4.免疫电镜细胞化学技术课件

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1、 免疫免疫电镜细胞化学技胞化学技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术 电电镜镜细细胞胞化化学学技技术术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。 目目的的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。 免疫电镜技术免疫电镜技术 免疫免疫电镜技技术是免疫化学技是免疫化学技术与与电镜技技术结合的合的产物，根据抗原抗体的高度特异性物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高合原理，用高电子密子密度的度的标记物（如：金、物（如

2、：金、铁蛋白等）在超微蛋白等）在超微结构水平上构水平上检测某某些抗原性物些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法。的定位、定性、半定量的一种方法。 目前免疫目前免疫电镜技技术主要包括主要包括酶免疫免疫电镜技技术，免疫，免疫铁蛋白技蛋白技术和免疫胶体和免疫胶体金技金技术，此外，此外还有抗体有抗体杂交技交技术、凝集素、凝集素电镜标记技技术和和铁蛋白蛋白-抗抗铁蛋白蛋白电镜复合物技复合物技术。 。用以用以标记抗体的抗体的酶要具要具备以下条件：以下条件：1.与抗体（或抗原）与抗体（或抗原）结合后，仍能保持合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。和抗体（或抗原）的生物活性。2.酶的的纯度高、特异性

3、度高、特异性强、 、稳定、可溶性好、敏感、廉价。定、可溶性好、敏感、廉价。3.在体液或在体液或组织中不存在中不存在该酶的底物。的底物。酶标技技术中最常用的中最常用的标记酶是辣根是辣根过氧化物氧化物酶（ （HRP） ）电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则 1 1、取材与固定、取材与固定 取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又

4、受影响。甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。 （1 1）2%2%多聚甲醛液多聚甲醛液 （2 2）2%2%多聚甲醛多聚甲醛-0.01%-0.01%0.05%0.05%戊二醛戊二醛 （3 3）4%4%多聚甲醛多聚甲醛-0.5%-0.5%苦味酸苦味酸-0.5%-0.5%戊二醛戊二醛 2通通过冰冰冻切片或震切片或震动切片切片获得厚切片。得厚切片。 冰冰冻切片切片 8m ，震，震动切片切片2080m。 。 3漂洗后的厚切片可按免疫漂洗后的厚切片可按免疫组化步化步骤进行行标记染色。染色。4 DAB显色后再色后再进行行锇酸后固定以及酸后固定以及电镜包埋切片包埋切片处理。理。5. 如果确定待

5、如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做的前提下可在包埋切片后做标记染色。染色。三、免疫染色三、免疫染色包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再进行脱水包埋超薄切片。进行脱水包埋超薄切片。 优点：优点：（1 1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，对切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，对抗原性破坏较小。（抗原性破坏较小。（2 2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出率率. .（3 3）免

6、疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。）免疫染色后，用四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需要穿透剂。要穿透剂。2.免疫染色免疫染色 直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。 间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的

7、特异性间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。结果判定果判定在已知阳性、阴性在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出品成立的前提下，出现高高电子密度的子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。粒，即指示抗原抗体的存在。（二）胶体金免疫（二）胶体金免疫电镜技技术 利用胶体金在碱性利用胶体金在碱性环境中境中带负电荷的性荷的性质，使其与，使其与抗体相互吸引从而将抗体抗体相互吸引从而将抗体标记。再以金。再

8、以金标记的抗体与待的抗体与待检抗原相互抗原相互结合，由于金合，由于金颗粒的粒的电子密度高，子密度高，电镜观察察到金到金颗粒的位置，即抗原所在。粒的位置，即抗原所在。2、胶体金的特性 颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。 影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。 檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系0.01%氯化金 1%柠檬酸三钠 胶体金颗粒直径 （ml) （ml） （nm）100 3.0 19.010

9、0 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5（ （1）胶体金的制）胶体金的制备 柠檬酸三檬酸三钠还原法（原法（15nm） ） 鞣酸鞣酸-柠檬酸檬酸钠还原法（原法（6nm） ） 鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方1%柠檬酸三钠 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3 去离子双蒸水 胶体金颗粒直径 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm） 4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.5优点：点： 胶体金能胶

10、体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不的生物活性不发生明生明显的的变化。化。 金金颗粒具有很高的粒具有很高的电子密度，在子密度，在电镜下金下金颗粒清晰可辨，易精确定位。粒清晰可辨，易精确定位。不不仅可以用于透射可以用于透射电镜的超薄切片的超薄切片观察，也可以用于察，也可以用于扫描描电镜对细胞表面的抗原、受体胞表面的抗原、受体进行行标记定位定位观察。察。胶体金胶体金标记物易于制物易于制备，而且可以根据需要制，而且可以根据需要制备不同不同大小的胶体金，因此可以大小的胶体金，因此可以进行免疫行免疫电镜的双重的双重标记。 。根据抗原抗体反根据抗原抗体反应部分部分结

11、合金合金颗粒数量的多少，可粒数量的多少，可进行粗略的免疫行粗略的免疫细胞化学定量研究。胞化学定量研究。 （ （2） ）电镜包埋前免疫金染色包埋前免疫金染色 新新鲜组织经适当固定（适当固定（0.5%戊二戊二醛-2%多聚甲多聚甲醛固固定定0.51h），制成厚切片。），制成厚切片。 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗漂洗3次，每次次，每次15min。 。 0.1mol/L甘氨酸漂洗甘氨酸漂洗10min， ，灭活自由活自由醛基。基。 TBS漂洗，漂洗，5min3次，次， 1%牛血清孵育牛血清孵育组织块30min。 。 第一抗体第一抗体4孵育孵育过夜后室温夜后室温继续放置放置2h。 。 TBS漂

12、洗，漂洗，5min3次，次， 室温下适当稀室温下适当稀释度的胶体金度的胶体金标记探探针（二抗胶体金探（二抗胶体金探针或蛋白或蛋白A胶体金探胶体金探针等）孵育等）孵育60min。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次，后再用双蒸水漂洗切片。次，后再用双蒸水漂洗切片。 2%戊二戊二醛-2多聚甲多聚甲醛固定固定1h， ，1%锇酸固定酸固定3060min，常，常规脱水，包埋，切片染色后脱水，包埋，切片染色后电镜观察。察。（3）电镜包埋后免疫金染色法 超薄切片5070nm，置于镍网或金网中。1% H2O2蚀刻，使试剂能穿透标本。EPON包埋的组织蚀刻时间约10min，而LRWhite、LR Gold包埋的

13、组织蚀刻时间则常小于5min. 双蒸水漂洗双蒸水漂洗3次，每次次，每次10min。 。 1%牛血清孵育切片牛血清孵育切片15min。 。 载网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育网不冲洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室温孵育12h或或41824h。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次。次。 室温下适当稀室温下适当稀释度的胶体金度的胶体金标记探探针（二抗胶体金探（二抗胶体金探针或蛋白或蛋白A胶体金探胶体金探针等）孵育等）孵育3060min。 。 TBS漂洗，漂洗，3min3次，后在用双蒸水漂洗切片。次，后在用双蒸水漂洗切片。 醋酸醋酸铀和硝酸和硝酸铅轻微染色后微染色后电镜观察。察。2.电

14、镜免疫金染色 用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根据抗原的性质加以选择。 染色方法也有直接法和间接法。(5)染色染色结果判断果判断假阳性染色和假阴性染色假阳性染色和假阴性染色可以通可以通过调整固定液种整固定液种类、 、浓度、固定度、固定时间，改，改变一抗一抗和二抗胶体金探和二抗胶体金探针浓度、孵育度、孵育时间、温度等减少假阳性、温度等减少假阳性和假阴性染色。和假阴性染色。双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm, 20nm图7-11 血小板表面胶体金标记GPIb单抗 9000铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术 铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种免疫细胞化学技术。这技术

15、曾广泛应用于病毒和细胞表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法仍然是一种基本技术。 基本原理：基本原理： 铁蛋白是一种直径铁蛋白是一种直径101012nm12nm的球形的蛋白质（分子的球形的蛋白质（分子量量450kD450kD）, ,它含有致密的铁胶粒核心（直径约它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm7.5nm），），该核心含该核心含2000200050005000个铁原子，分布于四个区域，形成个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高

16、的电子密度，因此可用于电四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体- -铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。观察。 病毒免疫病毒免疫电镜技技术5. 影响因素：影响因素：1 1） ） ） ）样样品的品的品的品的纯纯度度度度： ： 负负染染色色样样品品纯纯度度要要求求不不是是很很高高， ，最最好好进进行行适适当当纯纯化化； ；样样品品杂杂质质

17、太太多多， ，如如大大量量的的细细胞胞碎碎片片、 、培培养养基基残残渣渣、 、糖糖类类、 、各各种种盐盐类类结结晶晶均均会干会干扰扰染色效果及染色效果及电镜观电镜观察。察。2 2） ） ） ）样样品的品的品的品的浓浓度度度度： ： 被被检查检查的的样样品要有适当的品要有适当的浓浓度。太度。太浓浓 太稀均影响太稀均影响电镜观电镜观察。察。 3 3） ） ） ）样样品与染液的均匀分散度品与染液的均匀分散度品与染液的均匀分散度品与染液的均匀分散度为为促促促促进样进样品与染料的均匀品与染料的均匀品与染料的均匀品与染料的均匀分散提高染色效果，可以采用某些分散分散提高染色效果，可以采用某些分散分散提高染色

18、效果，可以采用某些分散分散提高染色效果，可以采用某些分散剂剂 4 4） ） ） ）悬悬液与染液的酸碱度液与染液的酸碱度液与染液的酸碱度液与染液的酸碱度 一般以中性或略偏酸性（一般以中性或略偏酸性（一般以中性或略偏酸性（一般以中性或略偏酸性（PH 6.4PH 6.47 7） ） ） ）为为宜。宜。宜。宜。 5 5）染色）染色）染色）染色时时机的把握机的把握机的把握机的把握 吸去吸去吸去吸去过过多多多多样样品品品品悬悬液后尽快滴加液后尽快滴加液后尽快滴加液后尽快滴加负负染色液染色液染色液染色液1、标本染液混合染色法：l l病毒病毒悬悬液和液和2 2的磷的磷钨钨酸染液等量混合酸染液等量混合l l用用

19、毛毛细细管管滴滴到到有有膜膜的的载载网网上上（ （吸吸去去过过多多的的病病毒毒染液混合物），待干后染液混合物），待干后进进行行电镜观电镜观察。察。l l一般一般认为认为病毒病毒浓浓度在度在10105 5以上以上时时不不难发现难发现病毒。病毒。 2、琼脂扩散技术： 检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。 用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。3、假复型技术：琼琼脂脂或或琼琼脂脂糖糖表表面面上上粘粘附附的的病病毒毒颗颗粒粒， ，以

20、以假假复复型型的的形式形式转转移到火棉胶膜上或移到火棉胶膜上或FormvarFormvar膜上。膜上。此此种种方方法法： ：能能去去除除标标本本中中的的盐盐分分、 、浓浓缩缩病病毒毒； ；减减少少不不必要的必要的杂质杂质；比；比较费时较费时。 。方法：方法：1 1） ）将将20%20%的的琼琼脂脂糖糖块块放放到到载载玻玻片片上上， ，滴滴上上含含病病毒毒的的悬悬液液， ，将将它它放放到到紫紫外外灯灯下下照照射射消毒，直到消毒，直到悬悬液被液被琼琼脂吸干。脂吸干。2 2）在）在琼琼脂脂块块的表面加一滴的表面加一滴0.5%Formvar0.5%Formvar溶液，把多余的溶液，把多余的Formva

21、rFormvar用用滤纸滤纸片吸走。片吸走。3 3） ）用用刀刀片片将将琼琼脂脂块块的的边边缘缘切切除除（ （为为便便于于剥剥离离） ）轻轻轻轻将将载载有有琼琼脂脂块块的的载载玻玻片片浸浸入入PTAPTA或醋酸或醋酸铀铀溶液中，并把溶液中，并把FormvarFormvar膜剥离和漂浮到染液水面上。膜剥离和漂浮到染液水面上。 4 4）将）将铜铜网放到剥离到水面上的网放到剥离到水面上的 FormvarFormvar膜上。膜上。5 5）用不）用不锈钢锈钢小柱把小柱把铜铜网膜同网膜同FormvarFormvar膜一起打膜一起打捞捞出来，即可出来，即可进进行行电镜观电镜观察。察。4、病毒、病毒颗粒免疫粒

22、免疫电镜技技术： ：病毒病毒病毒病毒颗颗粒与其外周相伴随的粒与其外周相伴随的粒与其外周相伴随的粒与其外周相伴随的结结构成分构成分构成分构成分杂质杂质或人工或人工或人工或人工损伤产损伤产物混淆不清。物混淆不清。物混淆不清。物混淆不清。 特特特特别别是是是是肠肠道病毒与道病毒与道病毒与道病毒与粪粪便中成分便中成分便中成分便中成分难难以分辨。以分辨。以分辨。以分辨。这这种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒种情况需要借助特异性的抗血清（抗体），把病毒颗颗粒包被、凝聚起来。粒包被、凝聚起来。粒包被、凝聚起来。

23、粒包被、凝聚起来。病毒病毒病毒病毒颗颗粒粒粒粒经过经过特异性的抗体特异性的抗体特异性的抗体特异性的抗体结结合并凝聚成合并凝聚成合并凝聚成合并凝聚成团团之后，在之后，在之后，在之后，在负负染色下染色下染色下染色下显显示出示出示出示出病毒病毒病毒病毒结结构，构，构，构， 或包被在病毒或包被在病毒或包被在病毒或包被在病毒颗颗粒表面的抗体，形成抗体粒表面的抗体，形成抗体粒表面的抗体，形成抗体粒表面的抗体，形成抗体桥桥， ， ， ，这这种种种种电镜电镜技技技技术术称作免疫称作免疫称作免疫称作免疫电电镜镜技技技技术术。 。 。 。样品制备步骤： 取取0.9ml0.9ml病毒病毒悬悬液加液加0.1ml 10

24、.1ml 1： ：1010稀稀释释的的 恢复期病人血清充分混匀恢复期病人血清充分混匀 371371小小时时后，置后，置44冰箱冰箱过过夜夜 然后用然后用琼琼脂脂扩扩散法或假复型法制作散法或假复型法制作 电镜标电镜标本本 负负染色后，染色后，电镜检查电镜检查根据抗体凝聚的病毒根据抗体凝聚的病毒根据抗体凝聚的病毒根据抗体凝聚的病毒颗颗粒的多少和程度以（粒的多少和程度以（粒的多少和程度以（粒的多少和程度以（+ +）表示。）表示。）表示。）表示。如如如如果果果果检检查查不不不不到到到到抗抗抗抗体体体体包包包包被被被被的的的的病病病病毒毒毒毒颗颗粒粒粒粒， ， ， ，可可可可离离离离心心心心， ， ， ，将将将将沉沉沉沉淀淀淀淀重重重重悬悬浮浮浮浮于于于于1-21-2滴滴滴滴蒸蒸蒸蒸馏馏水水水水中中中中， ， ， ，再再再再用用用用同同同同样样方方方方法法法法滴滴滴滴膜膜膜膜、 、 、 、负负染。染。染。染。利用免疫利用免疫利用免疫利用免疫电镜电镜技技技技术发现术发现和和和和鉴鉴定了定了定了定了许许多重要的病毒。多重要的病毒。多重要的病毒。多重要的病毒。