《上海市临床科研基本实验技能培训课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《上海市临床科研基本实验技能培训课件（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海市临床科研基本实验技能培训上海市临床科研基本实验技能培训上海市临床科研基本实验技能培训上海市临床科研基本实验技能培训哺乳动物细胞培养：基础交流哺乳动物细胞培养：基础交流Meetingdate:2009/12/18SpeechmakerYouzhiHuang（PhD）E-mail:serviceresearch-:ShanghaiR&SBiotechnologyCo.,Ltd.HightechnologyandserviceEyeingforIntegratedSolutionR&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件目录目录1 1细胞培养基本概
2、念细胞培养基本概念2 2细胞培养基本要求细胞培养基本要求3 3细胞培养基本技术细胞培养基本技术4 4锐赛细胞相关技术服务锐赛细胞相关技术服务Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件一、细胞培养基本概念一、细胞培养基本概念细胞培养定义细胞培养定义细胞培养细胞培养简史简史生长类型生长类型细胞形态细胞形态传代次数传代次数Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreli
3、ablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞培养定义细胞培养定义u定义：定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。u优点：优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中
4、，时间久了，必然发生变化。 Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞培养简史细胞培养简史Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞类型细胞类型按生长方式:贴壁型细胞（Monolayercells）悬浮型细胞（Suspensioncells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类
5、型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞（Fibroblast-likedcells）上皮型细胞（Epithelium-likedcells）其它，不定型Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件 成纤维型细胞梭形或不规则三角形中央有卵圆形核胞质向外伸出长短不同的突起中胚层间质起源上皮型细胞扁平不规则多角形细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样生长内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等游走型细胞散在生长
6、，一般不连成片细胞质经常伸出伪足或突起活跃的游走或变形运动羊水细胞培养的早期多形细胞型 难以确定规律和稳定的形态 如神经组织的细胞等 细胞形态细胞形态Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件接触抑制接触抑制（Contact inhibition）细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolut
7、ion,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。细胞传代次数细胞传代次数（Passage Number）Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市
8、临床科研基本实验技能培训课件Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!原代培养（primaryculture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞系（cellline）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株（cellstrain）从原代培养细胞群中筛选
9、出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 原代培养与细胞系原代培养与细胞系上海市临床科研基本实验技能培训课件TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA细胞系资源细胞系资源Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreli
10、ablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件二、细胞培养基本要求二、细胞培养基本要求常用仪器设备常用仪器设备培养器皿培养器皿培养基培养基血清血清其他细胞培养试剂其他细胞培养试剂Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件常用仪器设备超净台或生物安全柜：超净台或生物安全柜：细胞操作CO2培养箱：培养箱：细胞培养液氮罐：液氮罐：细胞长期冻存37水浴：水浴：培养溶液预热，细胞复苏倒置显微镜：倒置显微镜：观察细胞离心机：离心机：收集细
11、胞，细胞常用300g转速5min冰箱：冰箱：细胞培养溶液分装储存负压吸引器：负压吸引器：细胞培养废液吸取Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件超净台或生物安全柜超净台或生物安全柜垂直风超净台垂直风超净台水平风超净台水平风超净台生物安全柜生物安全柜Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件Cu
12、ltureflaskCulturePlateCulturePlate 培养器皿Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞培养基细胞培养基 干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭干粉培养基需使用者自己配制并灭干粉培养基需使用者自己配制并灭干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配菌，其优点是价格便宜。缺点是配菌，其优点是价格便宜。缺点是配菌，其优
13、点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制制过程繁琐，质量不易控制制过程繁琐，质量不易控制制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规液体培养基是由专业厂家按标准规液体培养基是由专业厂家按标准规液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而模化生产，不仅质量得到保证，而模化生产，不仅质量得到保证，而模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便且使用十分方便且使用十分方便且使用十分方便 常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、（标准型）、（标准型）、
14、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-高糖高糖高糖高糖（标准型）、（标准型）、（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-低糖（标准型）、低糖（标准型）、低糖（标准型）、低糖（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5A、M199M199M199M199、F12F12F12F12等等等等Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件培养基的选择培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考
15、： 1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件血清使用注意事项血清使用注意事项1.血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个
16、月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此
17、热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件凝絮物：凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造造成
18、，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。会阻塞过滤膜。显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点小黑点”，常，常会误认为
19、血清遭受污染，而将血清放在会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此中欲培养此“微生物微生物“，但在，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。更换另一批号的血清。血清沉淀物血清沉淀物Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolu
20、tion,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，44下放置下放置7 7天即可天即可分解约分解约50%50%，所以都是在使用前添加，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上时，要重新加周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入入原来量的谷氨酰胺，故需
21、单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内培养液内使用终浓度为使用终浓度为1-4mM1-4mM一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mM200mM（29.22g/L29.22g/L）配制方法为配制方法为 ：谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mM200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温的溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，分），过滤除菌，分装小瓶，装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷谷氨酰胺
22、浓缩液，终浓度为氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 1-4mM Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件酚红酚红 大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH pH pH pH 指示指示指示指示红色表示中性红色表示中性红色表示中性红色表示中性pHpHpHpH黄色代表酸性黄色代表酸性黄色代表酸性黄色代表酸性pHpHpHpH紫色表示碱性紫色表示碱性紫色表示碱性紫色表示碱性pHpHpHp
23、H 在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用素（尤其是雌激素）样作用素（尤其是雌激素）样作用素（尤其是雌激素）样作用Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞消化液细胞消化液l l分离组织和分散细
24、胞分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞l l常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(EDTA)(EDTA)(EDTA)两种溶液，单独或混两种溶液，单独或混两种溶液，单独或混两种溶液，单独或混合使用合使用合使用合使用胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血
25、清或含血清的培养液，能终止消化作用消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na EDTA4Na EDTA4Na EDTA4Na 溶液溶液溶液溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便廉，使用方便廉，使用方便廉，使用方便 常用工作液浓度为常用工作液浓度为常
26、用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%0.02%0.02%。注意：注意：注意：注意：使用使用使用使用EDTA EDTA EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA EDTA EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技
27、能培训课件三、细胞培养基本技术三、细胞培养基本技术细胞原代培养细胞原代培养细胞换液与传代细胞换液与传代细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞计数与活力细胞计数与活力细胞污染与控制细胞污染与控制Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件鼠胎组织细胞原代培养鼠胎组织细胞原代培养 取材：取材：取材：取材：用用用用颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法使使使使孕鼠孕鼠孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠浸
28、入盛有浸入盛有浸入盛有浸入盛有75757575乙乙乙乙醇醇醇醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台超净台超净台超净台。用消过。用消过。用消过。用消过毒的剪刀毒的剪刀毒的剪刀毒的剪刀在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出子宫子宫子宫子宫置于无菌平皿中。置于无菌平皿中。置于无菌平皿中。置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀用消过毒的剪刀用消过毒的剪刀用消过毒的剪刀剪开子宫，剪开子宫
29、，剪开子宫，剪开子宫，取出取出取出取出鼠胎，鼠胎，鼠胎，鼠胎，剪去剪去剪去剪去头、爪，头、爪，头、爪，头、爪，以以以以平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液洗去血污洗去血污洗去血污洗去血污 切割：切割：切割：切割：用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液将取出的将取出的将取出的将取出的组织块组织块组织块组织块清洗三次，然后用眼科手术剪清洗三次，然后用眼科手术剪清洗三次，然后用眼科手术剪清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将刀仔细将刀仔细将刀仔细将组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎，直到成，直到成，直到成，直到成1mm1mm1mm1mm3 3 3 3左右的小块左右的小块左右的
30、小块左右的小块，再用，再用，再用，再用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清底，弃去上清底，弃去上清底，弃去上清 消化、接种培养：消化、接种培养：消化、接种培养：消化、接种培养：加入加入加入加入0.250.250.250.25胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液（5-105-105-105-10倍量倍量倍量倍量），与组），与组），与
31、组），与组织块混匀。置织块混匀。置织块混匀。置织块混匀。置37373737水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管）（每隔几分钟摇动一下试管）（每隔几分钟摇动一下试管）（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入，静止，吸去上清，加入，静止，吸去上清，加入，静止，吸去上清，加入5 5 5 510ml10ml10ml10ml细胞培养液细胞培养液细胞培养液细胞培养液，用吸管吹打混匀，移，用吸管吹打混匀，移，用吸管吹打混匀，移，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养入二个培养瓶中，
32、置于二氧化碳培养箱中培养入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄，。细胞状态细胞换液Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞传代
33、细胞传代 原代细胞传代以便获得稳定的细胞株原代细胞传代以便获得稳定的细胞株 细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 接触抑制接触抑制 营养枯竭营养枯竭 将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:21:2或或l:3l:3以上的以上的比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养 细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增3 36 6
34、次次Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞冻存细胞冻存冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：冷冻过程要缓慢： 4 304 3060 60 分钟分钟-20 30 -20 30 分钟分钟 -80 16-80 1618 18 小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长期保存液氮长期保存 或使用程序降温盒，每秒下降或使用程序降温盒，每秒下降1 1 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于9090
35、，无微，无微生物污染。生物污染。细胞浓度控制在：细胞浓度控制在：5x105x106 62x102x107 7/ml/ml。常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液5%5%或或1010DMSODMSO完全培养液完全培养液1010甘油完全培养液甘油完全培养液Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞复苏细胞复苏 快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细
36、胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37373737水浴中，轻轻摇水浴中，轻轻摇水浴中，轻轻摇水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在动冷冻管，使其在动冷冻管，使其在动冷冻管，使其在1 1 1 1 分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过3 3 3 3 分钟）分钟）分钟）分钟） 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，直接进行培养，直接进行
37、培养，直接进行培养，24 24 24 24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除以去除以去除以去除DMSODMSODMSODMSO 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中到含完
38、全生长培养液的培养瓶中到含完全生长培养液的培养瓶中到含完全生长培养液的培养瓶中Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞计数及活力细胞计数及活力Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞污染细胞污染细菌污染细菌污染真菌污染真菌污染细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除支原体污染支原体污染支原体
39、的清除支原体的清除Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细菌污染细菌污染细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablec
40、ooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件真菌污染真菌污染真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细菌和真菌的清除细菌和真菌的清除使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。Highte
41、chnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件9595以上是以下四种支原体：以上是以下四种支原体：口腔支原体（口腔支原体（M.oraleM.orale）精氨酸支原体（精氨酸支原体（M.argininiM.arginini）猪鼻支原体（猪鼻支原体（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性问题，平均发生率达到世界性问题，平均发生率达到11%11%能改变细胞的能
42、改变细胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表达及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：来源：操作环境不良操作环境不良操作人员的疏失操作人员的疏失实验器具不洁等实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的细胞已受污染的培养基、血清已受污染的培养基、血清支原体污染支原体污染Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件荧光染色法光染色法电镜检查：扫描
43、描电镜、透射透射电镜支原体培养支原体培养聚合聚合酶链反反应应(PCR)法法支原体污染检测支原体污染检测Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞胞营养液常常养液常常仍清亮但仍清亮但变黄黄,细胞生胞生长变缓，部分部分细胞胞发生脱落等等生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现支原体污染表现荧光染料荧光染料Hoechst33258Hoechst33258染色法检测支原体染色法检测支原体Hightechno
44、logyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件 支原体的清除支原体的清除支原体清除剂支原体清除剂MRA（MycoplasmaRemovalAgent）处理法）处理法每每4天换一次液，连续处理天换一次液，连续处理15天天清洗纯化法清洗纯化法细胞营养驯化细胞营养驯化优质细胞群的筛选优质细胞群的筛选细胞清洗细胞清洗反复离心洗涤反复离心洗涤原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低
45、速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。药物辅助高温处理法药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养培养18小时，可杀小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。死支原体，但对细胞有不良影响。支原体特异性血清法支原体特异性血清法用用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后体生长，故经
46、抗血清处理后11天即转为阴性，并且天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。个月后仍为阴性。Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件四、锐赛细胞相关技术服务四、锐赛细胞相关技术服务上海锐赛生物公司简介上海锐赛生物公司简介锐赛细胞相关技术服务锐赛细胞相关技术服务Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课
47、件上海锐赛生物简介上海锐赛生物简介上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验技术服务。技术服务。锐赛公司前身是一个生命科学研究交流团队，团队组建于锐赛公司前身是一个生命科学研究交流团队，团队组建于20032003年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操作、基因组分析、细胞、病毒包装、作、基因组分析、细胞、病毒包装、RNAiRNAi等多个成熟的实等多个成熟的实验平台，团队人员操作经验丰富，
48、硕士学历以上占验平台，团队人员操作经验丰富，硕士学历以上占85%85%。公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜不倦提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜不倦地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过硬的科研产品民族品牌！硬的科研产品民族品牌！ Hightechnologyandservice,EyeingforIntegra
49、tedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件锐赛细胞相关技术服务锐赛细胞相关技术服务细胞转染细胞转染瞬时转染稳定转染细胞株的构建流式细胞检测流式细胞检测细胞周期细胞凋亡细胞表面抗原（CD系列）肿瘤细胞生物学检测肿瘤细胞生物学检测细胞活力测定肿瘤细胞基质黏附实验肿瘤细胞侵袭实验病毒包装病毒包装腺病毒包装慢病毒包装逆转录病毒包装RNA干扰干扰siRNA干扰评价慢病毒RNAi干扰腺病毒RNAi干扰Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliable
50、cooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件细胞转染细胞转染瞬时转染瞬时转染特点：特点：技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（FuGene）、电穿孔仪等根据客户的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化应用：应用：观察目的基因表达蛋白在细胞中的功能（短期效应）稳定转染细胞株构建稳定转染细胞株构建特点特点：技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（FuGene）、电穿孔仪、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等根据客户选择的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化可选用高效的病毒转导方法建立稳定表达的细胞株应用抗生素筛选出稳定表达细胞株应用：应用：观察目的基因表达蛋白在某种细胞中的
51、功能（稳定，可长期研究）Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件流式细胞检测流式细胞检测特点：特点：技术平台：FACSCalibur7500 单细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析特定细胞群体的分选精度和灵敏度高，重复性好应用：应用：细胞周期细胞凋亡细胞表面抗原：CD 系列Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临
52、床科研基本实验技能培训课件肿瘤细胞生物学检测肿瘤细胞生物学检测细胞活性测定细胞活性测定特点特点：技术平台： CCK-8法CCK-8法具有操作快速、准确度高、灵敏度高、经济实用和对细胞无毒性等优点。应用：应用：生物活性因子的活性检测、大规模药物筛选、细胞增殖、细胞毒性、药敏实验等。肿瘤细胞基质黏附实验肿瘤细胞基质黏附实验特点：特点：技术平台：Transwell法结合CCK-8法应用应用：检测肿瘤细胞的基质黏附能力肿瘤细胞侵袭实验肿瘤细胞侵袭实验特点：特点：技术平台：Transwell法应用：检测肿瘤细胞的侵袭能力Hightechnologyandservice,EyeingforIntegrat
53、edSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件病毒包装系统病毒包装系统腺病毒系统腺病毒系统为复制缺陷型，生物安全性高感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞转导效率高不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性可有效进行增殖，病毒滴度高慢病毒系统慢病毒系统为第4代自身灭活复制缺陷型，生物安全性高可整合到受感染细胞的基因组，从而长期稳定表达外源目的蛋白感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，转导效率高逆转录病毒系统逆转录病毒系统可以整合从而长期稳定表达感染宿主细胞范围较广，可应用于难转染的细胞，如
54、原代细胞，转导效率高免疫原性低Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件RNARNA干扰干扰特点：特点：为靶基因设计，构建一组miRNA干扰载体采用Pol II 强启动子CMV，表达水平更高，干扰效果更强可表达出与目的基因100%同源的人工化的miRNAs，对靶基因进行切割；70%的knockdown效率绿色荧光蛋白（GFP）和感兴趣的miRNA可协同表达，方便追踪miRNA的表达针对客户靶细胞系，进行转染条件优化，确保转染效率对难于转染的细胞
55、系，可选用腺病毒或慢病毒转导的方法，确保干扰效果针对某靶基因的4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown可制备稳定沉默特定基因的细胞株Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!上海市临床科研基本实验技能培训课件Hightechnologyandservice,EyeingforIntegratedSolution,R&S,yourreliablecooperator!谢谢 谢！谢！上海市临床科研基本实验技能
56、培训课件TlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$
57、t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I
58、aLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo
59、#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5
60、G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZ
61、r$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F
62、7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUm
63、Xp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePho#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I
64、9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo
65、#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5
66、G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXs&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZ
67、r$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F
68、7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!
69、t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I
70、9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8NfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp#s
71、&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z08JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSj上海市临床科研基本实验技能培训课件
