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1、WelcometomolecularbiologyclassTeacher:zhangjie交流QQ:173031832DepartmentLifescienceDNAreplication分子生物学系列讲座之分子生物学系列讲座之4LOGOYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREDNA Replication人类面临的一个重要问题就是生命如何延续的。其中最重要的一个机制无疑是靠DNA复制产生子代细胞。了解DNA的复制必须解决以下的问题：“在细胞分裂是另外的DNA来自哪里？DNA是如何复制的？”The main contentv3.1 Relation termsv3.2 the
2、 direction and mannerof DNA copy v3.3 Steps of DNA Replication v3.4 Topological change of DNA Replication v3.5 DNA damage and repair gene mutation3.1 Terms3.1 TermsuRepliconuOriginuTerminusuReplication forkuProkaryotesuEukaryotesuMultirepliconuAutonomously replicating sequence(ARS)uRolling circleuRe
3、plicative form(RF)uORiCorigin、direction、terminus?researchmethod：1.Isotopemarker、electronmicroscopeview、degenerationmethods2.Bacteriophageinsertingcultivatemethods：synchronouscultivate、desynchronycultivate3.denaturationmapping4.BidirectionalelectrophoresisMeselson-Stahle experiment 米西米西尔尔逊-斯塔斯塔尔尔的的实验
4、Taylor experiment 泰勒的泰勒的实验Cairns replication model 卡卡尔尔文斯的文斯的实验1、Meselson-Stahl experiment on E.coli (prokaryote)-1958米西米西尔尔逊-斯塔斯塔尔尔的大的大肠杆菌杆菌实验(原核生物原核生物)2024/7/14分子杂交分子杂交染色体标记染色体标记基因芯片基因芯片DNADNA测序测序泰勒的真核生物实验泰勒的真核生物实验n nBroad bean（蚕豆）根尖（蚕豆）根尖nn3H（氚）n nChromosome(染色体染色体)2、HerbertTayloroneukaryotewith3
5、H-19583、Cairns replication model - 1963 卡卡尔尔文斯的文斯的复制模型复制模型nEcoli （大（大肠杆菌）杆菌）n 3H-T(氚-胸腺胸腺嘧啶)思考题：思考题：n怎样证明怎样证明DNADNA的复制的方向的复制的方向? ?n复制的起点和终点在哪里复制的起点和终点在哪里? ?图图4-6 Cairns证明证明E. coli DNA双向复制的实验双向复制的实验The Replication Origin of DNAdenaturation mappingoriCoriCoriCIsotope marker&electronmicroscope viewDete
6、rminationofDNAReplicationoric molecularhybridization(method)Origination & terminitation of replication图图4-7 Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验的脉冲标记和脉冲追踪的实验图图4-8 Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析图图4-9 Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果图图4-10 DNA的半不连续复制的半不连续复制大肠杆菌大肠杆菌DNA的复制的复制DNA Replication of E. coli大肠
7、杆菌基因组4.6106bpDNA Pol 合成速度约900nt/sDNA replication time : 42min(4.6106/900/60/2=42min)实验结果表明：基因组合成需40min，分裂过程需20min，因此繁殖一代需60min两条DNA链上GATC序列中模板链A6甲基化图图4-38 甲基化对原核细胞甲基化对原核细胞DNA复制的调节复制的调节甲基供体s-腺苷甲硫氨酸终点终点起点起点起点起点终点终点起点起点起点起点终点终点起点起点起点起点终点终点起点起点起点起点10min5min15minWelcome to molecular biology classWelcome
8、to molecular biology class欢迎走进分子生物学课堂欢迎走进分子生物学课堂欢迎走进分子生物学课堂欢迎走进分子生物学课堂Teacher:zhangjieTeacher:zhangjieTeacher:zhangjieTeacher:zhangjie教师教师: : : :张杰张杰Department Life scienceDepartment Life scienceDepartment Life scienceDepartment Life science 生命科学系生命科学系生命科学系生命科学系教学目标教学目标理解理解DNADNA分子复制的分子复制的概念和必需条件概念和
9、必需条件理解理解DNADNA分子分子准确复制的原因准确复制的原因理解理解DNADNA分子复制的分子复制的过程过程, ,特点和意义特点和意义vsubstrate (底物底物) dATP、dGTP、dCTP、dTTP (dNTP)vTopoisomerase(,)v DNA hlicaseATP DnaB，PriA，Rep5335图图4-19 DNA拓扑异构酶的催化的转酯反应拓扑异构酶的催化的转酯反应图图4-20 I型型DNA拓扑异构酶的作用机理拓扑异构酶的作用机理图图4-21 II型型DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制图图4-17 DNA解链酶的作用模型解链酶的作用模型图图4-18
10、E. coli-SSB与单链与单链DNA结合的协同效应结合的协同效应Single-stranded binding protein(SSB)图图4-3 证明证明DNA复制的方向始终是复制的方向始终是53的末端终止实验的末端终止实验1957，ArthurKornberg,E.coli快停突变快停突变（fast-stopmutants）：把细菌培养温度提高以后（4245）复制迅速停止（图11-8），说明这种突变所涉及的产物和链的延伸有关。慢停突变慢停突变（slow-stopmutants）：指将细菌培养温度提高以后，DNA合成并不立即停下来，待延续一段时间后合成才会停止。慢停突变表明突变的基因和复
11、制起始有关。图图4-12 Klenow酶的晶体结构模型酶的晶体结构模型ThumbFingersPalmSchematicofDNApolboundtoaprimer:templatejunction图图4-13 DNA pol的聚合和校对的聚合和校对vDNA polymerase (DNA pol )1.聚合作用聚合作用53 2.外切酶活性外切酶活性35 3.外切酶活性外切酶活性53 4.模板结合位点模板结合位点5.引物结合位点引物结合位点6.引物引物3-OH结合位点结合位点53 p p p pOH3ACTG153 p p p pOH3ACTG153 p p p pOH3ACTG1DNA聚合酶
12、的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配硷基错配硷基复制方向复制方向正正确核确核苷酸苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸DNA聚合酶聚合酶I的的dNTP掺入效率掺入效率600dNTP/min理论需要理论需要100h的复制过程的复制过程(实际需要实际需要40min)不具有很强的推进力（不具有很强的推进力（processivity）DNA聚合酶聚合酶I 主要负责缺口平移（主要负责缺口平移（nick-translation）DNA复制酶复制酶III 具有较强的推进力（具有较强的推进力（ 50万个万个dNTP ）每秒钟掺入每秒钟掺入1000个个dNTP出错
13、率出错率10-7dNTP，加上校对（，加上校对（proofreading）活）活性，最终出错率为性，最终出错率为10-10，相当于每，相当于每1000个大肠杆个大肠杆菌只含有一个碱基错误！菌只含有一个碱基错误！vDNA polymerase DNA polymerase 1.1.聚合作用聚合作用53 53 2.2.外切酶活性外切酶活性3535 vDNA polymerase 1.1.聚合作用聚合作用53 53 2.2.外切酶活性外切酶活性35 35 vDNA polymerase DNA polymerase （DinBDinB） &（UmuCUmuC） 错误倾向修复错误倾向修复53subun
14、itsubunit numbernumbergenegenefunctionfunction 2 2polCpolCPolymerizationPolymerization activity activity 2 2dnaQdnaQ3 3 -5-5 exonuclease exonuclease 2 2holEholE organization nuclease organization nuclease 2 2dnaXdnaXTo make the core To make the core enzyme dimerizationenzyme dimerization 2 2dnaXdnaX
15、ATP enzyme depend on DNAATP enzyme depend on DNA 1 1holAholACombine Combine subunit to form subunit to form compoundcompound 1 1holBholBformform compound compound 1 1holCholCformform compound compound 1 1holDholDformform compound compound 1 1dnaNdnaNForm clampForm clamp x structure and founction of
16、Ecoli DNA pol- ProlongingfactorDNA pol- DNA pol- heterodimersheterodimersCoreenzyme校对校对Binding&recognizingprimerTo make the core enzyme dimerizationDNA pol- DNA pol- two two subunit nip DNAnip DNA图图4-15 滑动钳的三维结构滑动钳的三维结构图图4-16 真核细胞真核细胞DNA pol由由PCNA三个亚基三个亚基构成的滑动钳结构（被包被的是构成的滑动钳结构（被包被的是DNA模板）模板）3 5 3 55
17、 3 5 353如果如果DNADNA延伸到方向是延伸到方向是3 355图图4-22 E. coli引发酶的结构模型引发酶的结构模型DNA复制的引物酶（复制的引物酶（primase）和）和RNA聚合聚合酶（酶（RNA polymerase）3HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶53 p p p pOH3ACTG1图图4-23 DNA连接酶的三步核苷酸转移反应连接酶的三步核苷酸转移反应图图4-24 依赖于依赖于ATP的的DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理DNA ligase modify gapMg2+ligaseATPo
18、rNADAMP+PPiorNMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGPnick33555533templatetemplate图图4-14 DNA polI催化的缺口平移催化的缺口平移真核生物的DNA聚合酶（详见p145 ）原核生物DNA复制的过程：起始1.细细菌菌复复制制起起点点含含有有3个个13-mers和和4个个9-mers同同源源结结构构域域2.酵酵母母菌菌的的复复制制起起点点称称自自主主复复制制序序列列(ARS).其其中中“A”区区域域是是必必须须的的,而而B1,B2和和B3可可以以增增强强复复制制效率
19、效率.图图4-28 E. coli的的OriC结构结构图图4-29 E. coli DNA复制过程中引发体的形成复制过程中引发体的形成图图4-30 E. coli DNA复制过程中复制体的形成复制过程中复制体的形成图图4-31 E. coli DNA复制的延伸复制的延伸原核生物DNA复制的过程：延伸DNA延伸经过复杂模版区1.出现复制错误2.引起DNA聚合酶“停顿”（stalling，pausing）或与模板链解离3.该区段DNA序列不能合成合成策略：1.DNA跨缺刻合成（back-uppathway）2.重组依赖的DNA复制3.DNA合成重新开始35夹子夹子复合体复合体CoreCoreX X
20、PolIII3RecA+ATPRecA*RecA*RecA*SSBpolVAX图图5-20 DNA polV参与的跨损伤合成的详细步骤参与的跨损伤合成的详细步骤DNA合成的终止线性终止策略线性终止策略1.末端变成发夹结构末端变成发夹结构2.利用末端蛋白所含的氨基酸侧链利用末端蛋白所含的氨基酸侧链3.线性转化成环状线性转化成环状4.利用端粒酶策略利用端粒酶策略5.利用同源重组辅助策略进行末端合成利用同源重组辅助策略进行末端合成DNA合成的终止1.利用和DNA末端结合的蛋白质中的OH引导DNA的合成：如病毒2.把线性DNA转化成环形DNA分子：如微生物3.大肠杆菌基因组DNA合成终止：Ter位点（
21、DNAsynthesisterminationregion）图图4-32 E. coli DNA复制终止区的结构复制终止区的结构图图4-33 子代子代DNA的分离的分离v复制的起始复制的起始 识起点识起点,解超旋解超旋. 解双链解双链,复制叉复制叉. 复制体复制体,成回环成回环.v复制的延伸复制的延伸 35模板链模板链, 53长子链长子链. 53模板链模板链, 53断子链断子链.v复制的终止复制的终止 切引物切引物,补缺口补缺口. 连片段连片段,成子链成子链.解旋解旋酶酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶RNA引引物物引物酶引物酶和引发和引发体体DNA聚合聚合酶酶ISSB335355RNA引
22、物引物The characteristics of DNA replicationv半保留复制半保留复制v准确性、保真性准确性、保真性v对称性对称性v方向性方向性5353真核生物DNA的复制果蝇6.5*107nt(E.coli4.6*106)复制时间3-4min（复制速度2600nt/min）7000复制起点（originofreplication）复合体复合体origin recognition complex of protein (ORC)Orc16（G1）MCM27（GS）Cdc6,7（G1），），21，46,47前复制复合体（前复制复合体（pre-replication comple
23、x，pre-RC）首先，首先，ORC识别复制起点。识别复制起点。ORC由由6个蛋白质组成的复合个蛋白质组成的复合物，在细胞周期的所有阶段都物，在细胞周期的所有阶段都在复制起始点位置，在复制起始点位置，它是它是Pre-Rc复合物组装的平台复合物组装的平台 ORC结合后募集两个解旋酶装载蛋白结合后募集两个解旋酶装载蛋白Cdc6和和Cdtl（解除复制起始抑制因子（解除复制起始抑制因子geminin的作用）的作用）ORC和装载蛋白共同募集和装载蛋白共同募集Mcm2-7复合体复合体 图图4-39 酵母细胞酵母细胞DNA复制的正调控复制的正调控 细胞进入细胞进入S期后，期后，pre-RC被蛋白激酶被蛋白激
24、酶Cdk（cylcin -dependent protein kinase）和）和Ddk（Cdc7/Dbf4）激活，）激活，使复制得以启动使复制得以启动 Cdc6在S期被快速降解，它不能再次负载Mcm与复合物结合，所以复制起点在S期不能被再次起始聚合酶在起始位点的组装是以DNA聚合酶和先结合，聚合酶后结合的顺序进行，然后才合成第一个RNA引物。真核生物DNA的负调控S-Cdk触发pre-RC的启动，同时阻止重新起始复制Geminin蛋白图图4-36 真核细胞真核细胞DNA复制叉的结构模型复制叉的结构模型生老病死生老病死, ,是人类生命最为简洁的概括是人类生命最为简洁的概括但其中却蕴藏了无数的奥
25、秘但其中却蕴藏了无数的奥秘2009年诺贝尔生理学或医学奖授予美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白布莱克本(ElizabethBlackburn)、美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院的卡罗尔-格雷德(CarolGreider)、美国哈佛医学院的杰克绍斯塔克(JackSzostak)以及霍华德休斯医学研究所，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。图图4-25 端粒端粒DNA的防的防“修复修复”机制机制图图4-26 端粒酶的结构模型端粒酶的结构模型2024/7/105端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型35TTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA35TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT35AATTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT53nAA3TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT53TTCCCCTnAA3TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT53TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸
