质种蛋白质AAAA的的3 3个字母个字母代表符号。代表符号。2.2.名词解释：等电点、盐溶、盐名词解释：等电点、盐溶、盐析、变性、复性析、变性、复性3.3.阐述蛋白质的各个结构层次。阐述蛋白质的各个结构层次。4.4.维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力有哪些？有哪些？2021/6/16102 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！