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1、第四章第四章外植体的接种和培养外植体的接种和培养n第一节第一节外植体的接种外植体的接种n第二节第二节培养方法培养方法n第三节第三节培养条件培养条件n第四节第四节外植体褐变及防止外植体褐变及防止n第五节第五节试管苗的玻璃化现象及其预防措试管苗的玻璃化现象及其预防措施施第一节第一节外植体的接种外植体的接种n一接种室和净化工作台的消毒接种室和净化工作台的消毒n二外植体的接种外植体的接种一接种室和净化工作台消毒n1紫外灯照射紫外灯照射20分钟分钟；n270%酒精喷雾空气酒精喷雾空气；n3台面酒精棉球擦洗；台面酒精棉球擦洗；二外植体的接种n1接种工具要经常在酒精灯上烧，防止交叉接种工具要经常在酒精灯上烧
2、，防止交叉感染；感染；n2烧后的接种工具要放冷却后才能用；烧后的接种工具要放冷却后才能用；n3操作不能离超净台边缘太近，也不能太远；操作不能离超净台边缘太近，也不能太远；n4外植体应按照要求在培养基的表面或内部外植体应按照要求在培养基的表面或内部放好，不能让其在器皿中活动；放好，不能让其在器皿中活动；n5包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，包扎好后才能从台面上移走。包扎好后才能从台面上移走。n6接种时禁止谈话，防止咳嗽。接种时禁止谈话，防止咳嗽。第二节第二节培养方法培养方法n一固体培养固体培养n二液体培养液体培养一固体培养n固体培养最常用的凝固剂是琼脂，
3、使用固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用浓度为浓度为0.6-1.0%（重量（重量/体积）。固体培体积）。固体培养的最大优点是简单、方便。但缺点是养的最大优点是简单、方便。但缺点是1）只有外植体的底部表面才能接触培养）只有外植体的底部表面才能接触培养基，吸收营养，上面则不能，影响生长基，吸收营养，上面则不能，影响生长速度；速度；2）外植体插入培养基后，气体交）外植体插入培养基后，气体交换不畅，排泄的有害物质积累，造成毒换不畅，排泄的有害物质积累，造成毒害；害；3）组织受光不均匀，细胞群生长不）组织受光不均匀，细胞群生长不一致。一致。二液体培养n静止滤纸桥培养静止滤纸桥培养n震荡培养震荡培养。静止滤
4、纸桥培养这种方法主要这种方法主要用于胚培养和用于胚培养和愈伤组织培养愈伤组织培养等，目前此法等，目前此法不很普遍。不很普遍。震荡培养往复式摇床往复式摇床自旋式培养架自旋式培养架第三节第三节培养条件培养条件n一温度温度n二光照二光照n三培养基的三培养基的pH n四湿度四湿度n五氧和其它气体五氧和其它气体一温度n一般温度在一般温度在252。通常低于。通常低于15时，时，外植体生长出现停滞，但高于外植体生长出现停滞，但高于35对生对生长又不利。在促进芽发生时温度可略低长又不利。在促进芽发生时温度可略低一些。一些。二光照n光照是组织培养中的重要外界条件之一，光照是组织培养中的重要外界条件之一，它对外植
5、体生长和分化有很大的影响，它对外植体生长和分化有很大的影响，表现在光照、光质和光周期等方面。表现在光照、光质和光周期等方面。1.光照n有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。只有在暗培养的条件下才能诱导出愈伤组织。n有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分成不需要光，而有些植物则
6、光可提高幼苗的分化率。化率。n一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少的光。的光。2.光质n光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及器官的分化。织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的如对杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周周后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗，后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗，11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝周后所产生的愈伤组织也分化成
7、苗；而在蓝光下光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见周后才出现愈伤组织；白光下则为未见愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。n不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和实验才能掌握不同植物的培养规律。实验才能掌握不同植物的培养规律。n在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影响响。3.光周期n光周期对试管苗的增殖和分化的影响，光周期对试管苗的增殖和分化的影响，通常都选用一定的光周期来进行外植体通常都选用一定的光周期来进行外植体的组织培养，如一般都选用的组织培养，如一般都
8、选用16h光照、光照、8h黑暗。这在组织培养前应搞清该植物对黑暗。这在组织培养前应搞清该植物对光周期是否敏感。光周期是否敏感。n我们实验室主要采用我们实验室主要采用12h光照和光照和12h黑暗。黑暗。三培养基的pHn通常一般的培养基通常一般的培养基pH值都在值都在5.66.0之间。之间。如如pH值不适则直接影响外植体对营养物值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官的形成增殖和器官的形成。不同植物对。不同植物对pH的要的要求不同，如兰花要求求不同，如兰花要求pH值值5.2或更低一些，或更低一些，而玉米胚乳的组织培养在而玉米胚乳的
9、组织培养在7.0时愈伤组织时愈伤组织的鲜重最快的鲜重最快。四湿度n组织培养中的湿度影响有两方面：一是组织培养中的湿度影响有两方面：一是培养培养容器内的湿度容器内的湿度，它的湿度条件可常，它的湿度条件可常保持在保持在100%；二是；二是培养室的湿度培养室的湿度，它的，它的湿度变化较大。湿度过高或过低都不利湿度变化较大。湿度过高或过低都不利于组织培养。于组织培养。五氧和其它气体n氧是植物组织培养必需的。在接种时应氧是植物组织培养必需的。在接种时应避免把整个外植体全部埋在琼脂中，以避免把整个外植体全部埋在琼脂中，以免造成缺氧。培养瓶盖需要一定的透气免造成缺氧。培养瓶盖需要一定的透气性。性。n培养过程
10、中，培养物释放的微量的乙烯培养过程中，培养物释放的微量的乙烯和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害培养物。培养物。第四节第四节外植体褐变及防止外植体褐变及防止n在组织培养中，常见到外植体由于褐变在组织培养中，常见到外植体由于褐变（browning），），产生致死性的褐化物，产生致死性的褐化物，不仅使培养基变褐，而且造成培养失败，不仅使培养基变褐，而且造成培养失败，它已经成为组织培养中的一个棘手问题，它已经成为组织培养中的一个棘手问题，同时也成为植物快繁体系建立的一大障同时也成为植物快繁体系建立的一
11、大障碍。可以说碍。可以说褐变、菌类污染、和过度含褐变、菌类污染、和过度含水（玻璃化）水（玻璃化）是组织培养中的三大难题，是组织培养中的三大难题，尤其是褐变。尤其是褐变。蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象一褐变的原因n很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切当切割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破，割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶酚类化合物和多酚氧化酶
12、便流出，多酚氧化酶便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。二影响褐变因素及防止措施n1基因型基因型：木本植物较草本植物易褐变。木本植物较草本植物易褐变。n2外植体的生理状态外植体的生理状态：一般来说随着年龄和组织一般来说随着年龄和组织木质化程度增加而褐变加强。木质化程度增加而褐变加强。n3外植体的培养条件外植体的培养条件：取材料之前进行遮光处理取材料之前进行遮光处理再切取外植体，则褐变减少，暗培养或
13、低光照能减再切取外植体，则褐变减少，暗培养或低光照能减轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。n4培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养时降低无机盐的浓度可减少褐变；时降低无机盐的浓度可减少褐变；6-BA增加褐变，增加褐变，2.4-D和和NAA减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸钠、抗坏血酸、苏糖二硫醇等）可减少褐变；加入钠、抗坏血酸、苏糖二硫醇等）可减少褐变；加入吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。第五节第五节 试管苗的玻璃化现象试
14、管苗的玻璃化现象及其预防措施及其预防措施n自从自从1981年年Debergh等明确提出试植物等明确提出试植物“玻璃化玻璃化”（vitrification）概念以来，概念以来，发现在很多木本和草本试管植物中都存发现在很多木本和草本试管植物中都存在玻璃化现象。关于植物组织培养中玻在玻璃化现象。关于植物组织培养中玻璃苗的成因和防止方法的研究已经引起璃苗的成因和防止方法的研究已经引起了人们的广泛注意，成为试管苗工厂化了人们的广泛注意，成为试管苗工厂化生产中亟待解决的一个问题。生产中亟待解决的一个问题。香石竹玻璃化试管苗一玻璃苗的形态解剖与生理特点1.玻璃苗是植物组织培养中出现的半透明状的、畸玻璃苗是植
15、物组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物，不能够移栽成活。形的试管植物，不能够移栽成活。2.玻璃苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状，玻璃苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状，植株矮小、肿胀，失绿，叶片皱缩呈纵向卷曲，植株矮小、肿胀，失绿，叶片皱缩呈纵向卷曲，脆弱易碎；脆弱易碎；3.叶表皮缺少角质层蜡质，无功能性气孔，不具有叶表皮缺少角质层蜡质，无功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；栅栏组织，仅有海绵组织；4.体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素、木质素含量低；维素、木质素含量低；5.组织畸形，吸收和光合作用功能不全，分化能力组
16、织畸形，吸收和光合作用功能不全，分化能力低，难以继代、扩大繁殖；低，难以继代、扩大繁殖；6.生根困难，难移栽成活。生根困难，难移栽成活。二玻璃苗发生的因素1.玻璃化不同部位的节段外植体也与玻璃玻璃化不同部位的节段外植体也与玻璃化有关。可能与培养基渗透势不当有关化有关。可能与培养基渗透势不当有关；2.培养基中的激素也和玻璃化呈正相关培养基中的激素也和玻璃化呈正相关；3.培养瓶内气体和外界交换不畅与玻璃化培养瓶内气体和外界交换不畅与玻璃化有一定的关系有一定的关系；4.高的铵态氮也是导致玻璃化的原因之一；高的铵态氮也是导致玻璃化的原因之一；5.不同部位的节段外植体也与玻璃化有关。不同部位的节段外植体
17、也与玻璃化有关。 三玻璃苗发生的机理有关试管苗玻璃化的机理到目前为止仍未得出一致得看法。1张洪胜认为乙烯对玻璃苗的形成起启动作用；但张昆张洪胜认为乙烯对玻璃苗的形成起启动作用；但张昆瑜等在香石竹的培养基中添加瑜等在香石竹的培养基中添加ACC和乙烯利（乙烯释和乙烯利（乙烯释放剂）则有利于蛋白质的合成和干物质的含量，有利放剂）则有利于蛋白质的合成和干物质的含量，有利于组织器官发育。可见乙烯对玻璃苗作用的是较为复于组织器官发育。可见乙烯对玻璃苗作用的是较为复杂的。杂的。2李云等发现植物磷酸戊糖（李云等发现植物磷酸戊糖（HMP）途径与玻璃苗的途径与玻璃苗的产生有关。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因
18、产生有关。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快生长速度，增加了瓶中子加快生长速度，增加了瓶中CO2浓度，于是抑制浓度，于是抑制HMP进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。浓进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。浓度细胞分裂素等因子加快生长速度，增加了瓶中度细胞分裂素等因子加快生长速度，增加了瓶中CO2浓度，于是抑制浓度，于是抑制HMP进程，核酸、蛋白质、纤维素等进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。合成就减少。四控制和克服玻璃苗的措施1 1适当提高培养基的蔗糖含量或加入渗透剂，适当提高培养基的蔗糖含量或加入渗透剂，减少培养基中水分对试管苗的胁迫；减少培养基中水分对试管苗的胁迫；2
19、2适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度，降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量；度，降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量；3 3增加自然光照。自然光中的紫外线能促进试增加自然光照。自然光中的紫外线能促进试管苗的成熟加快木质化，减少玻璃化。控制温管苗的成熟加快木质化，减少玻璃化。控制温度，防止玻璃化。度，防止玻璃化。4 4改善培养器皿的透气状况；改善培养器皿的透气状况； 5 5培养基中添加其它物质。如间苯三酚或根培养基中添加其它物质。如间苯三酚或根皮苷、矮壮素、土豆汁、青霉素（皮苷、矮壮素、土豆汁、青霉素（4040万万U/LU/L）等在不同的组织培养中均有一定的效果。等在不同的组织培养中均有一定的效果。
