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1、第五节第五节 酶的提取纯化与活力测定酶的提取纯化与活力测定一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法细胞产生的酶有二类：细胞产生的酶有二类：1. 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞细胞外酶外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。易得到。2. 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为化作用，称为细胞内酶，细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不
2、仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。性。A. A. 了解所分离酶在细胞中分布了解所分离酶在细胞中分布 B. B. 材料的获取材料的获取 在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。酶制剂。一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶
3、提取基本的方法酶提取基本的方法C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤为：抽提、纯化、结晶主要步骤为：抽提、纯化、结晶 抽提：抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液pHp
4、H最好远最好远离等电点离等电点 。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤：抽提、纯化、结晶主要步骤：抽提、纯化、结晶 浓缩：浓缩：抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。纯化：纯化：纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总
5、量不面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。可避免有所损失。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤1. 主要步骤为：抽提、纯化、结晶主要步骤为：抽提、纯化、结晶 结晶：结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品结晶产品。 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法C. 酶分离纯化的主要步骤酶分离纯化的主要步骤2. 选择分离纯化方法选择分离纯化方法a.盐析法（如硫酸胺）盐析法（如硫酸胺） b.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀
6、法 c.层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析）层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析） d.等电点法等电点法 e.吸附分离法吸附分离法 一一. .酶的分离与提取酶的分离与提取 酶提取基本的方法酶提取基本的方法1. 1. 酶活力概念酶活力概念 酶活力酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。力越高，反之则表示该酶活力低。 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 但但但但是是是是，酶酶酶酶的的的
7、的定定定定量量量量并并并并非非非非对对对对其其其其蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质进进进进行行行行定量，而是对它的定量，而是对它的定量，而是对它的定量，而是对它的催化能力催化能力催化能力催化能力进行定量。进行定量。进行定量。进行定量。所所所所所所以以以以以以，酶酶酶酶酶酶的的的的的的定定定定定定量量量量量量就就就就就就是是是是是是测测测测测测定定定定定定酶酶酶酶酶酶的的的的的的活活活活活活力力力力力力，也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 酶活力
8、概念酶活力概念 如何测定酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？以以以以产物浓度产物浓度产物浓度产物浓度对对对对反应时间反应时间反应时间反应时间作图，可得到作图，可得到作图，可得到作图，可得到酶促反应酶促反应酶促反应酶促反应速度曲线速度曲线速度曲线速度曲线0 0产产物物浓浓度度时间时间注意：初速度的注意：初速度的注意：初速度的注意：初速度的测定是关键，为测定是关键，为测定是关键，为测定是关键，为什么？什么？什么？什么？二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 酶活力概念酶活力概念 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见
9、，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降随着时间的延长，反应速度逐渐下降产产物物浓浓度度时间时间0 0原原原原 因因因因vv底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度的的的的降降降降低低低低、产产产产物物物物的的的的增增增增加加加加造造造造成成成成的的的的逆反应的加快逆反应的加快逆反应的加快逆反应的加快vv产物的抑制作用产物的抑制作用产物的抑制作用产物的抑制作用vv酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活酶本身逐渐失活二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1.
10、 酶活力概念酶活力概念 常用的酶活力单位有三种：常用的酶活力单位有三种：常用的酶活力单位有三种：常用的酶活力单位有三种： A. A. 国际单位国际单位 ( (IU)IU) 这种单位是由国际酶学委员会规定的。这种单位是由国际酶学委员会规定的。这种单位是由国际酶学委员会规定的。这种单位是由国际酶学委员会规定的。 在在在在标标标标准准准准条条条条件件件件(25(25、最最最最适适适适pHpH、最最最最适适适适底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度) )下下下下，酶酶酶酶每每每每分分分分钟钟钟钟催催催催化化化化 1 1 m m m mmolmol 底底底底物物物物转转转转化化化化，这这这这样样样样的的的的速
11、速速速度度度度所所所所代代代代表表表表的的的的酶酶酶酶的的的的活活活活力力力力即即即即酶酶酶酶的的的的量量量量定定定定义义义义为为为为1 1个个个个国国国国际际际际单单单单位位位位 ( (IU)IU)。 2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 B. B. KatalKatal是由国际酶学委员会于是由国际酶学委员会于是由国际酶学委员会于是由国际酶学委员会于19721972年规定的一种新单位年规定的一种新单位年规定的一种新单位年规定的一种新单位在在在在最最最最适适适适条条条条件件件件下下下下，酶酶酶酶每每每每秒秒秒秒钟钟钟钟催催催催化化化化1 1 mol mo
12、l 底底底底物物物物转转转转化化化化，这这这这样样样样的的的的速速速速度度度度所所所所代代代代表表表表的的的的酶酶酶酶的的的的活活活活力力力力即即即即酶酶酶酶的的的的量量量量定定定定义义义义为为为为 1 1个个个个KatKat 。 1 Kat = 60101 Kat = 60106 6 IU IU2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 C. C. 自定义的活力单位自定义的活力单位这这种种单单位位简简单单方方便便，省省去去了了许许多多计计算算；但但只只能能进行酶活力的相对比较。进行酶活力的相对比较。 酶酶酶酶习习习习惯惯
13、惯惯上上上上或或或或测测测测定定定定时时时时使使使使用用用用的的的的反反反反应应应应速速速速度度度度的的的的单单单单位位位位定定定定义为酶的活力单位。义为酶的活力单位。义为酶的活力单位。义为酶的活力单位。有有有有的的的的甚甚甚甚至至至至直直直直接接接接用用用用测测测测得得得得的的的的物物物物理理理理量量量量，如如如如单单单单位位位位时时时时间间间间内消光值的变化内消光值的变化内消光值的变化内消光值的变化 ( (D D D DA/t) A/t) 表示酶活力单位。表示酶活力单位。表示酶活力单位。表示酶活力单位。2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 2. 2. 酶活力与单位酶活力与单位 二二. .酶
14、活力及其测定酶活力及其测定 指指指指每毫克每毫克每毫克每毫克酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶蛋白所含的酶活力单位数酶活力单位数酶活力单位数酶活力单位数比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力越大，表示酶越纯比活力比活力 酶活力单位数酶活力单位数（U U）酶蛋白质量酶蛋白质量（mgmg）3. 3. 酶的比活力酶的比活力 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 纯化倍数纯化倍数纯化倍数纯化倍数 = = 每次比活力每次比活力每次比活力每次比活力/ /
15、第一次比活力第一次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率产率产率( ( ( (回收率回收率回收率回收率) ) ) ) = = 每次总活力每次总活力每次总活力每次总活力/ /第一次总活力第一次总活力第一次总活力第一次总活力100%100% 4. 4. 酶的酶的纯度纯度 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 1. 1. 某某某某酶酶酶酶在在在在一一一一定定定定条条条条件件件件下下下下，5 5 minmin内内内内使使使使30 30 mmolmmol底底底底物物物物转转转转变变变变为产物，问该酶的活力（为产物，问该酶的活力（为产物，问该酶的活力（为产物，问该酶的活力（IUIU）是多少？是多少？是多
16、少？是多少？2. 2. 从从从从某某某某细细细细胞胞胞胞中中中中提提提提取取取取的的的的一一一一种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白水水水水解解解解酶酶酶酶的的的的粗粗粗粗提提提提液液液液300300mLmL含含含含有有有有150150mgmg蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，总总总总活活活活力力力力为为为为360360单单单单位位位位。经经经经过过过过一一一一系系系系列列列列纯纯纯纯化化化化以以以以后后后后得得得得到到到到的的的的4 4mLmL酶酶酶酶制制制制品品品品( (含含含含有有有有0.080.08mgmg蛋蛋蛋蛋白白白白) )，总总总总活活活活力力力力为为为为288288单单单单位位位位。请请请请问问问问回回回回收收收收率率率率是是是是多多多多少少少少？纯纯纯纯化化化化了了了了多少倍？多少倍？多少倍？多少倍？4. 4. 酶的酶的纯度纯度 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较 4. 4. 酶的酶的纯度纯度 二二. .酶活力及其测定酶活力及其测定 纯化纯化进程进程甲甲乙乙丙丙丁丁总活力总活力6432总蛋白总蛋白(mg)201052比活力比活力(U/mg)6/204/103/52/2
