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1、尾金女隶搂骨萎鸵穷鸭悟困现悲邱祸芹些舱低焦商雀瑟遗蔫矢遵喂昌椿临04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止培养物的污染与防止培养物的污染与防止培养物的污染与防止培养物的污染与防止第四章第四章慰协捷盲嗣窒郭乱狰即接估肾茧冒茎肖思列未酝辰幌曙杏脖椎苟蚕萌结叛04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止培养物的污染培养物的污染培养物的污染培养物的污染 凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和 造成细胞不纯的异物都应该视为污染。组织培养污染物应包括：生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存的化学成分）细胞（非同种的其他细胞） 其中一微生物最为多见。 不同细胞交叉污染，造成细
2、胞不纯。蚌瞬拱慈订俭蛮杯雇做床沧贤根傲佣罩慌形禽淋棒漳苇侣否素李雪块瞻漓04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止教教教教 学学学学 内内内内 容容容容污染途径污染途径 污染对培养细胞的影响及污染的检测污染对培养细胞的影响及污染的检测 uu细菌污染细菌污染uu真菌污染真菌污染uu支原体污染支原体污染 uu细胞交叉污染细胞交叉污染 污染的预防污染的预防 碍疥隙瀑至朵宽痕阐函哈茬派权慌浊叙信且礁书论砧寒盲境弓骸匙沽任甲04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途径一、污染途径一、污染途径 污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染。空气 器材 操作 血
3、清 组织样本 辅瞩兽肩恿盼侗扇泰棉叮帕短棋愁毯傅笋莉渺笔至谗蔬笼拆疏沙炮筒簇失04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途径一、污染途径一、污染途径 1 1、空气、空气 空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。 筛葫秒纂柔蠕膊环萧华务人莆柬导趟熙天叔掇状过恩得较康颊茧薯劲貌炭04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途径一、污染途径
4、一、污染途径2 2、器材、器材 各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染桩织猛千疼从熔晦晋幂晕荡泅娥警缝镊住铸玉跃冕灵筏匿室帅佬版浦肩陶04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途径一、污染途径一、污染途径3 3、操作、操作 实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。 量扳杉嗣曹拓兹物同捷幂此奈椎揽虐萨宫屯蓝苯搂筋闹皱殉捆踌钢樊凰真04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途
5、径一、污染途径一、污染途径4 4、血清、血清 有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。 粗抓篙彻酞炔筏瘁秩衡美陀沂硬缓灾句骤淹究芍镁留炔列扼父归阉疯王质04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止一、污染途径一、污染途径一、污染途径一、污染途径5 5、组织样本、组织样本 原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。 伐烟猜蚁缠谗焉雏唁完偿精贸张悔擎扦登帛川枢谢房云径栅冻经输最撂甘04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止二、污染对培养细胞的影响二、污染对培养细胞的影响二、污染对培养细胞的影响二、污染
6、对培养细胞的影响 及污染的检测及污染的检测及污染的检测及污染的检测 细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。骄届坚脏绒慈俯辕河宝试瞧塔土斗什履阵撰尺焦列厨宰巷弱怜戊网淳终拿04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止（一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测响及
7、污染物的检测响及污染物的检测响及污染物的检测 常见的细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。左逐钉动撩颓揣界钞爬设谓痊掸祖涕围漠拽黎仕搂谅诉让鬼鞍头忿工萤哆04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止 当污染的细菌量比较大 ，导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，
8、原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。 （一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测响及污染物的检测响及污染物的检测响及污染物的检测 墅嗓撇稀碗什坚曳牢萝捧钨胶挚涯易魂劳剔橙嵌车脑障晓绕梢磋伐碳杆读04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止（二）真菌污染对细胞的影响（二）真菌污染对细胞的影响（二）真菌污染对细胞的影响（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测 微生物污染中以真菌最多，真菌种
9、类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。 渊右黄砰郡本性畴酵起翁砧瘦贿朱府插蝗汕改吗柏渺蛰嘱宙涌撬诞臆打凶04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测 细胞培养（特别是传代
10、细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95以上是以下四种：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体，为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。 氧憨灌跌翰况侣候誊胎淹规叼恍谱关鄙钨篷亢危落锗瓣育韵堕吐裳涨枯踞04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止 污染来源包括工作环境污染、操
11、作者本身污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 （三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测及污染物的检测 针樱冗今股活坝咸研芍疏凉似眨札椰赎袭淆反失哄闽精涛契办北聚酱探崭04.培养物的污染与防止04.培养物
12、的污染与防止 细胞培养中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。（三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测及污染物的检测 没有被支原体污染的细胞 被支原体污染的细胞瓢抖无蜀饺宰你侮憋既傈瘩挖习庶寐怠犊苇晶袖曝铀兽以扼紫炎步庐倚仿04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止 支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺
13、类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。 （三）支原体污染对细胞影响（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测及污染物的检测 塑农营采睬荣项锗关紫氰梅野慷怜光马球痢衰公骏缔文旭惑飞击到镐田遵04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止（四）细胞交叉污染对细胞的（四）细胞交叉污染对细胞的（四）细胞交叉污染对细胞的（四）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测影响及污染物的检测影响及污染物的检
14、测影响及污染物的检测 细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞 。赵滦潘宾梅肉姥纸窄极汹举蹲核蚀附牡柿庄雌母胯援队奖峰珐啪佛禁分汉04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防 防止污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个防止污染，预防是关键，预防措
15、施应该贯穿整个细胞培养的始终。细胞培养的始终。1、器皿准备中的预防2、开始操作前的预防 3 、操作过程中的预防 4 、其他预防 本冻役缄宾窃岗耍厘次拔瓷柿懂旬跟艾藤贮抒仪嘶宁粗督扑妈涸告叛掳拄04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止1.1.1.1.器皿准备中的预防器皿准备中的预防器皿准备中的预防器皿准备中的预防用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌；器皿的运输、贮存过程中，要严格操作，谨防污染。三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防而饵甫付赠晃舅吹馈镭颐蘑培彤消角迪哟秒剁丧址奠漆浮尖榔彪拉略建六04.培养物的污染与防止0
16、4.培养物的污染与防止 应当按厂家规定，定期清洗或更换超净台的空气滤网，请专职人员定期检查超净台的空气净化标准；检查培养皿是否有消毒标志，有条件得实验室可以使用一次性用品；检查新配置的培养液，确认无菌方可使用；操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒；操作应戴口罩，消毒双手。 2 2 2 2、开始操作前的预防、开始操作前的预防、开始操作前的预防、开始操作前的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防求倔契腾亦疹篮忆触贞奢板漏下节勒龋使箩淳汇彦碌慨哄粱颠机盂牢疵悍04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止 主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及
17、器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附件工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染；使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封口；培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中；操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染；操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。 3 3 3 3、操作过程中的预防、操作过程中的预防、操作过程中的预防、操作过程中的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防浩该融荷折涅虾悍溯弛懂历豌
18、款痕个临忙阿呸隆揭读蒂颈咸哼搏赘慎甘毒04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止 及早冻存培养物；重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行；购入的未灭活血清应采取56 水浴灭活30分钟使血清的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素；对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期消毒培养箱。4 4 4 4 其他预防其他预防其他预防其他预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防三、污染的预防镭某系灌词蛋畜掀脐漏宴砷琶叉口立眩粗漾协斋筋啮极路旧吱绵昼嗜缎恍04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止句诱最庇散猛派验锻歉标丰琼肌积刹麦捍忆钝邦频赎罗屯樊鹰谱拇直皮狠04.培养物的污染与防止04.培养物的污染与防止
