《实验一 质粒DNA的提取及检测【青苗教育】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一 质粒DNA的提取及检测【青苗教育】（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验一实验一 质粒质粒DNA的提取及检测的提取及检测1技能教育质粒质粒（plasmid）n是染色体外小型（是染色体外小型（1-2001-200kb）的共价、的共价、闭合、合、环状的双状的双链DNA分子（分子（cccDNA），），能自主复能自主复制并能制并能稳定定遗传的的遗传因子。因子。 n常常常常编码一些一些对宿主有利的宿主有利的酶的基因，的基因，这些基些基因的表型包括抗生素抗性、因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制生抗生素、限制酶、修、修饰酶等等 n质粒的复制：粒的复制：严紧型复制（型复制（1 n个个）松弛型复制（松弛型复制（20个以上）个以上） 2技能教育常用的质粒载体常用的质粒载体n
2、是通是通过DNA重重组技技术构建而成的。构建而成的。pUC18, pUC193技能教育质粒提取的思路质粒提取的思路n质粒的特性：共价、粒的特性：共价、闭合、合、环状的小分子量状的小分子量DNAn要去除的物要去除的物质：n蛋白蛋白n基因基因组DNAn脂脂类及小分子及小分子杂质nRNA 4技能教育第一部分质粒第一部分质粒DNA的提取的提取5技能教育一目的一目的n了解提取质粒的原理。了解提取质粒的原理。n学习和掌握质粒提取的方法和技术。学习和掌握质粒提取的方法和技术。n细菌的生长和质粒的扩增细菌的生长和质粒的扩增n菌体的收集裂解及质粒菌体的收集裂解及质粒DNA的分离的分离n质粒质粒DNA的纯化的纯化
3、6技能教育二原理二原理n碱碱变性法提取主要是利用共价性法提取主要是利用共价闭合合环状状质粒与粒与线性染色性染色质在在拓扑学上的差异：拓扑学上的差异：n在在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；仍为自然状态；n将将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之之间交联形成不溶性网状结构，大部分间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污和蛋白质在去污剂剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶
4、状态。通仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白及蛋白质，质粒质，质粒DNA尚在上清中，尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒粒DNA（可省略）（可省略）。7技能教育原理示意图原理示意图 返回目录 返回原理8技能教育三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂 （一）（一）仪器：恒温器：恒温摇床、台式离心机、高床、台式离心机、高压灭菌菌锅（二）材料：含（二）材料：含pUC18（或其他）（或其他）质粒的大粒的大肠杆菌、杆菌、（三）（三）试剂： LB培养基（液体、固体）培养基（液体、固体）溶液溶液I溶液
5、溶液II溶液溶液IIITE(pH8.0)9技能教育溶液溶液 In50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖/1mg/mL溶菌酶溶菌酶n25 mmol/L TrisCl (pH8.0)n10 mmol/L EDTA (pH8.0)n在在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌高压下蒸汽灭菌15分钟，保分钟，保存于存于4。 n作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活10技能教育溶液溶液 IIn0.2 mol/ L NaOH(从从5mol/L贮存液中现用稀释贮存液中现用稀释)n1% SDSn作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。作用：细胞壁
6、肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。11技能教育溶液溶液 IIIn5mol/L 乙酸钾乙酸钾60mln冰乙酸冰乙酸11.5mln水水28.5mln所所配配成成的的溶溶液液中中钾钾的的浓浓度度为为3mol/L，乙乙酸酸根根的的浓浓度度为为5mol/L。n作作用用：酸酸性性条条件件下下质质粒粒DNA复复性性，变变性性蛋蛋白白-SDS线线性性DNA沉淀，沉淀，K可中和可中和DNA12技能教育TE(pH8.0)n10 mmol/L TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)nRNA酶（降解酶（降解RNA）n作用：稳定作用：稳定13技能教育特点：小量质粒制备、最简便、快捷特
7、点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）测序、转染（细提）质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒常用方法：小量碱裂解法常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒小量制备质粒kit大量制备质粒大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验可用于大部分分生实验14技能教育四、实验步骤四、实验步骤接含接含pUC18(pUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3 3ml LB Ampml LB
8、 Amp+ +液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5 ml菌液入菌液入1.5ml的离心管中的离心管中 60006000rpmrpm、离心离心2 2minmin，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100100uLuL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（充分振荡充分振荡），室温），室温1010minmin加入加入200200uLuL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5 5minmin裂解菌体裂解菌体15技能教育加入加入150150uLuL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置1515min
9、min质粒质粒DNADNA复性复性1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清取上清记录体积记录体积到一新管到一新管上清加等体积的酚：氯仿（上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管16技能教育上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（倍体积的无水乙醇（充分混匀充分混匀），冰浴），冰浴 30min 30min1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1 1mLmL洗涤两次（洗涤两次（轻弹混匀、离心轻弹混匀、离心）12
10、00012000rpmrpm，离心离心1010minmin晾干沉淀晾干沉淀沉淀用沉淀用2020ul TEul TE溶解溶解沉淀法沉淀法17技能教育吸附管用吸附管用BL 500ulBL 500ul平衡平衡取上清加入吸附管取上清加入吸附管5000rpm 5000rpm 离心离心5min5min加加PWPW漂洗液漂洗液500ul500ul，放置，放置2min2min10000rpm 10000rpm 离心离心5min5min，晾干，晾干加加3 30 0ul TEul TE，10000rpm 10000rpm 离心离心5min5min（收集到干净的（收集到干净的EPEP管中）管中）吸附法吸附法18技能
11、教育第二部分琼脂糖凝胶电泳第二部分琼脂糖凝胶电泳19技能教育相关知识相关知识n电泳：泳泳：泳动速度决定于？速度决定于？ n琼脂糖凝胶脂糖凝胶天然天然琼脂（脂（Agar）是一种多聚糖，主要由是一种多聚糖，主要由琼脂糖脂糖（Agarose ，约占占8080）及）及琼脂胶（脂胶（Agaropectin）组成。成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不不带电荷。而荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和脂胶是一种含硫酸根和羧基的基的强酸性酸性多糖，由于多糖，由于这些基些基团带有有电荷，在荷，在电场作用下能作用下能产生生较强的的电渗渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白象，加之硫酸
12、根可与某些蛋白质作用而作用而影响影响电泳速度及分离效果。泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用因此，目前多用琼脂糖脂糖为电泳支持物泳支持物进行平板行平板电泳。泳。 20技能教育琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围 21技能教育核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 n不同构型不同构型DNA的移的移动速度依次速度依次为：共价：共价闭环超超螺旋螺旋DNA（cccDNA）直直线DNA（LDNA，2条条链发生断裂）开生断裂）开环的双的双链环状状DNA（ocDNA，1条条链发生断裂）生断裂）。 22技能教育影响迁移
13、率的因素影响迁移率的因素nDNA分分子子的的大大小小、琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓度度、DNA的的构构象象、所所加加电压（一一般般5 5V/cm）、电场方方向向、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在、电泳泳缓冲液的冲液的组成等。成等。23技能教育一、实验目的一、实验目的n通通过本本实验学学习琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳检测DNA的方法和技的方法和技术。24技能教育二、实验原理二、实验原理 nDNA在在琼脂糖凝胶中泳脂糖凝胶中泳动时有有电荷效荷效应和分子和分子筛效效应。n核酸核酸为两性分子，在两性分子，在pH3.5时，整个分子，整个分子带正正电,pH8左右左右时，碱基几乎不解离，整个分子，碱基几乎不解离，整个
14、分子带负电。 n在碱性在碱性环境下，相同碱基数量的双境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的几乎具有等量的净负电荷，能以同荷，能以同样的速度向正极方向移的速度向正极方向移动。具有不同的。具有不同的相相对分子分子质量的量的DNA片段泳片段泳动速度不一速度不一样，可，可进行分离。行分离。DNA分子的迁移速度与相分子的迁移速度与相对分子分子质量的量的对数数值成反比关系，成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以近似用于估算分子的大小。n可以分离相可以分离相对分子分子质量相同，但构型不同的量相同，但构型不同的DNA分子。分子。共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线直线DNA（LD
15、NA，2条链发生断裂）开环的双链环状条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条条链发生断裂）。链发生断裂）。 25技能教育质粒的粒的电泳泳质粒质粒DNA的的3种形式泳动速度种形式泳动速度:超螺旋超螺旋线性线性开环开环 质粒质粒DNA的存在形式有的存在形式有3种种:1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、开环开环DNA:质粒质粒DNA两条链两条链中有一条发生一处或多处断裂，中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张因此可以自由旋转从而消除张力力,形成松弛的环状分子形成松弛的环状分子 3、线性线性DNA:因质粒因质粒DNA的两的两条链在同一处断裂
16、而造成条链在同一处断裂而造成.开环开环超螺旋超螺旋线性线性26技能教育三、仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂 n（一）（一）仪器：器：稳流流稳压电泳泳仪n（二）材料（二）材料1.1.自已提取的自已提取的质粒粒DNA2.2.相相对分子分子质量量标准品准品（三）（三）试剂1155TBE储液液(pH8.0)使用使用时稀稀释1010倍，成倍，成1TBE。22凝胶加凝胶加样缓冲液（冲液（loading buffer）3.3.1% 琼脂糖脂糖4.104.10mg/ml溴化乙溴化乙锭溶液（溶液（EB），），4保存。用保存。用时稀稀释成成 5 5ug/ml的的EB。 27技能教育四操作步骤四操作步骤琼脂糖（琼脂
17、糖（1%）凝胶电泳）凝胶电泳1.称取一定量琼脂糖凝胶，按称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中中100ml的量加入电泳缓冲的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；，使琼脂糖溶解；2.溶液冷至溶液冷至60 ，加入，加入 EB至终浓度为至终浓度为0.5g/ml，混匀，注，混匀，注意戴手套操作；意戴手套操作；3.将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅，迅速插上梳子，检查有无气泡；速插上梳子，检查有无气泡；4.待凝胶完全凝固后（约待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽
18、中，加入电泳板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面，让液面高出胶面1mm；5.在在DNA样品（样品（20ul）中加入）中加入6 loading buffer（4ul），），混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压100V ；6.根据指示剂的位置，判断是否终止电泳根据指示剂的位置，判断是否终止电泳;7.在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。28技能教育五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论n根据观察结果，绘图。根据观察结果，绘图。n分析自提质粒的情况。分析自提质粒的情况。 29技能教育图图1的电泳结果不是很
19、好，一方面上样量太大不同构象的质粒的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图电泳，这样走出的条带会较均匀。图2的结果较好。的结果较好。30技能教育六六注意事项注意事项 为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：n加入溶液加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；n加溶液加溶液II裂解要完全裂解要完全(快速轻柔颠倒快速轻柔颠倒510次次) ，使蛋白质，使蛋白质和核酸变性；和核酸变性；n加溶液加溶液III后后pH要达到中性要达到中性(轻柔振荡轻柔振荡510次次 )，使质粒，使质粒DNA复性，这样才能使质粒复性，这样才能使质粒DNA与染色体与染色体DNA完全分完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。握。31技能教育
