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1、在在EAE中，中，NG2与神与神经炎症、血炎症、血脑屏障改屏障改变、OPCs反反应及及DCs激活有关激活有关影响因子：影响因子：12.213Accepted: 15 March 2016 1Moransard 等人研究等人研究EAE在在NG2KO mice的作用，的作用，发现与与WT mice并没有并没有发现任何任何差异差异 而本作者采用通而本作者采用通过样的方法，的方法，发现NG2在在EAE中中发挥着重要的作用着重要的作用2实验方法方法 工具工具1.ELISA-酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验2.EAE 建模方法建模方法3.工具鼠工具鼠4.bone marrow chimeramouse5.
2、血管内皮通透性试验血管内皮通透性试验31.ELISA-酶联免疫吸附试验4OD52.EAE建模方法EAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化（MS）的理想动物模型。 雌鼠步骤：MOG35-55(200ug)+PBS水溶液水溶液100ul H37RA(结核分枝杆菌核分枝杆菌300ug)+ 然后然后300ul不完全弗氏佐不完全弗氏佐剂超超 声乳化声乳化 尾静脉一次每只尾静脉一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液百日咳病毒（原液400ng/ul) 用用PBS稀稀释使用使用,每每只老鼠腹腔注射只老鼠腹腔注射0.1ml，第第2天注射。天注射。皮下两
3、皮下两侧尾静脉尾静脉6利用同源重组技术WTC57Bl/6JmiceF1NG2+/-MiceF2NG2-/-Mice&NG2+/+MiceWTMice纯合的NG2KOmice3.工具鼠工具鼠the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance7F18WT94.bone marrow chimeramouse骨髓嵌合体小鼠=淋巴造血系统嵌合体=放射性嵌合体彻底破坏受者机体骨髓的造血系统，最大程度的杀灭肿瘤细胞骨髓含造血干细胞，血液也有白血病同基因型105.FITC-dextran血管内皮通透性试验脑微血管内皮细胞（BMEC）拥有丰富的酶系统，但缺乏收缩蛋白，
4、故正常生理状态下组胺、5-羟色胺、白三烯C4等血管活性物质较少影响血脑屏障而病理状态下因BMEC酶系统活性改变，活性物质将影响BMEC，从而进一步影响血脑屏障的通透性。开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过11 在在EAE中，中，NG2与神经炎症、血脑屏障改变、与神经炎症、血脑屏障改变、OPCs反应及反应及DCs激活有关激活有关12Introduction1.NG2-硫酸软骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周细胞表达，NG2、PDGFR 是OPCs（ NG2 cell ）的marker，当其分化成少突状胶质细胞时，这两个marker不表达CNS损伤时，OPCs反应性增殖，表达NG2的细胞在炎症部位
5、聚集 EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少 OPCs分化为少突状胶质细胞，促进髓鞘的生成 CNS微血管中，周细胞促进血管生成，促进紧密连接的形成，从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能； CNS损伤时，充当炎症传感器，免疫监视，执行中性粒细胞 巨噬细胞的功能132.表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关 胶质瘢痕:由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起脑组织的损伤而导致星形胶质细胞增生。反应性星形胶质细胞增生是脑组织损伤的修补反应减弱星形胶质细胞增生，有利于改善脑缺血后神经功能恢复胶质瘢痕形成是一个极其复杂的病理生理过程，包括组织水肿、炎症反炎症反应、
6、局部缺血、谷氨酸受体高反应性、脂质过氧化作用、钙离子超负荷、自由基损伤、反应性星形胶质细胞增生14EAEBBB渗透性改变的疾病3.NG2炎症浸润CNS损伤有关15 4.NG2KO mice ，EAE的临床表现型更轻微 Unexpectedly，NG2有助于EAE的发病机制 OPCs及周细胞表达NG2原因 免疫细胞也表达NG216Abstract在成年人的CNS中，OPCs表达NG2在病理情况下，NG2是周细胞激活的markerEAEBBB渗透性改变的疾病NG2炎症浸润CNS损伤有关171.在NG2KOmice中诱导EAE的发生相比WT,NG2KOmiceEAE临床评分更轻微OPCs的数量在EA
7、E诱导后无改变2.发现NG2在免疫细胞中表达，如T细胞、巨噬细胞树突状细胞3.评估了T细胞致脑炎性物质WTNG2KOmice增殖的致脑炎物质MOG35-55水平相同However，NG2KOmiceT细胞反应偏向于Th2型反应4.是否分泌了炎性因子，联想到DCs，测定IL-12表达情况NG2KOmice中，IL-12-expressingCD11c+细胞显著减少更重要的是，在WTmice中，IL-12的表达在CD11c+NG2-cell比CD11c+NG2+cell要更少5.是否NG2与免疫系统和CNS水平有关-骨髓嵌合体老鼠相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KOmice骨髓的，EAE症状
8、更轻微？研究思路研究思路18Results1.NG2KOmice的EAE表现型更轻微2.NG2KOmice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微3.EAEinducedNG2KOmice，OPCs的数量无改变4.EAEinducedNG2KOmice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关5.免疫细胞表达NG26.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少7.NG2KOmice，IL-12表达较少&NG2参与DC的激活8.NG2不参与巨噬细胞的极化9.NG2KOmice,可调节的免疫反应&保守的BBB导致了EAE轻微的表现型191.NG2KOmice的EAE表现型更轻微A representati
9、ve of three independent experiments is presented 2026/33100%=78.78%disease incidence (84 4.5 vs. 100 % in WT mice) Disease onset was delayed (13.06 3.66 vs. 8.16 1.71 days for WT mice) A representative of three independent experiments is presented 21CD45：血管周浸：血管周浸润的炎性的炎性细胞，巨噬胞，巨噬细胞胞CoII IV :microves
10、sel basal laminaTO-PRO-3：细胞核胞核22脊髓截面染色小胶质细胞&巨噬细胞 激活的星形胶质细胞 Stressmarker-positivecells 浸润的T细胞23大大脑皮皮层脊髓脊髓242.NG2KOmice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微EAE相关的促炎性基因的相关的促炎性基因的mRNA的表达情况的表达情况253.EAEinducedNG2KOmice，OPCs的数量无改变EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少（脱髓鞘过程中） Whether NG2 缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应？ 首先要首先要证明明NG2是不存在的或不生成是不
11、存在的或不生成 免疫荧光定量分析OPCs数量 确定确定PDGFR确定NG2的确敲除了，且在NG2KOmice中不表达26EAE27the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance28在NG2KOmice中，NG2特异性的信号没有被发现（基于NG2敲除的前提下，理解为没有生成），实验更加严谨-IFN-EAE研究研究NG2缺失缺失29免疫免疫荧光定量分析光定量分析OPCs数量数量30MBP:神神经纤维APP:损伤的的轴突突314.EAEinducedNG2KOmice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关周细胞：神经血管形成BBB功能NG2KOmice中
12、，是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性改变有关研究了内皮细胞的紧密连接蛋白、claudin-5、occludin（咬合蛋白）的结构和功能的分布血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关32333435Dextran-FITCexperiments血管内皮通透性试验NG2KO mice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合 可替换信号转导途径 365.免疫细胞表达NG2NG2KOmice，巨噬细胞产生更少的炎性物质，浸润能力减弱NG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关，whether NG2 is expressed in WT mice or not by cells of the sy
13、stemic immune system. ?TCellBMDDCsBMDMs37CD3:T CellCD11c：BMDDsCD11b:BMDMsDAPI：核酸，：核酸，DNA AT区区?386.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:- negativeMO35-55:EAE396
14、.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:- negativeMO35-55:EAE406.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通
15、过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:- negativeMO35-55:EAE416.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:- negativeMO35-
16、55:EAE42抑炎抑炎促炎促炎T增增值情情况况ConA-CD3-TCRConA-NG2-NG24344DCs髓系DCs：IL-12Th0Th1BMDDCs淋巴系DCs：IL-4Th0Th2457.NG2KOmice，IL-12表达减少&NG2参与DC的激活是否是否IL-12表达与表达与NG2表达有关？表达有关？IL-12WT46NG2-CD11c+ cells中，中，lL-12表达表达较少少NG2表达与表达与DCs分泌分泌IL-12有关，有关，进而与而与Th0 Th1有关有关478.NG2不参与巨噬细胞的极化是否是否NG2与巨噬与巨噬细胞极化有关胞极化有关48IFN-IL-4M1：CD86 MHC M2：CD206499.NG2KOmice,EAE轻微的表现型是因为可调节的免疫系统&保守的BBB骨髓移植技术NG2KOmice的免疫反应与EAE临床表现有关炎性因子炎性因子50是否是否NG2KO免疫系免疫系统的重构造成了接种小鼠的的重构造成了接种小鼠的BBB差异？差异？5152
