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1、Chapter 15 遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病的分子诊断1.There are many different techniques that can be used to diagnose the globin gene mutations, including gap-PCR, ARMS-PCR, and RE analysis of amplified product. globin：球蛋白：球蛋白Key Points2.Hemophilia is a congenital disease of the coagulation disorders which constitute r
2、ecessive disorders linked to chromosome X. The study was carried out by the SSCP, RELP, Southern blot, VNTR, and STR. hemophilia：血友病；：血友病； congenital disease ：先天性疾病；：先天性疾病； coagulation：凝固，凝结；：凝固，凝结；recessive：隐性：隐性3.Two multiplex PCRs are constructed in which 9 exons can be amplified simultaneously,
3、and 98% of all deletions can be identified. multiplex：多样化；：多样化； exon：外显子；：外显子； simultaneously：同时地；：同时地； deletion：缺失：缺失4.Phenylketonuria is an inborn error of metabolism resulting from a deficiency of phenylalanine hydroxylase. There are many techniques that can be used to mutation screening, such as
4、 PCR-STR, PCR-SSCP, PCR-RFLP, PCR-DGCE, and so on. Phenylketonuria：苯丙酮尿：苯丙酮尿phenylalanine hydroxylase：苯基丙氨酸羟化酶：苯基丙氨酸羟化酶5.Cystic fibrosis(CF) is caused by mutations in the CFTR gene. Five tests are most frequently used: resctriction enzyme analysis, the heteroduplex analysis, ARMS, reverse hybridizat
5、ion and OLA.Cystic fibrosis：囊胞性纤维症：囊胞性纤维症heteroduplex：异源双链核酸分子：异源双链核酸分子Hybridization：杂交：杂交6.Huntingtons disease(HD) involves a polymorphic(CAG) repeat sequence located in exon 1 of the IT15 gene at 4p16.3. HD can be accurately confirmed or excluded by PCR-based assay.Huntingtons disease(HD) ：亨廷顿病：亨廷
6、顿病7.Fragile X disease results from trinucleotide (CGG) repeat expansions. At present, diagnostic procedures of fragile X disease are based on Southern blotting and on PCR amplification. Fragile X disease ：脆性：脆性X综合征综合征 trinucleotide：三核苷酸：三核苷酸8.Two major technologies are in use for PND and PGD: PCR fo
7、r monogenic diseases and FISH for chromosomal aberrations. monogenic ：单基因的：单基因的遗传性疾病的分子诊断（遗传性疾病的分子诊断（molecular diagnosis of genetic disease）是指通过）是指通过分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，对人体健康状态和疾病做出或辅助诊断化，对人体健康状态和疾病做出或辅助诊断的方法。的方法。评估基因的评估基因的存在和缺存在和缺陷通陷通常以常以DNA为材料为材料评估基因的评估基因的表达量表达量则则以基因以基因转录或翻译转录或
8、翻译RNA/蛋白质为对象蛋白质为对象Section 1 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关。有关。基因突变的概念：基因突变的概念：遗遗 传传 物物 质质 的的 各各 种种 遗遗 传传 性性 改改 变变 称称 基基 因因 突突 变变（mutation），其其实实质质是是核核苷苷酸酸的的增增添添、缺缺失失、替替代、颠倒和转位。代、颠倒和转位。 自然条件自然条件 自发突变自发突变人为干预人为干预 诱发突变诱发突变携带突变的生物个体或群体称为突变体携带突变的生物个体或群体称为突变体（mutant）对遗传性疾病
9、的分子诊断有三种策略可供选对遗传性疾病的分子诊断有三种策略可供选择：择：1. 直接诊断策略；直接诊断策略；2. 基因多态性连锁分基因多态性连锁分析；析；3. 基因突变的定量基因突变的定量1直接诊断策略直接诊断策略通过分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病通过分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变。的各种基因突变。因此其因此其前提前提是被测基因已经被克是被测基因已经被克隆，其核酸序列和机构已被阐明。隆，其核酸序列和机构已被阐明。1.点突变的诊断：即点突变的诊断：即DNA分子中的一个碱基被另分子中的一个碱基被另一个碱基所替换，其后果取决于替换的性质和位置一个碱基所替换，其后果取决于替换的
10、性质和位置点突变背景清楚或部分清楚：点突变背景清楚或部分清楚：allele specific oligonucleotide, ASO、PCR-ELISA、allele specific amplification, ASA、PCR-RFLP、基因芯片、基因芯片点突变背景未知：点突变背景未知：single-strand conformational polymorphism, SSCP、denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE、heteroduplex analysis, HA、DNA序列测定、序列测定、protein truncation t
11、est, PTT2.片段性突变的检测：指片段性突变的检测：指DNA分子中较大范围的分子中较大范围的碱基发生突变碱基发生突变方法：方法：Southern blotting、多重、多重PCR2基因多态性连锁分析基因多态性连锁分析间接诊断，在家系中进行连锁分析和关联分析间接诊断，在家系中进行连锁分析和关联分析单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）,第第3代遗传标记代遗传标记3基因突变的定量诊断基因突变的定量诊断Section 2 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断1血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病（血红蛋白病（hemoglobinopat
12、hy, Hb）是由于编码）是由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。主要分为两大类：主要分为两大类：1.异常血红蛋白病，异常血红蛋白病，Hb发生结构上的异常，导致发生结构上的异常，导致贫血病，例如镰刀状细胞贫血贫血病，例如镰刀状细胞贫血2.地中海贫血，构成地中海贫血，构成Hb的蛋白部分的蛋白部分-珠蛋白的合成珠蛋白的合成降低或消失，也称珠蛋白合成障碍性贫血降低或消失，也称珠蛋白合成障碍性贫血珠蛋白基因珠蛋白基因& 珠蛋白基因珠蛋白基因u镰刀状细胞贫血（镰刀状细胞贫血（sickle cell anemia）1.镰刀状细胞贫血的分子机制镰刀状
13、细胞贫血的分子机制第一个成功在分子水平得以解释的人类疾病第一个成功在分子水平得以解释的人类疾病2.镰刀状细胞贫血的分子诊断方法镰刀状细胞贫血的分子诊断方法最常用的是限制性内切酶法（最常用的是限制性内切酶法（RE）u地中海贫血（地中海贫血（thalassemia）由于珠蛋白基因由于珠蛋白基因缺失或突变缺失或突变导致某种导致某种珠蛋白链合成珠蛋白链合成速率降低速率降低，造成，造成链和非链和非链合成链合成不均衡不均衡，引，引起溶血性贫血。起溶血性贫血。按照合成速率降低的珠蛋白类型分为按照合成速率降低的珠蛋白类型分为、地中海贫血地中海贫血l-地中海贫血（地中海贫血（ -thalassemia）0地贫地
14、贫是是链完全不能合成者链完全不能合成者+地贫地贫是部分是部分链合成者链合成者Hb Barts 水肿综合征水肿综合征 HbF为为2 2 链减少形成链减少形成 4聚体聚体 HbH病病 HbA为为2 2 链减少链减少,形成形成4聚体聚体 具有较高具有较高的氧的亲合力，使组织供氧不足导致贫血的氧的亲合力，使组织供氧不足导致贫血1.地中海贫血的分子机制地中海贫血的分子机制缺失型缺失型+地贫地贫 0地贫地贫1）+地贫：地贫：左侧缺失：左侧缺失：2基因基因右侧缺失：右侧缺失：2基因基因3端和端和1基因基因5端构成端构成 融合融合基因基因2) 0地贫地贫缺失缺失珠蛋白到珠蛋白到1基因基因5端缺端缺25kb只有
15、只有基因缺基因缺17.4kb 和和基因缺基因缺17.5kb 缺失缺失2基因和基因和1基因基因5端缺端缺5.2kb3）非缺失型）非缺失型地贫地贫中国人非缺失型中国人非缺失型HbH病病病因：病因：2基因的基因的125位密码子位密码子CTG（亮）突变（亮）突变CCG（脯（脯),妨碍妨碍1 1二聚体的形成，导致贫血二聚体的形成，导致贫血2.分子诊断方法分子诊断方法PCR法、法、ARMS法、法、ASA法、法、SSCP法、等位基因法、等位基因特异性扩增技术（特异性扩增技术（ASPCR）法）法 1）重型）重型地中海贫血：地中海贫血： 0/0 和和0/+链合成减少，链合成减少，链合成增加，链合成增加，HbF对
16、氧亲和力对氧亲和力高，是组织缺氧高，是组织缺氧2）轻型）轻型地中海贫血：地中海贫血： 0/A 和和+/ A3）地中海贫血：地中海贫血：和和基因缺失导致基因缺失导致链、链、链链不能合成不能合成 地中海贫血地中海贫血是是珠蛋白珠蛋白基因突变和部分缺失基因突变和部分缺失导致导致链合成速率链合成速率降低。降低。地中海贫血的分子诊断方法地中海贫血的分子诊断方法PCR-RDB法、法、PCR-ASO法、法、ASPCR法、突变寡法、突变寡核苷酸延伸扩增核苷酸延伸扩增PCR（mutant oligonucleotide extention amplification, MOEA）法、多重等位）法、多重等位基因特
17、异基因特异PCR（multiplex allele specific PCR，MAS-PCR）法、基因芯片法）法、基因芯片法2血友病（血友病（hemophilia）多数凝血因子是蛋白质，由其有关的基因编码。由多数凝血因子是蛋白质，由其有关的基因编码。由于这些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达于这些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺失即造成血友病降低或缺失即造成血友病1.甲型血友病甲型血友病概念：抗血友病球蛋白（概念：抗血友病球蛋白（antihemophilic globulin, AHG)遗传性缺乏所致遗传性缺乏所致临床表现：出血不止临床表现：出血不止分子基础：分子基础：F 由
18、由26个外显子（个外显子（9kb）25个内含子个内含子（177kb）编码）编码2351个氨基酸个氨基酸分子诊断方法：分子诊断方法：基因倒位检测和非基因倒位检测基因倒位检测和非基因倒位检测基因倒位检测：基因倒位检测：LD-PCR（长距离（长距离PCR）非基因倒位检测：非基因倒位检测：PCR-RFLP法、法、VNTR法、法、STR法、法、PCR-SSCP法法2.乙型血友病乙型血友病概念：凝血因子概念：凝血因子 即血浆凝血活成分（即血浆凝血活成分（PTC ）遗）遗传性缺乏传性缺乏临床表现：出血部位：肌肉、关节、深部组织临床表现：出血部位：肌肉、关节、深部组织分子基础：分子基础：F，长度，长度34kb
19、，8个外显子和个外显子和7个内含个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成子以及侧翼顺序中调控区域构成分子诊断方法：分子诊断方法：直接和间接方法检测直接和间接方法检测直接检测方法：直接测序法、基因芯片法和毛直接检测方法：直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳细管电泳间接检测方法：间接检测方法：RFLP法、法、SSCP法、法、DGGE法、法、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱法双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱法3肌营养不良症（肌营养不良症（hemophilia）主要有杜氏肌营养不良症（主要有杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）和贝氏营养不良症（）和贝氏营养不良症
20、（Becker muscular dystrophy, BMD）发病机制：抗肌萎缩蛋白基因的突变导致肌细胞膜发病机制：抗肌萎缩蛋白基因的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致上的抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致抗肌萎缩蛋白基因：抗肌萎缩蛋白基因：DMD基因包括基因包括79个外显子个外显子和和78个内含子，全长约个内含子，全长约2.3106bp，是目前已知人，是目前已知人类最大的基因类最大的基因分子诊断方法：分子诊断方法：多重多重PCR技术技术短串联重复序列（短串联重复序列（short tandem repeat, STR）连锁分析）连锁分析定量定量PCR技术技术RT-PC
21、R技术技术4苯丙酮尿症（苯丙酮尿症（phenylketonuria, PKU）主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病谢异常，为常染色体隐性遗传病临床表现：智力障碍、色素减少、尿特殊气味及神临床表现：智力障碍、色素减少、尿特殊气味及神经和精神症状经和精神症状分子诊断方法：分子诊断方法：PCR-STR连锁分析连锁分析PCR-RFLP多重多重ASPCR法法PCR-DGGE法法5囊性纤维化（囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）
22、由囊性纤维化穿膜传导调节因子（由囊性纤维化穿膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）基因突变所致）基因突变所致临床表现：极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及临床表现：极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数患者仅能成活数年到呼吸功能不全，多数患者仅能成活数年到10余年余年分子诊断方法：分子诊断方法：PCR-SSCP法法HA法法ARMS法法反向杂交（反向杂交（reverse hybridization）结合酶联）结合酶联免疫法免疫法OLA法法基因芯片法基因芯片法6亨廷顿病（亨廷顿病（Huntin
23、gtons disease, HD）是一种有是一种有IT15基因上基因上CAG重复序列异常扩展所重复序列异常扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征的神致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征的神经退行性疾病。经退行性疾病。临床表现：进行性恶化的运动、认知及精神障临床表现：进行性恶化的运动、认知及精神障碍的三联征。碍的三联征。7脆性脆性X综合征综合征(fragile X syndrome, FraX)遗传性智力缺陷疾病遗传性智力缺陷疾病FMR-1基因基因分子诊断方法：分子诊断方法：Southern blottingPCR法法微卫星序列分析法微卫星序列分析法Section 3 产前（包括胚
24、胎植入前）遗传缺陷产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断的分子诊断产前诊断（产前诊断（prenatal diagnosis, PND）就是在）就是在胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。植入前遗传学诊断（植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）1染色体异常分子诊断染色体异常分子诊断1.荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）2.比较基因组杂交比较基因组杂交3.间期染色体转化间期染色体转化2单基因病的产前（植入前）分子诊断单基因病的产前（植入前）分子诊断1.PND和和PND可诊断的单基因病可诊断的单基因病2.PND和和PND诊断单基因病的分子诊断技术诊断单基因病的分子诊断技术巢式巢式PCR全基因组扩增（全基因组扩增（WGA）多重多重PCR荧光荧光PCR突变分析法突变分析法
