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1、第十章外源基因表达与基因工程药物外源基因表达与基因工程药物DNARecombinationTechnologyDNA克隆、测序与重组技术的历史1973年年，Stanley Cohen等等人人首首次次获获得得体体外外重组重组DNA的分子克隆的分子克隆1977年年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的化学裂解化学裂解DNA测序问世测序问世不久，不久，Sanger 等的双脱氧测序法等的双脱氧测序法20世世纪纪90年年代代启启动动人人类类基基因因组组计计划划(human genome project，HGP)重重 组组 DNA技技 术术 学学 (Recombinant DNA T
2、echnology)重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生
3、产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。重组DNA技术重组DNA技术：又称基因工程，是DNA克隆所采用的技术和相关工作的统称。DNA克隆是重组DNA技术的核心，即将某种DNA片段与DNA载体连接成重组DNA，导入细胞进行复制，并随细胞分裂而扩增，最终获得该DNA片段的大量拷贝。一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克
4、隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 复复 制制 子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞
5、胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重组重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆过程：克隆过程：生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重
6、组DNA工艺学。工艺学。（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4 DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（修饰酶修饰酶） 末端转移酶（末端转移酶（修饰酶修饰酶） Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚
7、合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，
8、或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识别位点或其周围切割双链识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：定义：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细
9、细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：作用：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特
10、点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功异源酶：同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽
11、然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称名称 识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR Eco
12、R 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产生生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3C
13、TG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶四、修饰酶1、末端转移酶2、碱性磷酸酶3、T4多核苷酸激酶4、DNA甲基化酶目的基因(target gene)cDNA (complementary DNA) 指指经经反反转转录录合合成成的的、与与RNA (通通常常指指mRNA或或病病毒毒RNA)互互补补的的单单链链DNA。以以单单链链cDNA为为模模板板、经经聚聚合合反反应应可可合合成成双双链链cDNA。 基因组基因组DNA (genomic DNA) 指指代代表表一一个个细细胞胞或或生生物物体体整整套套遗遗传传信信息息(染
14、色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 基基 因因 载载 体体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子。分子。 常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的
15、载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载载 体体 的的 选选 择择 标标 准准能自主复制；能自主复制；具具有有两两个个以以上上的的遗遗传传标标记记物物，便便于于重重组组体体的的筛筛选和鉴定；选和鉴定；有有克克隆隆位位点点（外外源源DNA插插入入点点），常常具具有有多多个单一酶切位点，称为多克隆位点个单一酶切位点，称为多克隆位点(MCS)；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。质粒定义质粒定义1.1.质粒质粒 (plasmid)特特
16、点点: : 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 质粒载体分类1、严紧型质粒其复制于宿主染色体同步，拷贝数较低，一个细胞内仅仅有13个。2、松弛型质粒：其复制与宿主染色体不同步，可以单独复制，拷贝数较高，一个细胞内可以有10500个pBR322载体特点特点：1、分子量小2、有两个抗性基因3、是松弛型质粒应用：1、常规原核克隆载体2、构建原核表达载体3、构建其他载体pUC系列载体特点特点：1、分子量更小，拷贝数更高，不用氯霉素处理即可在每个细胞内扩增500700个拷贝。2、针对所含的
17、lacZ可以互补和蓝白筛选法筛选转化子。 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列粘性质粒粘性质粒(cosmid)粘性质粒也称柯斯载体。是带有粘性末端位点的质粒,柯斯质粒是人工建造的的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。粘性质粒用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体。cosmid
18、载体带有质的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等。粘性质粒该载体在体外重组后，可利用噬菌体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）4.其他其他重组重
19、组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取1.基因组DNA文库(genomic DNA library) 从组织细胞提取2. cDNA文库(cDNA library) 逆转录合成3. 聚合酶链反应(PCR)4. 化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基
20、因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制
21、酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA
22、聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端连接配伍末端连接 非配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割
23、切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目
24、的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在在末末端端转转移移酶酶(terminal transferase) 的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶
25、核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 4.人工接头人工接头(linker)连接连接人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(comp
26、etent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌转转 化化 作作 用用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称称为为转转化化作作用用 (transformation)。例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。转转 导导 作作 用用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感
27、感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。常用转化方法1、氯化钙法2、噬菌体感染法3、完整细胞转化法4、原生质体转化法5、电穿孔法1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）细胞筛选和（五）细胞筛选和DNA鉴定鉴定( (插
28、插入入失失活活法法) ) 抗抗药药性性标标记记选选择择 互互补补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 原原 位位 杂杂 交交 Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源
29、基因）基因组基因组DNA cDNA人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第四节目的基因表达表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化克隆基因的表达克隆基因的表达 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足表达体系的不
30、足：1、不宜表达真核基因组、不宜表达真核基因组DNA；2、不能加工表达的真核蛋白质；、不能加工表达的真核蛋白质；3、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体4、很难表达大量可溶性蛋白。、很难表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济 转染转染 将
31、表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱第五节第五节 DNA重组技术在医学中的应用重组技术在医学中的应用DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine一、重组DNA技术的应用（一）基因文库构
32、建1、基因组文库构建2、cDNA文库构建（二）定点诱变1、定点诱变技术2、PCR定点诱变二、疾病基因的发现与克隆二、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子疾病基因发现的两个典型例子: 脆性脆性X综合征综合征: 脆性脆性X X染色体是指在染色体是指在Xq27Xq27Xq28Xq28带之间的染色体呈细丝样带之间的染色体呈细丝样, ,导致其相连的末端呈随体样结构导致其相连的末端呈随体样结构, ,由于这一细丝样部位易发生断由于这一细丝样部位易发生断裂裂, ,故称脆性部位（故称脆性部位（
33、fragilesitefragilesite）。）。 Kallmann综合征综合征: 卡尔曼式综合征是一种遗传性疾病，有关的基因为卡尔曼式综合征是一种遗传性疾病，有关的基因为KALIG-1KALIG-1，位于，位于X X染色体短臂染色体短臂, ,表现为性腺发育不全伴嗅觉丧失或减退，表现为性腺发育不全伴嗅觉丧失或减退，本病呈家族性或散发性，男女均可发病，男性发病率为本病呈家族性或散发性，男女均可发病，男性发病率为1/100001/10000，女性发病率约为，女性发病率约为1/500001/50000。 三、生物制药三、生物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白
34、质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有工程药物时代的开始。迄今为止，已有5050多多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。估量的社会效益和经济效益。
35、重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织
36、损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱 基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失失或或插插入入等等突突变变。又又称称DNA诊断诊断 。四、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念（一）基因诊断的概念基本过程：基本过程： 区分或鉴定
37、区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。标准：标准：（二）基因治疗的概念（二）基因治疗的概念定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性五、遗传疾病的预防五、遗传疾病的预防
