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1、实验十四 18S rDNA在人类染色体上的 免疫荧光原位杂交(选做，综合性实验，自我设计， 开放性实验 18学时）什么是免疫荧光原位杂交n原位杂交（in situ hybridization）是一种在显微或亚显微结构水平上对某些特异的DNA或RNA片段进行定位研究的技术，是研究基因定位，基因扩增和基因表达的最重要，最直接和最有效的手段。免疫荧光原位杂交技术就是其中的一种。这种方法比较简便,能够检测出中期或间期染色体上各种长度的DNA片段和单一中期染色体上的DNA片段，被认为是进行基因定位研究的最快速和最有效的方法之一。实验目的n了解免疫荧光原位杂交的基本原理和意义，掌握细胞免疫荧光原位杂交的基
2、本条件，方法和步骤。n熟悉染色体上核仁形成区的所在部位及特征，验证杂交位点与NORs的关系实验原理n免疫荧光原位杂交的基本原理是基于免疫学研究中抗原和抗体间的特异性反应与常规的荧光显微镜镜检技术。在这种技术中，用于进行原位杂交的DNA或RNA探针首先用结合有Bio（botin，生物素）或Dig（digoxigenin，异羟基洋地黄毒甙）的核甘酸类似物（Bio-11-dUTP，Bio-11UTP，Dig-11-dUTP，Dig-11-UTP）标记，然后使用结合有荧光素分子的抗Bio 或抗Dig抗体或抗抗体处理实施原位杂交后的细胞学制片。实验原理n由于抗体和抗原间的特异性反应，抗Bio 或抗Dig
3、抗体便与探针分子中的Bio 或Dig结合。在荧光显微镜下，抗Bio 或抗Dig抗体因携带有一定数量的荧光素分子而发出一定颜色的荧光，籍此，细胞学制片中待测的DNA或RNA片段被定位。常用的荧光素染料n异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）n四乙基罗达明B-200（lissamine rhodamine B-200，RB-200）n四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TMRITC）探针标记及纯化探针标记及纯化探针标记采用随机引物法标记 （1）纯化后的45SrDNA在沸水中变性10 min。（2）
4、将变性rDNA立即放至冰水中至少5min。（ 3） 加 入 2 L 六 碱 基 随 机 引 物 ， 2 L dNTP（dATP，1mmol/L；dCTP，1mmol/L；dGTP，1mmol/L；dTTP，0.65 mmol/L；DIG-11-dUTP，0.35 mmol/L，pH 7.5）（Takara）。（4）加入Klenow酶2 U（Takara），加水补足20 L。（5）37 过夜标记20 h。接上步（6）加2 L 0.2 mol/L EDTA pH8.0，2.5 L 4 mol/L LiCl，75 L冰冷无水乙醇混匀。（7）20 沉淀2 h后，12000 rpm离心15 min。（8
5、）70%冷乙醇洗涤沉淀两遍。（9）加入20 L TE溶解沉淀。探针检测探针检测 （ 1） 剪 取 适 当 大 小 的 带 有 正 电 荷 的 尼 龙 膜（Roche）。（2）将标记探针分别稀释至原浓度的101、102、103、104和105，分别点各浓度稀释物和若干已知DIG标记DNA浓度的样品各1 L于膜上。（3）在80 下烤膜2 h，使DNA固定于膜上。（4）将膜置于封堵缓冲液中，浸泡2 min。封堵缓冲液成分为含有1封堵剂（Blocking Reagent，Roche）的马来酸缓冲液（0.1 mol/L 马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH 7.5）。（ 5） 以 12000稀
6、释 抗 体 Anti-digoxigenin-AP-conjugate（alkaline phosphatase，AP）于上述封堵溶液中，充分混匀后，将尼龙膜浸入其中3 min。（6）将尼龙膜转移至封堵溶液中，浸泡1 min。（7）使尼龙膜在冲洗缓冲液（Washing Buffer）（含0.3 Tween-20的马来酸缓冲液）中晃动1 min。（8）在检测缓冲液（Detection Buffer）（0.1 mol/L Tris-Cl，0.1mol/L NaCl，pH 9.5）中平衡1 min。（9）将40 L NBT/BCIP储存液（Roche）稀释于2 mL检测缓冲液中。（10）将尼龙膜转移
7、至显色缓冲液中，黑暗中显色5 min30 min。（11）对照各杂交点的颜色深浅，判断标记混合物中探针浓度。染色体标本预处理染色体标本预处理 （ 1） 每 张 载 玻 片 上 滴 加 100 L RNA酶（Rnase）（100 g/mL），盖parafilm膜，37 温育1 h。（2）2SSC洗载玻片35 min。（3）20 下70% 85% 100%乙醇系列脱水各5 min后，室温下干燥。（ 4） 每 张 载 玻 片 上 滴 加 200 L胃 蛋 白 酶（Pepsin）（Sangon）（含0.01胃蛋白酶的10 mmol/L HCl），盖parafilm膜，37 温育10 min。（5）1P
8、BS洗涤25min，10PBS中包含：8 NaCl、0.2 KCl、1.44 Na2HPO4和0.24 KH2PO4。接上步n（6）用含50 mmol/L MgCl2的1PBS洗涤玻片5 min。n（7）用含50 mmol/L MgCl2和1甲醛的1PBS固定标本5 min。n（8）2SSC洗玻片2 min。n（9）在含70去离子甲酰胺的2SSC中65 处理2 min。n（10）20 下70% 85% 100%乙醇系列脱水各5 min后，室温下干燥。 杂交杂交 n（1）配制杂交液，其组分为：50去离子甲酰胺，2SSC，50 mmol/L磷酸钠，10硫酸葡聚糖（ dextran sulfate，
9、 DS） ， 0.1 SDS和 2 ng/L探针DNA。n（2） 杂交液在沸水中变性10 min，然后迅速冰浴至少5 min。n（3）将杂交液滴加到染色体标本上（10 L/片），盖上盖玻片，置于37 湿盒中杂交过夜。杂交后洗脱杂交后洗脱n（1）在含30去离子甲酰胺的2SSC中去掉盖玻片，37 洗片5 min。n（2）2SSC，37 洗片25 min。n（3）0.2SSC，0.1%SDS，37 洗片35 min。 杂交信号检测杂交信号检测（1）在冲洗缓冲液（Washing Buffer）（含0.2 Tween-20的1PBS）中洗片3 min。（2）在载玻片滴加封堵缓冲液（Blocking Bu
10、ffer）（含1Blocking Reagent的1PBS）100 L，盖parafilm膜。（ 3） 以 125稀 释 抗 体 （ Anti-DIG-Fluorescein， Fab fragments）于封堵缓冲液中（1 g/mL）。每张载玻片上加50 L抗体缓冲液，盖parafilm膜，37 温育1 h。（4）冲洗缓冲液（Washing Buffer）洗片35 min。（5）1PBS短暂冲洗。（6）PI（Propidium Iodle）（10 ng/mL）染色5 min。（7）用去离子水短暂冲洗后，黑暗中晾干。（8）在载玻片上加1滴VectaShield（Vecta），荧光显微镜下观察并照相。 结果结果 n可观察到18S核糖体基因定位于5对染色体的次缢痕上。 所需学时所需学时 n第一部分：第一部分：人类染色体标本的制备人类染色体标本的制备 1212学时学时n第二部分：第二部分：探针的标记探针的标记 6 6学时学时n第三部分：荧光原位杂交第三部分：荧光原位杂交 12 12学时学时n 共计：共计：3030学时学时
