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1、植物植物DNADNA的提取与纯化的提取与纯化 DNA extractionDNA extraction实验一实验一实验原理实验原理植植物物DNADNA的的分分离离是是分分子子生生物物学学、遗遗传传学学和和育育种种学学等等植植物物科科学学研究的基础要求。对研究的基础要求。对DNADNA提取一般有三个要求：提取一般有三个要求：1. DNA1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求的纯度可以满足下游操作的要求2. DNA2. DNA必须完整必须完整3. DNA3. DNA应当有足够的量应当有足够的量构构建建基基因因组组文文库库，初初始始DNADNA长长度度必必须须在在100kb100kb以以上上, ,
2、否否则则酶酶切切后两边都带合适末端的有效片段很少。后两边都带合适末端的有效片段很少。RFLPRFLP和和PCRPCR分分析析，DNADNA长长度度可可短短至至50kb50kb，在在该该长长度度以以上上，可可保保证证酶酶切切后后产产生生RFLPRFLP片片段段(20kb(20kb以以下下) )，并并可可保保证证包包含含PCRPCR所所扩扩增的片段增的片段( (一般一般2kb2kb以下以下) )。如如果果对对植植物物进进行行大大规规模模筛筛选选，操操作作程程序序应应当当快快捷捷，简简便便，价价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。核酸的理化性质核酸的理化性质RNARN
3、A和和核核苷苷酸酸的的纯纯品品都都呈呈白白色色粉粉末末或或结结晶晶，DNADNA则则为为白白色色类类似似石石棉棉样样的的纤纤维维状状物物。除除肌肌苷苷酸酸、鸟鸟苷苷酸酸具具有有鲜鲜味味外外，核核酸酸和和核苷酸大都呈酸味。核苷酸大都呈酸味。 DNADNA、RNARNA和和核核苷苷酸酸都都是是极极性性化化合合物物，一一般般都都溶溶于于水水，不不溶溶于于乙乙醇醇、氯氯仿仿等等有有机机溶溶剂剂，它它们们的的钠钠盐盐比比游游离离酸酸易易溶溶于于水水，RNARNA钠钠盐盐在在水水中中溶溶解解度度可可达达40g/L40g/L。DNADNA在在水水中中为为10g/L10g/L，呈呈黏黏性性胶胶体体溶溶液液。在
4、在酸酸性性溶溶液液中中，DNADNA、RNARNA易易水水解解，在在中中性性或或弱弱碱碱性性溶液中较稳定。溶液中较稳定。 天然状态的天然状态的DNA DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)形式存在于细胞核形式存在于细胞核中。要从细胞中提取中。要从细胞中提取DNADNA时，先把时，先把DNPDNP抽提出来，再把蛋白质抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去和糖去除，同时除去RNARNA及无机离子等，从中分离及无机离子等，从中分离DNA DNA 。 核酸的提取方法核酸的提取方法提提取取植植物物DNADNA的的方方法法主主要要采采用用SDSSDS和和CTABCTAB法法，对对
5、它它们们进进行行稍稍加加修修改改就就可可以以应应用用于于DNADNA的的微微量量提提取取。两两种种方方法法均均采采用用去去污污剂剂裂裂解解细细胞并保护胞并保护DNADNA不受内源核酸内切酶降解。不受内源核酸内切酶降解。具具体体方方法法简简单单说说来来就就是是利利用用液液氮氮对对植植物物组组织织进进行行研研磨磨，从从而而破破碎碎细细胞胞。细细胞胞提提取取液液中中含含有有的的SDSSDS溶溶解解膜膜蛋蛋白白而而破破坏坏细细胞胞膜膜，使使蛋蛋白白质质变变性性而而沉沉淀淀下下来来。EDTAEDTA抑抑制制DNADNA酶酶的的活活性性。再再用用酚酚、氯氯仿仿抽提的方法去除蛋白，得到的抽提的方法去除蛋白，
6、得到的DNADNA溶液经乙醇沉淀。溶液经乙醇沉淀。实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：新鲜植物组织。实验材料：新鲜植物组织。100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)50mmol/L EDTA500 mmol/L NaCl1.5% SDSDNA提取缓冲液提取缓冲液实验所需试剂：实验所需试剂：24:1/氯仿氯仿:戊醇戊醇其它试剂：液氮、其它试剂：液氮、TE缓冲液，缓冲液，无水乙醇、无水乙醇、70%乙醇。乙醇。2CTAB buffer 1.4M NaCl 2% CTAB 0.2% 巯基乙醇巯基乙醇酚酚/氯仿（氯仿（1:1） 氯仿：氯仿：50 ml无水乙醇无水乙醇实验仪器实验仪器实验步
7、骤：实验步骤：1.取新鲜叶片约取新鲜叶片约3g, 剪碎剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；离心管中；2. 在在65预热的提取液中按预热的提取液中按加入加入Na Bisufite, 混匀并调混匀并调pH至至；1.3. 在管中加入适量提取液，在管中加入适量提取液，60水浴保温约水浴保温约30min，不时颠倒混匀；，不时颠倒混匀； 2.4. 冷却至室温后加入等体积氯仿冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右；左右；3.5. 室温下室温下10000rpm离心离心15min，小心吸上清于新的离心管中
8、，加入两倍，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，体积的冷酒精，-20 放置放置1h或过夜；或过夜；4.6. 挑出挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量入适量70%酒精，摇动洗涤酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤，重复洗涤2-3次；次； 5.7. 吹干吹干DNA，加入适量，加入适量TE在在65溶解，完全溶解后离心去除杂质；溶解，完全溶解后离心去除杂质； 6.加入加入RNase（10mg/mL）, 室温处理室温处理, 除去除去RNA，4或或-20贮存。贮存。 7.如需纯化如需纯化DNA，再加入适量，再加入
9、适量TE，氯仿，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加异戊醇多次抽提后吸取上清，加入入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇，和两倍体积的乙醇， -20 放置放置1h或过夜；或过夜；8.吹干沉淀后，加入适量吹干沉淀后，加入适量TE， 65溶解，溶解， 4或或-20贮存。贮存。 1. 1. 植物叶子约植物叶子约3 3g, g, 剪碎置剪碎置预冷预冷研钵中研钵中 加入液氮充分研磨，注意加入液氮充分研磨，注意不能干磨不能干磨混合球磨仪混合球磨仪3. 603. 60水浴保温水浴保温30-6030-60minmin加入等体积氯仿，用力摇匀加入等体积氯仿，用力摇匀6. 6. 再次再次10000rpm10000r
10、pm离心离心5 5minmin； 将上清小心吸入新的离心管中；将上清小心吸入新的离心管中； DNADNA样品在样品在1% Agarose1% Agarose胶上电泳（例图）胶上电泳（例图） 实验注意事项实验注意事项1.1.微微量量移移液液枪枪的的使使用用一一定定要要规规范范，吸吸取取氯氯仿仿等等有有机机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；试剂要注意不要将试剂吸入枪中；2.2.提提取取过过程程中中的的机机械械力力可可能能使使大大分分子子DNADNA断断裂裂成成小小片片段段，所所以以为为保保证证DNADNA的的完完整整性性，各各步步操操作作均均应应较较温温和，避免剧烈震荡。和，避免剧烈震荡。3.3.尽尽量量取取材材幼幼嫩嫩组组织织，最最好好在在早早晨晨取取材材，可可以以避避免免过多的糖分污染过多的糖分污染
