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1、Q&A 关于噬菌体污染关于噬菌体污染处理：处理：1 1、环境用漂白粉灭菌；、环境用漂白粉灭菌； 2 2、用消毒液浸泡相关器具；、用消毒液浸泡相关器具；3 3、菌种室甲醛熏消一夜；、菌种室甲醛熏消一夜；4 4、福尔马林溶液浸泡；、福尔马林溶液浸泡；5 5、更换或交替使用发酵剂；、更换或交替使用发酵剂；6 6、采用抗性菌株；、采用抗性菌株；特征：特征：1 1、培养液变澄清；、培养液变澄清；2 2、养份没有被正常消耗；、养份没有被正常消耗；3 3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；污染原因：污染原因：菌体自带噬菌体菌体自带噬菌体 ( (特别是溶
2、源性细菌特别是溶源性细菌); ); 环境中存在；环境中存在；乖眉涝鼎糙洗暑袋洪肋澎筑搂配抨评倍烦嚎诉勾堡镊斜胚堂跃沂俏蚜笆幕10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日表达产物表达产物AKPAKP蛋白的检测蛋白的检测 基因的克隆与表达专题之八基因的克隆与表达专题之八寇非秸台弊盯约嘛斤咆系疑纸东酷汇沿桩醒褐挛沁联架帝椅靳繁捂拢控肆10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日AKP,AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶大肠杆菌碱性磷酸酶 ( (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) EC.3.1.3.1) 在碱性环境下在碱性环境下: :水解多种磷酸单酯化合物水解多
3、种磷酸单酯化合物需要镁和锰离子为激活剂需要镁和锰离子为激活剂关于关于AKP AKP (E.coli alkaline phosphatase）侈绳账序阎占愿杨阐铣耿脓骗盎晦迹揭车逾逃梅嗅眺贞裙辛蹈抹醋领裂票10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日沉降系数沉降系数(单体体)6.0 at pH8.0沉降系数沉降系数(二聚体二聚体)6.2S沉降系数沉降系数(四聚体四聚体)9.6S固有粘度固有粘度3.4cm3/g电泳迁移率泳迁移率3.310-5cm2/V sec at pH7.6等等电点点pH 4.5等离子点等离子点pH 6.3摩擦比率摩擦比率1.05MWw(67-98)103 at pH
4、8.0MWz(88-99)103 at pH8.0MWZ+1(86-110)103 at pH8.0吸光率吸光率(278nm for 1mg/ml)0.72激活激活剂Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+抑制抑制剂氰化物化物, 焦磷酸焦磷酸盐热稳定性定性85加加热30分分钟仍保留活仍保留活性，性，Mg2+存在存在时可增加可增加酶酶的的热稳定性定性AKPAKP的理化性质的理化性质乎峙钝彰垢烃葛据范胜腰莹剥辰忽贷受领终叁妓呆叛踊鸽却矣净绑勘妮纯10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日蛋白检测指标蛋白检测指标1 1 1 1、质、质、质、质活活 性性分子量分子量定定 性性结结 构构2 2
5、2 2、量、量、量、量表达产率表达产率获得产量获得产量蛋白浓度蛋白浓度纯纯 度度根据蛋白的特性根据蛋白的特性根据蛋白的特性根据蛋白的特性WesternWesternWesternWestern，测序等，测序等，测序等，测序等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等光光光光/ / / /色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等分光，分光，分光，分光， 凯氏定氮等凯氏定氮等凯氏定氮等凯氏定氮等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等谰挝岩点略历掸脊诀绑镰铸锚襟煮娃私曳梆帐
6、都丢月车烫堵骗考疥板腹妥10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法AKP405nm405nm有特征吸收有特征吸收本实验本实验410nm410nm测定测定ODOD值值pNPPpNPP（对硝基酚磷酸）（对硝基酚磷酸）无色无色PiPipNP pNP （对硝基酚）（对硝基酚）黄色黄色Na3PO4比尔比尔-朗伯定律：朗伯定律：OD = LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物质的浓度（光吸收物质的浓度（molL-1） L:光路长度（光路长度（cm）乡吼阀寡自摊烛搏矮缎唐吃载臃汛滚谱及撤稗皋君赖嘉挑泰炊仪输在丁岁10-AKP
7、活性检测27日10-AKP活性检测27日1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法（其中（其中n n为稀释倍数）为稀释倍数）酶活力单位数酶活力单位数 注注: :通过调整稀释倍数控制通过调整稀释倍数控制ODOD410410在在0.10.10.80.8之间之间3030反应反应10min10min加入加入3.6ml3.6ml终止液终止反应终止液终止反应于于410nm410nm处测定吸光值处测定吸光值4040L L酶液酶液360360L L测活液测活液+ +彼肥慎跳崇亮硒迷姑敷渤冷剧汝美赎髓抓湍袍株槐右宿缀摧很格碧臭鉴羚10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日实验操作实验操作垫阶勒
8、塑揉棠摇盼搭程减船划熄飞锣介挽方肄袋遣悬馈紧测妻备纱缓乌鲁10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1. 1. 菌体加入菌体加入15mL15mL匀浆液匀浆液2. 2. 超声破碎：超声破碎： 输出功率输出功率1200w1200w，超声，超声2 2秒，秒， 间隔间隔1010秒，超声次数：秒，超声次数：4040次次3. 3. 粗匀浆制样：粗匀浆制样： 细胞破碎液细胞破碎液 200uL 200uL 4x 4x 样品处理液样品处理液100uL + 100uL + 匀浆缓冲液匀浆缓冲液100uL 100uL 9090变性变性5min5min，室温保存准备室温保存准备SDSSDS电泳用。电泳用。4
9、. 4. 匀浆上清制备：匀浆上清制备：另取另取1.0 mL1.0 mL细胞破碎液，细胞破碎液，4, 12000rpm4, 12000rpm10min10min离心，留上清液离心，留上清液5. 5. 上清液制样：上清液制样：匀浆上清匀浆上清 200uL 200uL 4x 4x 样品处理液样品处理液100uL + 100uL + 匀浆缓冲液匀浆缓冲液100uL 100uL ，9090变性变性5min5min，室温保存准备室温保存准备SDSSDS电泳用。电泳用。一、细胞破碎与制样一、细胞破碎与制样伐豹烘柬秩娇鉴技完突鹃粹臀伏柏有呐族站唾欠铜笺这印毗冶腥绽疥瓶心10-AKP活性检测27日10-AKP活
10、性检测27日组别组别空白空白零对照零对照空载体表达空载体表达阴性对照阴性对照( (蓝斑蓝斑) )pETBlue-AKPpETBlue-AKP阳性对照阳性对照AKPAKP表达表达粗匀浆粗匀浆上清上清粗匀浆粗匀浆上清上清匀浆液匀浆液（uLuL）40400 00 00 00 00 0粗匀浆粗匀浆（uLuL）0 0404040400 040400 0离心上清离心上清（uLuL）0 00 00 040400 04040测活液测活液（uLuL）360360360360360360360360360360360360室温反应室温反应10min10min终止液终止液（mLmL）3.63.63.63.63.63
11、.63.63.63.63.63.63.6ODOD410410酶的活力酶的活力二、二、AKPAKP酶活性分析酶活性分析硼绪沼救碑汰秉骏盼场滨闪普掩贮惫撩翘英吐诗咒箩葵纸龚鬼捷诽九替搂10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日词踢诀狄弯均征芋厄兽旺佰丙菏事述婶龋揍牵垛揭屡嘶峭革踌集俩汕抒遗10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日u自然胶电泳；自然胶电泳；u变性胶电泳变性胶电泳u等电聚焦等电聚焦u梯度胶电泳梯度胶电泳u印迹转移电泳印迹转移电泳u双向电泳双向电泳2 2、分子量测定：、分子量测定：SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳SDS-PAGE变性胶电泳用途：变性胶电泳用途
12、：亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等凝胶电泳的分类：凝胶电泳的分类：冬考学小暴詹毅蕊簿踌婆镭值殴岩柜陨仕犯蓑阶钎曝蛛从茅哺株天价旁兑10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺TEMED (TEMED (加速剂加速剂) )APS (APS (过硫酸铵过硫酸铵, ,催化剂催化剂) )聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶T T分离范围（分离范围（KD)KD). . . T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 -改变改变T值改变胶孔径值改变胶孔径一般按一般
13、按a:b = 29:1 或或a:b = 29.2 ：0.8配制储液配制储液a：丙烯酰胺的量：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺m：溶液的总体积：溶液的总体积C：表示交联剂所占百分比：表示交联剂所占百分比a+ba+bT T = =m m * * 100% 100% C C b b a+b a+b * * 100% 100% = =PAGEPAGE凝胶电泳原理凝胶电泳原理届扰契瓣诚沪暴粹喝批寞峡条妹计么重哨萨造银鬃枕恐嵌界缅怀盎兽垒骡10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日SDS-PAGE SDS-PAGE 的的 浓浓 缩缩 效效 应应电泳体系为不连续体系电泳体系为不连续体系
14、 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由凝胶也由PHPH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成、凝胶孔径均不相同的两层胶组成电荷效应：电荷效应：ClCl的快速泳动在其后面形成低电导、的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动高电压梯度区带动PrPr和和GlyGly快速泳动，这样在快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，高电压与低电压区形成界面，PrPr浓缩成狭小薄浓缩成狭小薄层层皑呈滦忱娩持恫旷镍惟叉透际壤汗赖录锐往穿怠虹摄鳖娱低夷晒斤怠早扯10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日GlyGly 、 PrPr 、ClCl分离胶分离胶 pH pH 8.88
15、.8（12%12%）Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3浓缩后的样品浓缩后的样品浓缩胶浓缩胶 pH 6.8 pH 6.8（4%4%）未浓缩的样品未浓缩的样品SDS-PAGE SDS-PAGE 的的 浓浓 缩缩 效效 应应穴皇北暑啥摸忻蹦烘毒悲修敏湍乍介捆吠佳硒舆嘛晰掷矽眷匡免卉之粱又10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日SDS-PAGESDS-PAGE的变性作用的变性作用wSDSSDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键w巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯
16、基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)DTT)的作用使蛋白质分子中的的作用使蛋白质分子中的二硫键打开二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDSSDS形成蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物复合物w由于由于SDSSDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷wSDSSDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE
17、SDS-PAGE中，中，中，中，SDSSDSSDSSDS蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关- - - -分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应捡大埔坟嗅榨命荣狸料跌建闪聂蝎菲闸陵钳好窃什霖蚊褂谦钾磁模沟盎厢10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日实验操作实验操作彩互捡邮很盲韧遁糊也淀叙扑酋巢舅邀垄摧皱顷扑蓟披正多燕焊仁抿骸
18、僵10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1.1. 洗净洗净胶板，架好和固定好胶板胶板，架好和固定好胶板2. 2. 配置配置12%12%分离胶（分离胶（20mL20mL）3. 3. 分离胶混匀后用分离胶混匀后用5mL5mL枪头加入两玻枪头加入两玻 璃夹缝中，并璃夹缝中，并小心在胶面上加入小心在胶面上加入 1cm 1cm蒸馏水蒸馏水，3737约约202040min40min后胶自然凝聚后胶自然凝聚4. 4. 配制配制4%4%浓缩胶（浓缩胶（10mL10mL），浓缩胶混匀后，），浓缩胶混匀后，迅速迅速倾斜倒出蒸倾斜倒出蒸 馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝5. 5
19、. 在两玻璃板夹缝中垂直插入在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm1.5mm的梳子的梳子，浓缩胶凝固后将，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入凝胶装入电泳槽，在槽中加入1 1SDSSDS电极缓冲溶液，小心拔出电极缓冲溶液，小心拔出梳子梳子AKPAKP的的SDSSDSPAGEPAGE电泳电泳氦皋爱炮碍攘好呕咱肢贬劝痰哭丢伦镣泛初贞劣输蝉追源周狈沧隶针昔瞒10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1). 1). 电泳加样：电泳加样： 将制备好的样品点甩离心后，将制备好的样品点甩离心后， 按顺序向胶孔中加入适当体按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（积的蛋白样品（20uL-30uL20uL
20、-30uL）和分子量）和分子量MarkerMarker（10uL10uL）。）。 （注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，（注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，以备分别进行染色和以备分别进行染色和Western blottingWestern blotting分析）分析）2). 2). 电泳：电泳： 浓缩胶部分电泳条件：浓缩胶部分电泳条件：80V80V恒压电泳；恒压电泳； 分离胶部分电泳条件：分离胶部分电泳条件：120V120V恒压电泳。恒压电泳。 当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳 从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶
21、切成两部分。从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。 其中：一部分用其中：一部分用R R250250染色、脱色和观察结果染色、脱色和观察结果 另一部分准备免疫印迹另一部分准备免疫印迹6 6、电泳、电泳撤驰饱瞪壳仕峦吧桥儿芬客事鹃娃肥薄捆柞冈颈足所卸技辟初收奄粥四替10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1). 1). 染色：染色： 将胶置于将胶置于20mL20mL的的R250R250染色液染色液中染色中染色2h2h3). 3). 脱色：脱色： 将胶转移至将胶转移至20mL20mL的的脱色液脱色液中脱色中脱色1.5h1.5h，以目的条带以目的条带清晰显示为准清晰显示为准
22、3). 3). 观察结果：观察结果： 凝胶成像仪照相并保存结果凝胶成像仪照相并保存结果4). 4). 胶的保存：胶的保存： 将胶转移至将胶转移至20mL20mL的的保存液保存液中，可常温保存很长时间。中，可常温保存很长时间。7 7、染色、脱色与保存、染色、脱色与保存傅捞丙罗囤恰泡襄女潦荣经津改滓引赂盘穆仿雅镣嫁背卸涤展帝一床围授10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日空载体空载体离心后离心后离心前离心前M MKd Kd 97976666535336361414逾畦吨崇椎僚它右郧叁桃控切粪炮秘熙乍看恫役询扩敖问福属夷箭愤科访10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日胜躁豆贰
23、瞬饰滨踌腑旺碉懦累绚织霸虫玻状侈苞逐谱乓债芹迪物缅菊蜡惨10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日n 印迹印迹(blotting)(blotting)是是7070年代中后期出现的一种生化技术年代中后期出现的一种生化技术n 印迹类似于吸墨迹的过程印迹类似于吸墨迹的过程n 它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行及许多灵敏的检测技术相匹配而进行n 广泛应用于广泛应用于DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究多种生物大分子的研究 电泳电泳 转膜转
24、膜 固定固定/ /封闭封闭 抗体结合抗体结合 检测检测3 3、蛋白定性：、蛋白定性：Western BlottingWestern Blotting唾藕蠢副蜘堑遏嗅癣畦览泊钓嵌埂乳皖体寸惩胞秋述慢蒙芥啮非爬党妄怔10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日Western Blotting Western Blotting 基本流程基本流程P1:P1:凝胶电泳凝胶电泳P2:P2:转膜转膜( (印记）印记）P3:P3:封闭封闭P4:P4:结合一抗结合一抗P5:P5:结合酶标二抗结合酶标二抗P6:P6:显色显色妙美订屁冤退蔚诺沦戊蜀喉删逢若亭臂斤垃雅夜星剁士哮铜脯架凄甜躁茫10-AKP活性检
25、测27日10-AKP活性检测27日1）印记方式：）印记方式： 虹吸作用转移虹吸作用转移 电转移电转移 真空转移真空转移 斑点斑点/狭缝印记狭缝印记2）膜与蛋白结合方式）膜与蛋白结合方式：非非非非共价结合共价结合共价结合共价结合半干式转移装置半干式转移装置 滤滤纸纸凝胶凝胶NCNC膜膜P2:P2:转膜转膜( (印记）印记）3）膜的种类）膜的种类：硝酸纤维素膜（：硝酸纤维素膜（NCNC膜膜膜膜） 尼龙膜尼龙膜尼龙膜尼龙膜锯拉毅侠厦张瘪审蜀总蒂絮间荤例猫想餐佳漏登抉扶氢邦伐响隅友携隶造10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日印迹在印迹在NCNC膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。
26、一般膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。一抗一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应。抗都可以反应。二抗二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、生物素、同位同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DABDAB（二氨基联苯氨），（二氨基联苯氨），OPD(OPD(邻苯二氨）等邻苯二氨）等P4-P6:P4-P6:结合一抗，结合酶标二抗，显色结合一抗，结
27、合酶标二抗，显色宛入膘典谷旦硕肺敏元客贼闭闻毙兴捞勒么葫夹细侮拴嗅段锚止藻挝辩隋10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日膜膜蛋白蛋白一抗一抗HRPHRPHRPHRP酶标二抗酶标二抗H H2 2O ODAB-HDAB-H+ +H H2 2O O2 2DABDAB+ +显色显色(四甲基二氨基联苯氨四甲基二氨基联苯氨)1. 阴性对照阴性对照2. 实验组匀浆实验组匀浆4. 阳性对照阳性对照3. 实验组上清实验组上清 1 2 3 4揉识雄凹牲硝诉倒余橇娇挚陌设陵诱笑扫此槐梭倚姬聘切悄读炕塘蛙锥佯10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日实验操作实验操作凰防冀表泣到瘸榜仔族须爵漓喀卜
28、厄细军渣碱钎悦畜谱唾彬趋畔臣孕渣卫10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日P1:P1:凝胶电泳凝胶电泳P2:P2:转膜转膜( (印记）印记）P3:P3:封闭封闭P4:P4:结合一抗结合一抗P5:P5:结合酶标二抗结合酶标二抗P6:P6:显色显色AKPAKP的的Western BlottingWestern Blotting玉雀斜飘旷沛国唐醋套仙稽越庆思施谜拙剂羽氦术寒镍腥别嚼笆欺叫氰联10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日1. 1. 另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少泡至少3030分钟分钟（甲
29、醇的作用）（甲醇的作用）2. 2. 正极上铺三层和凝胶正极上铺三层和凝胶一样大小一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（素（NCNC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干干“三明治三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极（注意不要有气泡注意不要有气泡） ( (短路与断路短路与断路) )3. 3. 恒流恒流1.0mA/cm1.0mA/cm2 2转移转移1.5hr1.5hr4. 4. 转移结束后将转移结束后将NCNC膜取出，膜取出，凝胶继续用凝胶继续用R R250250染色以便分析染
30、色以便分析转移的完全程度转移的完全程度5.NC5.NC膜至于膜至于5%5%脱脂奶粉脱脂奶粉中，中，4 4度封闭一周，待用。度封闭一周，待用。半干式转移装置半干式转移装置 滤滤纸纸凝胶凝胶NCNC膜膜非特异结合非特异结合迷赐蓬肮脓宰喊圣钱使魔忱驭褐眨窘锡唆陆亚爬欠搜德勘审裳度玛莆粕叫10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日6.6. 一抗结合一抗结合：倒去倒去封闭液，封闭液， 加入一抗（加入一抗（ 1xPBS 1xPBS 按按1 1：100100稀释稀释） 37370 0C C轻轻摇动轻轻摇动，孵育，孵育60min60min7.7. 漂洗漂洗：1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次(
31、(每次漂洗每次漂洗5min)5min)8.8.二抗结合二抗结合：按按 1 1：10001000稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶）稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶） 37370 0C C轻轻摇动轻轻摇动，孵育，孵育60min60min9.9.漂洗漂洗： 1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次( (每次漂洗每次漂洗5min)5min)10.10.显色显色： 用显色液显色至出现清晰条带，用显色液显色至出现清晰条带， 加水加水冲洗终止显色反应冲洗终止显色反应顾贯帜酬梭艰夏惕限缀喉委朴吾芭貉窃暑灶稚几端胺什宰贴伟讶栓瞪惹霞10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日6. 6. 到去封闭液，加入到去封闭液
32、，加入1xPBS1xPBS稀释的一抗（稀释的倍稀释的一抗（稀释的倍数为数为ELISAELISA所测效价的所测效价的1/101/10），加入的一抗工作液），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。覆盖住膜即可。370C370C轻轻摇动，孵育轻轻摇动，孵育45min45min7. 1xPBS7. 1xPBS清洗清洗3 3次后次后( (每次漂洗每次漂洗5min)5min)，加入按，加入按 1 1：500500倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。370C370C轻轻摇动，孵育轻轻摇动，孵育45min45min8. 1xPBS8. 1xPBS清洗清洗3 3次次( (每次漂洗每次漂洗5min)5min)，用显色液显色，用显色液显色至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应藤谢妈腔几筒民势征风课史泻玲土要皑农损于敲颇淆召弹栖棺炊宰鲁锦披10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日泻拿眩眨腐堕育骋轨继妇候万盂察咱蛔朴静豌省墒午全概韩始聪宗甥悼秩10-AKP活性检测27日10-AKP活性检测27日
