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1、第十一章 电泳和电色谱electrophoresis and electrochromatography2021/6/71生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等) )纯化纯化( (层析、电泳层析、电泳) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤) )浓缩浓缩( (超过滤超过滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性2
2、021/6/72n 电泳电泳(Electrophoresis)(Electrophoresis) 荷电溶质荷电溶质( (电解质电解质) )或粒子在电场作用下发生或粒子在电场作用下发生定向定向泳动泳动的现象，简称的现象，简称EPEP 。n 电泳分离电泳分离 利用荷电溶质利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别在电场中泳动速度的差别进行分离进行分离的方法。的方法。概 述带电粒子在电场作带电粒子在电场作用下向着与其电性用下向着与其电性相反的电极移动相反的电极移动2021/6/73 电泳与色谱技术的比较电泳与色谱技术的比较 共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离不同
3、点：产生溶质移动速度差的原理不同。不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。色谱为浓差驱动的传质色谱为浓差驱动的传质平衡分离法平衡分离法电泳是外力电泳是外力( (电场力）作用下的电场力）作用下的差速分离法差速分离法2021/6/74电泳与色谱技术的结合 电色谱n电泳色谱电泳色谱:将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技术术n电色谱：电色谱：利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定相和流动相的分配行为差异进行分离相和流动相的分配行为差异进行分离nn一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱一般情况下，二者并无严格区别
4、，均称为电色谱2021/6/75 电泳法的发展电泳法的发展2020世纪初期世纪初期 已用于蛋白质的分离已用于蛋白质的分离 7070年代前，主要应用于分析目的年代前，主要应用于分析目的7070年代后，分离制备规模年代后，分离制备规模9090年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和微量分离制备微量分离制备2021/6/76 电泳法的特点电泳法的特点：n（1 1）分辩率高）分辩率高, ,属高度纯化技术属高度纯化技术n（2 2）电场作用）电场作用n（3 3）设备放大难，多用于分析（实验室应用）设备放大难，多用于分析（实验室应用）2021/6/77 电泳技术的分类
5、电泳技术的分类 根据原理和操作形式可分为根据原理和操作形式可分为： 区带电泳区带电泳 等电点电泳等电点电泳 等速电泳等速电泳 根据是否使用凝胶载体可分为根据是否使用凝胶载体可分为： 凝胶电泳凝胶电泳(Gel electrophoresis)(Gel electrophoresis) 自由流电泳自由流电泳( (Freeflow electrophoresisFreeflow electrophoresis) 以琼脂糖、淀粉胶及以琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳支持体的电泳。在无固相支持介质在无固相支持介质, ,用特定缓冲用特定缓冲液作为分离介质的分离系统中所液作为
6、分离介质的分离系统中所进行的可溶性分子或不溶性颗粒进行的可溶性分子或不溶性颗粒的电泳分离纯化技术的电泳分离纯化技术2021/6/78 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为: : (1)(1)板式电泳：板式电泳： 水水平平板板式式电电泳泳：支支持持物物水水平平放放置置，是是最最常常用用的的电泳方式。电泳方式。 垂直板式电泳：支持物垂直放置垂直板式电泳：支持物垂直放置 (2) (2)柱式电泳：柱式电泳：采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组份，多用于制备回收组份，多用于制备 2021/6/79 电泳的应用电
7、泳的应用： 1 1、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等 2 2、分析某种物质的纯度及分子量、分析某种物质的纯度及分子量2021/6/710 第一节 基础理论2021/6/711一、自由溶液中的电泳速度一、自由溶液中的电泳速度U0为迁移率迁移率(mobility)：单位电场强度下带电粒子的泳动速度：单位电场强度下带电粒子的泳动速度当当f=f时时，荷电溶质恒速泳动，则，荷电溶质恒速泳动，则考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率为考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率为考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率为考虑到双电层中电位分布情况，带
8、电粒子的迁移率为静电引力静电引力 f=EZe黏性阻力黏性阻力 f=6e或e=u0EU0=eZ/6r kr为粒子半径与双电层厚度的比值为粒子半径与双电层厚度的比值Z溶质电荷数溶质电荷数E-电场强度电场强度电子电量电子电量r球形溶质半径球形溶质半径,溶液粘度溶液粘度Ve溶质运动速度溶质运动速度2021/6/712二、凝胶中的电泳速度二、凝胶中的电泳速度 凝胶电泳的优点凝胶电泳的优点 可避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降可避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降低低( (较自由流电泳分离度高）；凝胶本身具有分较自由流电泳分离度高）；凝胶本身具有分子筛的作用，有利于提高电泳分离度。子筛的作用，有利于
9、提高电泳分离度。 凝胶电泳的缺点凝胶电泳的缺点 凝胶载体对溶质泳动产生的阻力影响电泳速度，凝胶载体对溶质泳动产生的阻力影响电泳速度，并且耗电量大，处理量较小并且耗电量大，处理量较小2021/6/713n 常用的常用的凝胶载体凝胶载体 n 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶n 琼脂糖、淀粉（琼脂糖、淀粉（易发生易发生电渗流电渗流，造成分离度下降，造成分离度下降） 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳速度凝胶电泳速度Lgu=lgu0-KrTgUo为自由溶液中的迁移率为自由溶液中的迁移率Kr为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数Tg 为凝胶浓度为凝胶浓度由丙烯酰胺单体和交由丙烯酰胺单体和
10、交联剂联剂N,N-N,N-亚甲基双亚甲基双丙烯酰胺共聚而成丙烯酰胺共聚而成2021/6/714三、电渗流速度三、电渗流速度电渗流的概念电渗流的概念琼脂糖等凝胶载体在电场作用下琼脂糖等凝胶载体在电场作用下易电离带负电荷易电离带负电荷，其诱导的其诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向双电层中反离子在电场作用下发生定向泳动泳动（向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）（向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）化层一起泳动，并在摩擦力作用下，化层一起泳动，并在摩擦力作用下，带动主体溶带动主体溶液一起移动液一起移动的现象的现象电泳淌度电泳淌度：单位电场强度下带电粒子的泳动速：单位电场强度下带电粒子的泳动速度度
11、2021/6/715电渗流驱动的电色谱的流速电渗流驱动的电色谱的流速 流速流速与操作压力无关与操作压力无关，即电渗流不会引起色谱柱，即电渗流不会引起色谱柱压力的增大压力的增大 电渗流速度电渗流速度与固定相粒径无关与固定相粒径无关，电色谱可采用比，电色谱可采用比HPLC更小的固定相粒子（更小的固定相粒子（1.5-5m)电渗流速度公式电渗流速度公式HPLC常采用固定相粒径常采用固定相粒径5E电场强度电场强度介电常数介电常数V0电渗流速度电渗流速度wZeta电位电位L电渗淌度电渗淌度2021/6/716四四、影响电泳迁移速度的因素影响电泳迁移速度的因素(1)(1)样品性质样品性质(2)(2)电场强度
12、电场强度(3)(3)缓冲液的性质缓冲液的性质(4)(4)电渗电渗(5)(5)温度温度2021/6/717n(1) (1) 样品性质样品性质：带电量，分子大小，形状带电量，分子大小，形状n分分子子带带电电量量越越大大、直直径径越越小小、形形状状越越接接近近球球形形，则则其其电电泳泳迁移速度越快迁移速度越快n(2) (2) 电场强度电场强度：电场强度对电泳速度起着决定性作用，电电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快场强度越高，电泳速度越快过高，产热，样品和过高，产热，样品和BufferBuffer扩散增加，条带增宽，蛋白变扩散增加，条带增宽，蛋白变性。性。过低，电泳时间增加，
13、扩散。当需要增大电场强度以缩短过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置2021/6/718n(3) (3) 缓冲液的性质缓冲液的性质na a 缓冲液的缓冲液的pHpH npH pH 决决定定带带电电量量，(pH-PI)(pH-PI)越越大大，带带电电量量越越多多，迁迁移移速速率率越越大大nb b 离子强度离子强度nI I越越大大，样样品品电电流流减减小小，迁迁移移率率变变小小；I I越越小小，样样品品电电流流越越大，迁移率越大，但样品易扩散，一般大，迁移率越大，但样品易扩散，一般I I在在0.02-0.0
14、2-0.2M0.2M 选择合适的选择合适的pH，使各种蛋，使各种蛋白质所带电荷差异较大，白质所带电荷差异较大，利于彼此分开；电泳过程利于彼此分开；电泳过程中须采用具有一定缓冲能中须采用具有一定缓冲能力的缓冲液使力的缓冲液使pH值恒定值恒定 。 2021/6/719(4) (4) 电渗电渗 当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。（5 5）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。泳不利。2021/6/72
15、0第二节 凝胶电泳2021/6/721利用凝胶的利用凝胶的分子筛作用分子筛作用使使分子大小不同分子大小不同的电的电解质得到分离。解质得到分离。相对分子质量大相对分子质量大的溶质的溶质受凝胶阻滞作用受凝胶阻滞作用大，大，泳动速度泳动速度较慢较慢，而，而小分子小分子溶质泳动溶质泳动速度较快速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质数条含有不同溶质的区带的区带，实现溶质之间的相互分离。是，实现溶质之间的相互分离。是区带区带电泳分离法电泳分离法 一、一、 凝胶电泳原理凝胶电泳原理2021/6/722
16、n 凝胶电泳与凝胶过滤的区别凝胶电泳与凝胶过滤的区别：凝凝胶胶电电泳泳：样样品品中中各各分分子子的的运运动动速速度度是是小小分分子子快快于于大大分子分子 凝胶过滤凝胶过滤：大分子运动快于小分子：大分子运动快于小分子原原因因：凝凝胶胶电电泳泳中中,系系统统里里没没有有空空隙隙体体积积,只只有有网网状状骨骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。架。大分子物质不及小分子物质容易移动。2021/6/723n1.1.板式凝胶电泳板式凝胶电泳 处理量很小，不适合生物产物的分离制备。处理量很小，不适合生物产物的分离制备。 水平式平板凝胶电泳水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳凝胶电泳的类型
17、凝胶电泳的类型2021/6/724n2.2.圆柱型凝胶柱圆柱型凝胶柱 凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。 缺点：操作过于繁琐，回收率不高，缺点：操作过于繁琐，回收率不高，且易变性且易变性优点：操作简便，凝胶可重复使用。优点：操作简便，凝胶可重复使用。缺点：回收的溶质浓度很低缺点：回收的溶质浓度很低。连续洗脱凝胶电泳：连续洗脱凝胶电泳：当溶质泳动到当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分各个组分。2021/6/725根据溶质的相对分子质量选择根据溶质的相对分子质量选择 7.57.5的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶孔径较小，适用
18、于相对分子质量为孔径较小，适用于相对分子质量为10kD10kD1000kD1000kD的的溶质的分级分离；溶质的分级分离； 3.53.5的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶孔径较大，适用于相对分子质量为孔径较大，适用于相对分子质量为1000kD -5000kD1000kD -5000kD的溶质的分级分离的溶质的分级分离 聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝胶糖凝胶孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。核酸的分离通常采用核酸的分离通常采用0.50.5-1-1的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶 凝胶种类和浓度凝胶种类和
19、浓度2021/6/726电泳槽电泳槽制备胶板制备胶板放置样品梳放置样品梳加样加样电泳电泳观察和拍照观察和拍照凝胶电泳操作步骤凝胶电泳操作步骤2021/6/7272021/6/728制胶或染色时加制胶或染色时加入的染料入的染料EBEB是强是强诱变剂并有中等诱变剂并有中等毒性，配制和使毒性，配制和使用时都应戴手套用时都应戴手套2021/6/729M 1 2 3 4PCR产物的产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2021/6/730由浓度不同的两层凝胶组成由浓度不同的两层凝胶组成: :浓缩层和分离层浓缩层和分离层 上层凝胶：浓缩层上层凝胶：浓缩层凝胶浓度较低凝胶浓度较低( (丙烯酰胺浓度为丙烯酰胺浓度
20、为2 23 3Tg)Tg)，孔径较，孔径较大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质以溶质以等速电泳等速电泳的形式泳动，得到浓缩。的形式泳动，得到浓缩。 下层凝胶：分离层下层凝胶：分离层凝胶浓度较高凝胶浓度较高(5(52525Tg)Tg)，各个组分根据，各个组分根据迁移率迁移率的差别的差别得到分离。得到分离。二、不连续凝胶电泳二、不连续凝胶电泳2021/6/7312021/6/7322021/6/733n不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。成。不连续电泳的三个不连续性：不连续电泳的三个不连续性：a.a.凝胶浓度的不连
21、续性凝胶浓度的不连续性( (分离胶浓度分离胶浓度 浓缩胶浓缩胶）b.b.缓冲液缓冲液pHpH值的不连续性值的不连续性 c.c.缓冲液离子成分的不连续性缓冲液离子成分的不连续性 不连续电泳的不连续性不连续电泳的不连续性浓缩层凝胶缓冲液为浓缩层凝胶缓冲液为pH6.8的的Tris-HC1；分离层凝胶缓冲液；分离层凝胶缓冲液为为pH8.9的的Tris-HC1；电极缓；电极缓冲液是冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸甘氨酸-HC1缓冲液。缓冲液。2021/6/734蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素分子大小分子形状分子形状和大小相同，分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不所带电荷性质
22、和数量不同同分子形状和所带电荷性质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不和数量相同，分子大小不同同分子所带电荷性质和数量分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同相同，分子形状不同2021/6/735SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） n原理原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,(sodium
23、dodecyl sulfate,简称简称SDS)SDS)，则蛋白质分子的，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用状无关。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量。2021/6/736 等速电泳的特点等速电泳的特点 (1)(1)各个各个组分间形成相互连接的独自区带组分间形成相互连接的独自区带，可有效抑制扩散，可有效抑制扩散引起的区带分散现象。引起的区带分散现象。 (2) (2)提高前导电解质浓度，可提高溶质的浓缩率。提高前导电解质浓度，可提高溶质的浓缩率。 (3) (3
24、)采用适当的采用适当的低分子两性电解质低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作，在目标蛋白质前后作间间隔物隔物，可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯，可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。化。2021/6/737应用：应用：主要用于成分分析，在物质的分离回主要用于成分分析，在物质的分离回收方面应用极少。收方面应用极少。缺点：缺点：每个区带互相连接，回收困难。每个区带互相连接，回收困难。 电泳装置的散热问题难于解决电泳装置的散热问题难于解决。2021/6/738分离操作及其特性分离操作及其特性1.1.分离操作分离操作以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋以分离蛋白质为目的时，
25、上部缓冲液根据待分离蛋白质的等电点白质的等电点(pI)(pI)选定。选定。2.2.分离特性分离特性选择适当的操作条件，可进行各种蛋白质的分离。选择适当的操作条件，可进行各种蛋白质的分离。 调节调节pHpH值可改变荷电量值可改变荷电量Z Z 调节凝胶浓度可改变迁移率（适当的调节凝胶浓度可改变迁移率（适当的T Tg g可缩短分离时可缩短分离时间，提高分离效率）间，提高分离效率） 调节电压可改变电泳速度等调节电压可改变电泳速度等 （需考虑设备散热能力，（需考虑设备散热能力，E E不能过大）不能过大） 2021/6/739第三节第三节 等电点聚焦等电点聚焦 (Isoelectric focusing，
26、IEF)2021/6/740Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFEn定义：一种利用具有连续pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳2021/6/741一、一、等电聚焦（等电聚焦（IEF)IEF)的的原理n在电泳介质中放入在电泳介质中放入载体两性电解质载体两性电解质，当通以直流电时，当通以直流电时，两性电解质即形成一个两性电解质即形成一个由正极到负极逐步增加的由正极到负极逐步增加的pHpH梯度梯度，正极附近是低正极附近是低pHpH区，负极附近是高区，负极附近是高pHpH区。区。n蛋白质（和氨基酸）等两性电解
27、质具有等电点，在等电蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具有等电点，在等电点的点的pHpH值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相应的等电点位置上聚焦于其相应的等电点位置上，形成具有不同等电点的蛋白质区带形成具有不同等电点的蛋白质区带2021/6/742pI1pI2pI3 pIn- -+ +蛋白质分子的等电聚焦过程蛋白质分子的等电聚焦过程2021/6/743进行进行IEFEIEFE必须具备必须具备3 3个条件个条件： 有有一一个个在在电电泳泳条条件件下下基基本本稳稳定定、重重复复性性良良好好的的连连
28、续续pHpH梯度梯度有有一一个个抗抗对对流流的的电电泳泳材材料料，使使已已经经分分离离的的样样品品不不再重新混合再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带2021/6/744n连续连续pHpH梯度的调配梯度的调配采用载体两性电解质聚氨基羧酸为缓冲液采用载体两性电解质聚氨基羧酸为缓冲液特点：聚合物含有许多正负电荷，并且与蛋白质的特点：聚合物含有许多正负电荷，并且与蛋白质的等电点范围相同，缓冲能力强，等电点范围相同，缓冲能力强，pHpH梯度较稳定，梯度较稳定， 商品化载体两性电解质有商品化载体两性电解质有AmpholineAmpholine等。该产品一般等。该产
29、品一般有三种有三种pHpH梯度范围，如梯度范围，如pH4pH46 6、pH8pH81010和和pH9pH91111等。等。2021/6/745凝胶中加有凝胶中加有两性电解质两性电解质溶液（溶液（pH9-3） 加电场加电场后在凝胶内后在凝胶内形成一个稳形成一个稳定定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布等电聚焦示意图等电聚焦示意图2021/6/746（一）优点（一）优点1.1.分辨率高分辨率高 分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高更高（精密度可达（精密度可达0.01pH0.01pH单位
30、，灵敏度高，最低检出量达单位，灵敏度高，最低检出量达0.1ng0.1ng）。）。2.2.重复性好。重复性好。二、二、IEFEIEFE的特点的特点 可消除分子扩散引起的分离度下降，可消除分子扩散引起的分离度下降，电泳区带相当狭窄。特别适合于电泳区带相当狭窄。特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。物大分子。2021/6/747（二）缺点（二）缺点n1.1.载体两性电解质污染产品载体两性电解质污染产品n2.pH2.pH梯度的稳定性不高梯度的稳定性不高n3.3.操作过程中易发生凝胶起皱脱水现象操作过程中易发生凝胶起皱脱水现象 n4.4.样样品品中中的的成成分分必必
31、须须停停留留在在其其pIpI，不不适适用用 在在pIpI不溶或发生变性的蛋白质。不溶或发生变性的蛋白质。2021/6/748第四节第四节 二维电泳二维电泳 Two-dimensional electrophoresis2021/6/749定义定义 同时利用分子的大小和等电点这两种性质的同时利用分子的大小和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通凝胶电泳和普通凝胶电泳和IEFIEF相结合相结合，因此分离效率，因此分离效率更高更高。2021/6/750原理：原理：在凝胶电泳槽的在凝胶电泳槽的y y方向上方向上凝胶具有浓度分布凝胶具有浓度分布
32、( (逐渐逐渐增大增大) )，而在，而在x x方向上具有方向上具有pHpH梯度梯度（1 1）首先在）首先在x x方向上调配方向上调配pHpH梯度，使溶质分子以等梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其电点聚焦的形式泳动到其等电点处。等电点处。 y2021/6/751n（2 2）将将适适当当pHpH值值的的缓缓冲冲液液渗渗透透到到凝凝胶胶中中( (以以取取代代形形成成pHpH梯梯度度的的载载体体两两性性电电解解质质) )，在在y y方方向向上上加加电电场场使使溶溶质质再再次次泳泳动动。此此时时溶溶质质之之间间的的泳泳动动速速度度受受荷荷电电量量及及相相对对分分子子质质量量的的影影响响，直直至至
33、泳泳动动到到被被高高浓浓度度凝凝胶胶所所阻阻滞滞，相相互互之之间间得得到到进进一一步步的的分分离离。电泳结束后将凝胶切成小块，分别回收各个组分。电泳结束后将凝胶切成小块，分别回收各个组分。2021/6/752n二维电泳的特点二维电泳的特点：优点：可分离等电点差小于优点：可分离等电点差小于0.010.01个个pHpH单位的蛋白单位的蛋白质，分离度极高。质，分离度极高。n缺点：与普通缺点：与普通IEFIEF一样，处理量很小，适用于分离一样，处理量很小，适用于分离微量的高纯度目标产物，多用于分析。微量的高纯度目标产物，多用于分析。 2021/6/753部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
