流式细胞术的临床应用

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1、流式细胞术在临床上的应用流式细胞术在临床上的应用 第一部分 流式细胞仪（FCM)）工作原理FCMFCM系统结构系统结构流体系统：样本流、鞘液流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、光学系统：激光光源、分光镜、滤片、 散射光和荧光探测器散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统系统、偏转系统数据处理系统：计算机工作站数据处理系统：计算机工作站FCMFCM工作原理流程：工作原理流程：样本（血液实体组织）单细胞悬液荧光染料特异染色的样本上机细胞单列通过测量区1.散射光信号2.荧光信号分离、收集、分析、光信号细胞理化特性分析图

2、加入荧光染料激光激发流式细胞仪的构造及原理流式细胞仪的构造及原理FCMFCM测量光信号获取与分析测量光信号获取与分析散射光信号前向散射光(FSC)-细胞大小侧向散射光（SSC)-细胞粒度（膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量）FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易区分二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)Lym(R3)Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)R1R2Incident Light SourceRight Angle Light Dectector

3、a Cell ComplexityForward Light Detector a Cell Surface AreaR3R2R1根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易的区分出二维点图，可以容易的区分出Lym(R3) .Gran(R1)Lym(R3) .Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)流式细胞术常用染料及检测波长流式细胞术常用染料及检测波长荧光染料的发射不同波长荧光染料的发射不同波长DNA DNA 和和RNARNA荧光探针的理化特性荧光探针的理化特性荧光探针荧光探针 分子量分子量 结合方式结合方式 碱基特异性碱基特异性 激发锋（激发锋（nm) nm) 发射锋

4、发射锋(nm)(nm)P1 668 P1 668 嵌入嵌入 无无 493 630493 630EB 394 EB 394 嵌入嵌入 无无 482 616482 616MI 1069 MI 1069 非嵌入非嵌入 G-C 320,445 575 G-C 320,445 575 CA3 1183 CA3 1183 非嵌入非嵌入 GC 320,445 575 GC 320,445 575 HO33258 624 HO33258 624 非嵌入非嵌入 AT 343 480 AT 343 480 HO33342 615 HO33342 615 非嵌入非嵌入 AT 343 455AT 343 455DAP

5、I 350 DAPI 350 非嵌入非嵌入 AT 540 650AT 540 6507-AAD 1270 7-AAD 1270 嵌入嵌入 GC 540 655 GC 540 655 AO 370 AO 370 嵌入嵌入 ( (双链）双链） 无无 492 530492 530 静电（单链）静电（单链） 640640PY 303 PY 303 嵌入嵌入 ( (双链）双链） GCAT 549-562 565-574GCAT 549-562 565-574 静电（单链）静电（单链）细胞周期分析细胞周期分析通过荧光探针对细胞周期进行相对通过荧光探针对细胞周期进行相对DNADNA含量的测定，可分析细含量的

6、测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNADNA异倍体异倍体G1SG2GoM分选系统（分选系统（Sorting)Sorting)依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：电荷式分选电荷式分选稳定液流测量区液滴形成液滴充电液滴偏转分选收集逻辑电路电荷式分选电荷式分选通道式分选通道式分选稳定液流测量区逻辑电路捕获管分选收集 第二部分第二部分 流式细胞术在临床医学中的应用流式细胞术在临床医学中的应用流式临床应用流式临床应用淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析Th1/Th2 肿瘤学肿瘤学HLA-B27P

7、NH 四聚体四聚体血小板活化血小板活化 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫常常用用淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群报报告告模模式式R深圳深圳市人市人民医民医院流院流式细式细胞术胞术报告报告单模单模式式HLA-B27通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。 Th1/Th2细胞 肿瘤学肿瘤学 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫 四聚体四聚体Tetramer-原理原理内源性抗原内源性抗原外源性抗原外源性抗原Tetramer-原理原理MHC Class I-HLA-A2Tetramer-原理原理

8、Tetramer-原理原理国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽限定性肿瘤抗原肽抗原特异性抗原特异性CTL的分析方法的分析方法51Cr释放实验释放实验PCR法法酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体Tetramer法法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力难以广泛应用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法有限稀释法(LDA)用用Tetramer法研究表明，外周血中仅有法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5

9、% 的的CD8+细胞对细胞对CMV和和EBV特异特异Tetramer法法Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cellsJ. Science,1998,280:227了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard)Tetramer-应用应用感染性疾病感染性疾病HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSVBreast, Prostate, Melanoma, Col

10、on, Lung, Cervical, Ovarian and LeukemiaDiabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligoEBV and CMV 移植移植 自身免疫性疾病自身免疫性疾病肿瘤肿瘤感染性疾病感染性疾病Tetramer-应用应用-例证例证含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者用黑色素瘤抗原诱导潜在的

11、肿瘤特异性T细胞用Tetramer分离，富集GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败-HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力 移植移植肿瘤肿瘤 第三部分第三部分 定量流式细胞术定量流式细胞术 定量流式细胞术的概述定量流式细胞术的概述定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。对计量，而不是阳性

12、细胞的相对百分数。原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义治疗等具有重要意义。血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit特点特点可定量与血小板相关的任何抗原(如

13、CD41, CD61, CD42a等)免洗间接法一抗亚型为IgG1, IgG2a或IgG2b定量范围宽(500-90,000 分子/血小板 )定量准确，CV值(变异系数)小血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit标准曲线标准曲线血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit结果结果血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator KitCD41/61复合物变形与复合物变形与Firb

14、rinogen结合，为结合，为初期血栓初期血栓形成的关键步骤形成的关键步骤PLATELET Fibrinogen Kit应用应用心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等)监测抗凝集治疗(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等)检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能力血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力血小板活化状态(ex vivo)标本处理标本处理PLATELET Fibrinogen Kit白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator K

15、it特点特点可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等)单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数)多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+ T细胞上CD28分子数)全血和分离的细胞(如细胞株等)均可间接法一抗亚型为IgG1和IgG2a定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞 )定量准确，CV值(变异系数)小白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit标准曲线标准曲线白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit结果结果白细胞表面抗原定量

16、白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator KitBlood Dendritic Cell Enumeration KitDCDC作用作用：1.树突状细胞（dendritic cell,DC）为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与MHC二类分子结合向其它免疫活性细胞传递抗原信息。 2.骨髓样DC（MDC）和淋巴样DC(PDC).在诱导和调控免疫应答方式上完全不同：首先它们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反应，即使受到相同的抗原刺激。骨髓样DC（MDC）与Th1效应相关,而淋巴样DC（PDC）与Th2效应有联系； 已经应用

17、的领域包括已经应用的领域包括：1）SLE病人病情和疗效观察；2）AIDS病人免疫机能分析；3）病毒性肝炎病人免疫状况研究；4）疫苗研究。特点特点简便、简便、快捷、快捷、绝对计数绝对计数DC亚群数亚群数/ml最新技术最新技术计数血液中循环内皮细胞的标准方法计数血液中循环内皮细胞的标准方法循环内皮细胞循环内皮细胞(CEC)增加于增加于CELLQUANT FF-CD146急性冠状动脉综合征血小板减少性紫癜镰刀细胞贫血败血症狼疮肾病综合征器官移植排斥手术创伤癌症传统方法传统方法显微镜检，手工计数。费时，费力，无法标准化新技术新技术新标准新标准CELLQUANT FF-CD146免疫磁珠富集与3色流式细

18、胞术结合仅需1 mL血整个过程不到1个小时灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞重复性好，室间差(Interlaboratory CV)小方法方法CELLQUANT FF-CD146将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶) (确定有核细胞) CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰) CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点) 标准浓度微球(用于绝对计数)流式分析(循环内皮细胞鉴定) 有核细胞(PI+); CD45-; CD146+;前向散射角(FSC)范围宽CELLQUANT FF-CD146PI-CD45 FITCCELLQUANT FF-CD146PI-CD45 FITCCELLQUANT FF-CD146CELLQUANT FF-CD146CELLQUANT FF-CD146 第四部分第四部分 在医学研究中的应用在医学研究中的应用优点：1.1.临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具2.2.可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价3.3.可与世界研究水平同步可与世界研究水平同步4.4.临床医师不需亲自参与试验过程临床医师不需亲自参与试验过程5.5.研究工作周期短研究工作周期短