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1、第六章第六章 基因与载体连接基因与载体连接 一、黏性末端与平末端的连接一、黏性末端与平末端的连接 二、其他连接方法二、其他连接方法 一、黏性末端与平末端的连接一、黏性末端与平末端的连接一）黏性末端一）黏性末端DNA分子间的连接分子间的连接DNA连接酶把相连接酶把相互靠近的互靠近的5端磷端磷酸与酸与3-OH连到连到一起。一起。 1. 两段两段DNA的连接的连接 依依靠靠粘粘性性末末端端依靠粘性末端依靠粘性末端2. DNA片断片断与载体的连与载体的连接接nickligase3.4 . 粘性末端的更换粘性末端的更换 在在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口片段上某一酶切口处换成另一种酶切口二二)
2、 平末端（平末端（blunt end）的连接）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1. 直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P. Labban和和P. Kaiser提出。提出。（1）同聚物加尾）同聚物加尾 法法 2. 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” DNA末端转移酶末端转移
3、酶能在没有模板的情况下能在没有模板的情况下给给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补缺点：缺点：优点：优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点5突出的末端 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 5 3 3 5 5 3 3 5 外源基因载体TdTployCTdTployGKleno
4、w补3平端5 5 5 5 CCCCCCCCCCGGGGGGGGGG退火用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物）衔接物(linker)连接连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用的作用 缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如
5、果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:优点：优点：（3）DNA接头接头 (adapter)连接法连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p 5 BamH I adapter用用T4 DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的分子的两端，直接成为人工粘性末端。两端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。 adapter的作用的作用Blunt-ende
6、d DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamH I adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自
7、我连接。端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamH I adapter
8、P-P 5GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。一）一）PCR产物的连接产物的连接1. 在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的符合载体的多克隆位点多克隆位点(MCS)；（1）设计原则）设计原则避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。二、其他连接方式二、其他连接方式（2）带酶切位点的引物结构）带酶切位点的引物结构3端端15
9、20bp与模板互补；与模板互补； 5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）引物引物1GCAGAATTC 互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3 GCAGAATTC 互补序列互补序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-3 3 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-5 3- 5 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR产物产
10、物 互补序列互补序列-5 3-引物引物2带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物产物-5 3- CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3 GCTAG PCR产物产物-5 3-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！2. 与与T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双双链的链的3端再加上一个多余的核苷酸端再加上一个多余的核苷酸（优先加（优
11、先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只聚合酶，当原料中只有有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA二）二）DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接相同的粘性末端才能有效地连接尽量避免平端连接尽量避免平端连接决不能进行非粘性末端连接决不能进行非粘性末端连接（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamH
12、I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确插入的方向正确（1）用双酶切）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向固定方向连接。连接。EcoR IBamH IEcoR IBamH IEcoR IBamH I 3. 插入基因的开放阅读框（插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码要注意要注意载体上有载体上有ATG起始密码时起始密码时ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRI
13、ATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！4. 防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体载体插入片断插入片断三）三） 载体和外源载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果三、重组率三、重组率 较为理想的重组率为较为理想的重组率为25-75% 。外源外源DNA片段的重组分子数片段的重组分子数加入的载体分子数加入的载体分子数重组率重组率100%提高重组率的方法：提高重组率的方法： 连接反应条件连接反应条件 外源片段：载体外源片段：载体5:1-10:1（分子数），（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。增加碰撞机会，减少自身环化。 载体除磷载体除磷 （磷酸酯酶（磷酸酯酶5除磷）除磷） 防止载体自我环化防止载体自我环化
