《DNS-Cl末端氨基测定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNS-Cl末端氨基测定（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、n1、实验对象、实验对象n2、实验目的、实验目的n3、实验技术、实验技术n4、实验意义、实验意义胰岛素胰岛素N-N-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定实实 验验 二二背景介绍背景介绍胰岛素原（胰岛素原（Proinsulin）一级结构）一级结构 胰岛素（胰岛素（Insulin）一级结构）一级结构 N端分析方法端分析方法n二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNPDNP法或法或DNFBDNFB法）法）n丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNSDNS法）：法）：灵敏度最好灵敏度最好n苯异硫氰酸苯异硫氰酸( (酯酯) )法（法（PITCPITC法、法、PTCPTC法、法、PTHPTH法、法、EdmanEdman降解法）降
2、解法）n氨肽酶法氨肽酶法DNPDNP法法2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯DNP-蛋白质蛋白质DNP-aaEdmanEdman降解法降解法异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰肽苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽肽 ）苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫氨基酸苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa ）DNSDNS法法5-(二甲胺基二甲胺基)萘萘-1-磺酰氯磺酰氯(DNS-Cl)DNS-Edman测序法测序法实验原理实验原理n在在碱性条件下，碱性条件下，DNS-DNS-ClCl （二甲氨基萘磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与氨基酸的可以与氨基酸的游离氨基（游离氨基（- -氨基）氨基）作用，作用，得到丹磺酰得到丹
3、磺酰- -氨基酸氨基酸( (DNS-DNS-aaaa) )，在紫外灯照射，在紫外灯照射下发强烈的黄色荧光；下发强烈的黄色荧光；n蛋白质蛋白质N N末端的氨基酸具有末端的氨基酸具有- -自由氨基自由氨基，因，因此可以用此可以用DNSDNS法进行法进行N-N-端氨基酸的测定。端氨基酸的测定。实验原理实验原理nDNS-DNS-ClCl与蛋白质与蛋白质N-N-末端的氨基酸自由氨基末端的氨基酸自由氨基在弱碱条件下作用，生成在弱碱条件下作用，生成DNS-DNS-蛋白质蛋白质，再，再经酸水解，得到经酸水解，得到DNS-NDNS-N端氨基酸端氨基酸；n在酸性条件下，用乙酸乙酯抽提，然后和在酸性条件下，用乙酸乙
4、酯抽提，然后和标准标准DNS-DNS-氨基酸一起氨基酸一起层析层析，就可以进行肽，就可以进行肽链链N N末端氨基酸的鉴定。末端氨基酸的鉴定。层析技术的原理层析技术的原理 利用混合物中各组分的利用混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质的的差异，使各组分以不同程度分布在差异，使各组分以不同程度分布在两相两相中，中，其中一个是其中一个是固定相固定相，另一个是，另一个是流动相流动相。当。当流动相流经固定相时，由于各组份随流动流动相流经固定相时，由于各组份随流动相前进的速度不同，从而达到分离。相前进的速度不同，从而达到分离。层析技术分类层析技术分类n分配层析n凝胶层析n离子交换层析n亲和层析n高效液相
5、层析聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜n聚酰胺是由聚酰胺是由己二酸与己二胺己二酸与己二胺聚合而成或由聚合而成或由己内酰胺己内酰胺聚合而成的高分子化合物；含有大量酰胺基团，其聚合而成的高分子化合物；含有大量酰胺基团，其羰基羰基可可与含羟基的物质与含羟基的物质形成形成氢键氢键，而产生吸附作用。，而产生吸附作用。聚酰胺薄膜层析的原理聚酰胺薄膜层析的原理n聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析是指样品溶液随流动相通过聚酰胺是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子形成薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子形成氢键氢键的能力的能力不同，致使不同，致使吸附能力吸附能力不同；不同；n选用合适的展层剂，使被分离的物质在选用
6、合适的展层剂，使被分离的物质在溶剂溶剂和和聚酰聚酰胺薄膜表面胺薄膜表面的的分配系数分配系数有较大的差异，经过有较大的差异，经过吸附与吸附与解吸解吸的过程，而将各组分分离；的过程，而将各组分分离；n聚酰胺薄膜层析灵敏度高，操作方便，速度较快。聚酰胺薄膜层析灵敏度高，操作方便，速度较快。溶剂前沿溶剂前沿层析点层析点原点原点BA 物质被分离后在纸层析图物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用谱上的位置是用R Rf f值来表示的。值来表示的。在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的R Rf f值是常数。值是常数。 R Rf f 原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离A原点到溶剂前沿的距离
7、原点到溶剂前沿的距离B 结果记录：比移值结果记录：比移值Rf实验方法实验方法DNS-DNS-胰岛素的制备胰岛素的制备胰岛素的制备胰岛素的制备10.1ml胰岛素+ + 0.1ml DNS-Cl丙酮（摇匀、封口）电吹风热风蒸发除去丙酮，加0.2ml 6M HCl，封口后于110 烘箱中水解22h40保温1.5-2h乙酸乙酯抽提，上层液用于层析倒入5ml小烧杯，煤气加热蒸发盐酸，加少量蒸馏水，并用 0.1M HCl酸化至PH22.50.5ml标准氨基酸+ + 0.5ml DNS-Cl丙酮溶液（摇匀、封口）DNS-DNS-标准氨基酸的制备标准氨基酸的制备标准氨基酸的制备标准氨基酸的制备2电吹风热风蒸发
8、除去丙酮，0.1M HCl酸化至PH22.540水浴0.5h乙酸乙酯（约500ul），摇匀，分层后用毛细管吸取上层液用于层析n在聚酰胺薄膜距边线在聚酰胺薄膜距边线1cm1cm处，用铅笔处，用铅笔标记标记3 3个点；个点；n毛细管点样标准品毛细管点样标准品3 3次，胰岛素样品次，胰岛素样品3 3次，次，直径直径不超过不超过2mm2mm，每次点样都要电吹风，每次点样都要电吹风冷风冷风吹干吹干；n放入层析缸展层剂中展层（时间大约放入层析缸展层剂中展层（时间大约6-6-10m10m），完毕后电吹风），完毕后电吹风冷风吹干冷风吹干。DNSDNS氨基酸的层析氨基酸的层析氨基酸的层析氨基酸的层析3n在紫外灯
9、在紫外灯360nm360nm下检测实验结果，下检测实验结果，画出图谱，画出图谱，计算计算RfRf值值。n比较胰岛素的比较胰岛素的DNS-NDNS-N末端氨基酸和标准末端氨基酸和标准DNS-DNS-氨基酸的层析图谱，从而氨基酸的层析图谱，从而确定蛋白质样品确定蛋白质样品的的N-N-末端氨基酸种类末端氨基酸种类。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素N-N-末端氨基酸的确定末端氨基酸的确定末端氨基酸的确定末端氨基酸的确定4试剂试剂器材器材0.2M NaHCO32.5mg/ml DNS-Cl丙酮溶液丙酮溶液0.1M 和和6M HCl展层剂苯：冰醋酸展层剂苯：冰醋酸=9:1(V/V)乙酸乙酯乙酸乙酯标准的苯丙氨酸和甘氨酸溶液标准的苯丙氨酸和甘氨酸溶液胰岛素（胰岛素（ 0.2M NaHCO3配成）配成）聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜层析缸、毛细管、小指管层析缸、毛细管、小指管紫外检测仪、电吹风紫外检测仪、电吹风PH试纸试纸
