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1、一、一、标本采集与送本采集与送检原原则： 1.尽早采取：尽早采取：发病初期病初期 2.部位适宜：由感染部位采取部位适宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：装有冰冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内或干冰的容器内（一）供分离病毒、（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的出核酸及抗原的标本本（二）（二）检测特异性抗体特异性抗体 的的标本本 采集双份血清，采集双份血清，4-20保存保存病毒材料采集与病毒材料采集与检验结果的关系果的关系采取采取标本的本的时期期检查病毒及其成分病毒及其成分测定抗体定抗体潜伏期及前潜伏期及前驱期期刚发病或急性期病或急性期恢复期及康复期恢复期及康复期较难查见最多最多查见很很难查见未增多未
2、增多未增多或增未增多或增多不明多不明显明明显增多增多（常超（常超过4倍）倍）l病毒分离是病毒分离是诊断病毒感染的金断病毒感染的金标准，一旦阳性，即准，一旦阳性，即可确可确诊。l不适用于快速不适用于快速诊断，操作复断，操作复杂，实验成本高，阳性成本高，阳性检出率低等出率低等l有有时不得不分离病毒，例如不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病，了一种新的病毒病，必必须分离病毒分离病毒进行研究，或者分离株的行研究，或者分离株的鉴定定对流行流行病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望苗，或者希望获得天然弱毒株等。得天然弱毒株等。二、常二、常规
3、分离与分离与鉴定定（一）病毒分离（一）病毒分离标本采集本采集杀灭杂菌菌（青青链霉素霉素）接种接种鉴定病毒种型定病毒种型易感易感动物物出出现病状病状鸡胚胚病病变或死亡或死亡细胞培养胞培养细胞病胞病变三大方法三大方法（二）病毒（二）病毒鉴定定1. 形形态学学鉴定定观察察CPECPE。常。常见的的细胞形胞形态学学变化化为细胞胞变圆、坏死、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常正常细胞胞病病变细胞胞l感染感染细胞具有吸附胞具有吸附红细胞的能力胞的能力l感染感染细胞的培养液中有胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集多游离病毒存在，具有凝集
4、红细胞胞的作用的作用2. 血吸附和血凝作用血吸附和血凝作用多多见于以出芽方式于以出芽方式释放的病毒。放的病毒。红细胞吸附胞吸附正常正常细胞胞（1）血吸附作用）血吸附作用吸附吸附试验可通可通过特异抗血清抑制来达到特异抗血清抑制来达到鉴定定具有吸附特性的病毒具有吸附特性的病毒（2）血凝作用）血凝作用血凝血凝试验血凝抑制血凝抑制试验（3）病毒成分的直接）病毒成分的直接检测用免疫学或分子生物学技用免疫学或分子生物学技术直接直接检查感染感染细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、三、 电子子显微微镜检查 病毒的很多特征如大小、形病毒的很多特征如大小、形态、结构等必构等必
5、须借借助助电子子显微微镜进行行检查。对于目前尚于目前尚难培养而形培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或分泌液，或者接种病料的或者接种病料的鸡胚和胚和细胞培养收胞培养收获的材料作的材料作电子子显微微镜检查，直接，直接观察病毒粒子。察病毒粒子。透射透射电子子显微微镜 1. 正染法：超薄切片法正染法：超薄切片法取材取材固定固定戊二戊二醛四氧化四氧化锇清洗与清洗与脱水脱水浸透浸透包埋包埋聚合聚合切片切片染色染色铀染染铅染染鸡痘病毒（超薄切片）痘病毒（超薄切片）超薄切片法的超薄切片法的优缺点：缺点：l优点：可点：可观察病毒形察病毒形态和形和形态发生生过程程
6、l缺点：操作复缺点：操作复杂，费时，但，但标本可本可长时间保存保存2.2.负染技染技术负染是指通染是指通过重金属重金属盐在在样品四周的堆品四周的堆积而而加加强样品外周的品外周的电子密度，使子密度，使样品品显示示负的的反差，反差，衬托出托出样品的形品的形态和大小。和大小。铜网网样品品 滤纸染液染液（常用磷（常用磷钨酸）酸）1-2分分钟后后电镜观察察口蹄疫病毒的口蹄疫病毒的电镜负染染负染法的染法的优缺点：缺点：l优点：点：快速快速简易（易（10-20min）；分辨率高；）；分辨率高；图象清晰象清晰地病毒地病毒结构构l缺点：敏感性低，要求病毒量在缺点：敏感性低，要求病毒量在10107 7以上；所有以
7、上；所有样品品应处于于悬浮状浮状态免疫免疫电镜技技术是将抗原抗体反是将抗原抗体反应的特异性与的特异性与电子子显微微镜的高分辨力相的高分辨力相结合，在合，在亚细胞和超微胞和超微结构水平上构水平上对抗原物抗原物质进行定位分析的一种高行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。度精确、灵敏的方法。 3.3.免疫免疫电镜技技术(Immune electron microscopy，IEM)（1）免疫凝集）免疫凝集电镜技技术抗原与抗体凝集反抗原与抗体凝集反应后，可使后，可使标本中病毒本中病毒颗粒聚粒聚集成集成团，再，再经负染直接在染直接在电镜下下观察，提高了敏察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性感性，确定病毒
8、的血清学性质。（2）免疫）免疫电镜定位技定位技术特异性抗体用特异性抗体用电子致密物子致密物质，如，如铁蛋白、蛋白、过氧化物氧化物酶等等标记后，使之与后，使之与组织超薄切片中的抗原超薄切片中的抗原结合，在合，在电镜下下观察察到到标记物所在位置，即物所在位置，即为抗原抗体反抗原抗体反应的部位。的部位。 酶标记染色染色 四、四、 血清学血清学试验 是一种常用的是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂脂扩散、中和散、中和试验、标记抗体技抗体技术等免疫血清学方法等免疫血清学方法检查病畜的抗体消病畜的抗体消长情况和情况和发病病组织中的病毒抗原。中的病毒抗原。virus1.
9、1.中和反中和反应观察特异性抗体能否保察特异性抗体能否保护易感的易感的试验动物死亡，能否物死亡，能否抑制病毒的抑制病毒的细胞病胞病变效效应。凡能与病毒。凡能与病毒结合，使其失合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。去感染力的抗体又称中和抗体。2.2.补体体结合反合反应 AgAb红细胞胞溶血素溶血素补体体AbAg红细胞胞补体体溶血素溶血素溶血溶血 （-）不溶血不溶血 （+）3.3.免疫免疫扩散散 4.4.酶联免疫吸附免疫吸附试验 （ELISA）将已知的抗体或抗原将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。保持其免疫活性。测定定时，将待，将待检标本和本和酶标抗抗原
10、或抗体按不同步原或抗体按不同步骤与固相与固相载体表面吸附的抗体体表面吸附的抗体或抗原或抗原发生反生反应。然后加入。然后加入酶的作用底物催化的作用底物催化显色，色，进行定性或定量行定性或定量测定。定。（1）间接接ELISA（2）夹心心ELISA335533333355555533553355模板模板DNA双双链形形成成新新的的双双链DNA退火退火变性性五、分子生物学技五、分子生物学技术1.聚合聚合酶链反反应 2. （PCR）2. 核酸核酸杂交技交技术核酸探核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列）是指能与特定核酸序列发生特异性互生特异性互补的已知核酸片段，可的已知核酸片段，可检测待待检样品中特定的基因品中特定的基因顺序。序。六、六、 感染感染组织的的组织学学检查 病毒在光学病毒在光学显微微镜下无法看到，但是在某些下无法看到，但是在某些病毒感染病毒感染细胞内出胞内出现包涵体，或者包涵体，或者细胞形胞形态发生生变化，化，则对诊断有重要意断有重要意义。如。如Negri氏包涵体氏包涵体是狂犬病犬是狂犬病犬脑细胞的特征。病理胞的特征。病理组织或渗出液作或渗出液作成涂片成涂片检查包涵体包涵体时，常用，常用苏木紫木紫-伊伊红染色法。染色法。狂犬病毒包涵体（狂犬病毒包涵体（Negri body）
