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1、第三章第三章细胞生物学研讨方细胞生物学研讨方法法Chapter3MethodsandTechniquesinCellBiology Preparatory observe put forward theoretics Design control testsCollect data Explain results Devise conclusionRefer to knowledge 生物学研讨普通规律生物学研讨普通规律Outline第三节第三节细胞培育及细胞工程细胞培育及细胞工程一、动物细胞的分别及培育一、动物细胞的分别及培育二、植物细胞的培育二、植物细胞的培育三、细胞工程三、细胞工程一细胞
2、交融与细胞杂交技术一细胞交融与细胞杂交技术二单克隆抗体技术二单克隆抗体技术三细胞显微技术三细胞显微技术第四节第四节方式生物方式生物第一节第一节形状学研讨方法形状学研讨方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜技术三、扫描隧道显微镜技术第二节第二节细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、细胞组分的分别一、细胞组分的分别二、细胞组分的化学染色二、细胞组分的化学染色三、放射自显影技术三、放射自显影技术四、显微分光光度技术四、显微分光光度技术五、分子杂交技术五、分子杂交技术六、流式细胞技术六、流式细胞技术七、免疫学方法对细胞组分的分析七、免疫学方法对
3、细胞组分的分析第一节第一节形状学研讨方法形状学研讨方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术一普通光学显微镜一普通光学显微镜及其标本的制备及其标本的制备二荧光显微镜及其二荧光显微镜及其运用运用三扫描激光共聚焦三扫描激光共聚焦显微镜及其运用显微镜及其运用四相差显微镜四相差显微镜五暗视场显微镜五暗视场显微镜六微分干涉显微镜六微分干涉显微镜七荧光能量共振转七荧光能量共振转移技术移技术八荧光漂白恢复技八荧光漂白恢复技术术1 1、构成、构成照明系照明系统：光：光源源光学放大系光学放大系统：物物镜、目、目镜、聚、聚光器和光光器和光阑机械安装：机械安装：镜筒、物筒、物镜转换器、器、镜臂臂镜座、座、 载物台、物
4、台、调焦螺旋焦螺旋Olympus显微镜的构造图显微镜的构造图一普通光学显微镜一普通光学显微镜2、原理：经物镜构成倒立实像，经目镜、原理：经物镜构成倒立实像，经目镜进一步放大成像。进一步放大成像。光学显微镜的放大原理和光路图光学显微镜的放大原理和光路图普普通通光光学学显微微镜光光路路图3、主要的性能参数、主要的性能参数2 2孔径角：由孔径角：由标本上一点本上一点发出的出的进入物入物镜最最边缘光光线L L和和进入物入物镜中心光中心光线OAOA之之间的的夹角角/2/2称称为孔径角。孔径角。3 3数数值孔径：令孔径：令NA = nsin (NA = nsin (/2), /2), 叫物叫物镜的数的数值
5、孔径。孔径。 数数值孔径与孔径与显微微镜的分辨率有的分辨率有亲密关系，密关系， 越短，越短，N N A A越大，分辨率越高。越大，分辨率越高。1 1分辨率：分辨率：显微微镜能分辨的最小能分辨的最小间隔，用隔，用D D表示。表示。显微微镜的的鉴别间隔隔越小，分辨率越高。越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin ( D=0.61/ nsin (/2)/2) D D：分辨率：分辨率 : :光波的波光波的波长 n: n:介介质折射率折射率 : :物物镜镜口角口角( (标本在光本在光轴的一的一 点点对于物于物镜镜口的口的张角角) ) sin/2 sin/2的最大的最大值必然小于必然小于1 1；介；介
6、质为空气，空气，镜口率普口率普通通为0.050.050.950.95；油；油镜头用香柏油用香柏油为介介质，镜口率可接近口率可接近1.51.5。 普通光普通光线的波的波长为400 400 700nm 700nm，分辨力数，分辨力数值不会小不会小于于0.2m0.2m，人眼的分辨力，人眼的分辨力为0.2mm,0.2mm,因此因此显微微镜的最大的最大设计倍数倍数为1000X1000X。 制造光学制造光学镜头所用的玻璃折射率所用的玻璃折射率为1.65 1.65 1.78 1.78，所用介所用介质的折射率越接近玻璃的越好。的折射率越接近玻璃的越好。几种介质的折射率几种介质的折射率4、显微镜的几个光学特点、
7、显微镜的几个光学特点5、察看标本的制备：、察看标本的制备：复水复水染色染色脱水脱水透明透明封片封片察看察看取材取材固定固定脱水脱水包埋包埋切片切片脱蜡脱蜡第一步第一步.固定固定(fixation)目的：使大分子交目的：使大分子交联而而坚持固定，持固定，不至在后面不至在后面过程中移位或程中移位或丧失。失。试剂：甲：甲醛、戊二、戊二醛机理：可与蛋白机理：可与蛋白质的游离氨基构成的游离氨基构成共价共价键，将，将临近蛋白分子交近蛋白分子交联。第二步第二步.脱水脱水第三步第三步.包埋包埋embed目的：包埋使目的：包埋使组织变得巩固得巩固,便于切片。便于切片。试剂：蜡、：蜡、树脂脂机理：可机理：可进入入
8、细胞内，起支持作用。胞内，起支持作用。第四步第四步.切片切片section目的：切成薄片，便于切片黏附在目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上玻片上进展染色。展染色。仪器：切片机器：切片机切片厚度：切片厚度：110m第五步第五步第五步第五步. .染色染色染色染色stainingstaining 目的：使目的：使目的：使目的：使细细胞成胞成胞成胞成为为可可可可见见. . 方法：方法：方法：方法：A.A.选择选择性染色性染色性染色性染色苏苏木精木精木精木精细细胞内核酸的分布胞内核酸的分布胞内核酸的分布胞内核酸的分布伊伊伊伊红红细细胞胞胞胞质质染色染色染色染色B.B.特异性染色特异性染色特异性染色特
9、异性染色酶酶+底物底物底物底物 抗原抗原抗原抗原+抗体抗体抗体抗体可见光可见光紫外光紫外光红外光红外光shortlong 二荧光显微镜二荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)1. 1. 原理原理: : 荧光分子在遭到光照射后，荧光分子在遭到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。射出比原来吸收波长更长的光。2.2.根本构造：根本构造： A A 光源光源 B B 二向色镜：反射短波光线，透过二向色镜：反射短波光线，透过长波光线长波光线 C C 一组滤光片：得到纯的激发光和一组滤光片：得到纯的激发光和发射光发射光 荧光显
10、微镜光路图荧光显微镜光路图3.荧光的察看光的察看:1.自自发荧光光某些天然物某些天然物质本身能本身能发出出荧光，光，如叶如叶绿素。素。2.二次二次荧光光非非荧光性物光性物质用用荧光色素染色光色素染色后，可后，可产生生荧光二次光二次荧光，以光，以便于便于进展察看展察看。3.抗体抗体荧光技光技术带荧光光标志的抗体与志的抗体与标本中的抗本中的抗原原结合，合，这样就能就能经过抗体抗体结合的合的荧光察看到抗原。光察看到抗原。4.绿色色荧光蛋白光蛋白图示：图示：鼠自动脉平滑肌鼠自动脉平滑肌的荧光染色。的荧光染色。核核:blue:blue线粒体线粒体:green:green肌动蛋白肌动蛋白:red :red
11、 200ng/mlADM处置处置BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光察看后细胞微丝骨架的荧光察看对照组对照组原理原理: : 荧光抗体与光抗体与标本切片中本切片中组织或或细胞的胞的抗原抗原进展反响，在展反响，在荧光光显微微镜下察看到亮下察看到亮堂的特异堂的特异荧光。光。荧光素光素标志抗体的方法志抗体的方法 直接法：直接法：荧光素直接和第一抗体偶光素直接和第一抗体偶联。 间接法：接法：荧光素先和第二抗体光素先和第二抗体( (抗第抗第一抗体的抗体一抗体的抗体) )偶偶联，再与第一抗体作用。，再与第一抗体作用。4.免疫免疫荧光光显微微镜技技术Immunofluorescencemicroscopy发光原
12、理光原理: : 蓝色光色光 GFP GFP 绿色色荧光光特特点点: : 可可在在光光镜程程度度，对特特异异蛋蛋白白质等等生生物物大大分子分子进展定位及展定位及显示一些示一些细胞超微构造。胞超微构造。运用运用: a.: a.特异蛋白特异蛋白质等大分子的定位等大分子的定位 b. b.察看察看过氧化物氧化物酶体体5.绿色色荧光蛋白光蛋白greenfluorescentproteinGFP载体载体(GFP(GFP基因待定位蛋白基因基因待定位蛋白基因) ) 导入特定的细胞导入特定的细胞 荧光显微镜下察看荧光显微镜下察看 待定蛋白质在细胞内的位置分布待定蛋白质在细胞内的位置分布特异蛋白质生物大分子定位特异
13、蛋白质生物大分子定位察看过氧化物酶体察看过氧化物酶体 GFP GFP 过氧化物体内的酶有定位过氧化物体内的酶有定位信号信号导入不同细胞导入不同细胞 荧光显微镜下察看各种细胞的过氧化物荧光显微镜下察看各种细胞的过氧化物酶体酶体三激光共聚焦扫描显微镜三激光共聚焦扫描显微镜Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM显微CT 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台上下挪动,改动焦平面得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有
14、较高的分辨率，约是普通焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的光镜的3 3倍。倍。运用：运用： 察看细胞形状察看细胞形状 统计光密度来定量细胞内成分统计光密度来定量细胞内成分 三维重建三维重建四相差显微镜四相差显微镜1.19531.1953年年年年诺贝尔诺贝尔物理物理物理物理奖奖2.2.特点特点特点特点: :可用以察看活可用以察看活可用以察看活可用以察看活细细胞。胞。胞。胞。3.3.原理原理原理原理:波波波波长长颜颜色色色色振幅振幅振幅振幅亮度亮度亮度亮度速度速度速度速度相位相位相位相位普通普通显微微镜:光光经过染色染色标本本时，波，波长和振幅和振幅发生生变化，人眼才干察看到。但光化，人
15、眼才干察看到。但光经过活活细胞胞时，波波长和振幅几乎无改和振幅几乎无改动，这就无法用人眼察就无法用人眼察看。看。相差相差显微微镜细胞内的各构造可因密度不同而胞内的各构造可因密度不同而产生相位生相位差差(即光程差即光程差)，不，不过人眼无法人眼无法鉴别这种微小的种微小的变化。相差化。相差显微微镜可以把可以把这种种“相位差相位差变成成“振幅差，即振幅差，即图像的明暗差。像的明暗差。经过致密部分经过致密部分(如细胞核如细胞核),速度速度慢慢经过疏松部位经过疏松部位(如细胞质如细胞质),速度速度快快相位差相位差相位差相位差( ( ( (光程光程光程光程差差差差) ) ) )振幅差振幅差振幅差振幅差(
16、( ( (明暗差明暗差明暗差明暗差) ) ) )相差相差显微微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜 载物台的上方：载物台的上方： 光源光源 长长焦距聚光器焦距聚光器 载物台的下方：载物台的下方： 物镜物镜运用：直接对培育的运用：直接对培育的 细胞进展细胞进展察看察看培培育育中中的的上上皮皮细胞胞活活细胞胞的的有有丝分分裂裂 在日常生活中，室内在日常生活中，室内飞扬的微粒的微粒尘土是不易被看土是不易被看见的，但在暗的的，但在暗的房房间中假中假设有一束从光有一束从光线从从门缝斜射斜射过来，灰来，灰尘便粒粒可便粒粒可见了，了，这是是光学上的丁达光学上的丁达尔景象。景象。 制造暗制造暗视野野显微微镜的灵感的
17、灵感 五暗视野显微镜五暗视野显微镜原理原理:利用特殊安装使照利用特殊安装使照射光斜照到样品上，照射射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗光无法进入物镜，故呈暗视野。只需从样品发出的视野。只需从样品发出的散射光才干进入物镜被放散射光才干进入物镜被放大大,在暗的背景中呈现亮在暗的背景中呈现亮堂的像。堂的像。分辨率：分辨率：典型的典型的动物物细胞胞1020m普通的普通的细菌和菌和线粒体粒体0.5m(500nm)普通普通显微微镜0.2m(200nm)暗暗视野野显微微镜0.004-0.2m(4-200nm)运用：运用：能察看物体能察看物体轮廓廓,分不清内部的微分不清内部的微细构构造。用以察看活造。
18、用以察看活细胞内的胞内的细胞核、胞核、线粒体粒体,以及液体介以及液体介质中的中的细菌等微粒的运菌等微粒的运动。显微微电影影摄影影记录细胞或胞或细胞器运胞器运动过程和速度程和速度用显微电影摄影术或电视录像以一定间隔拍摄一次细胞用显微电影摄影术或电视录像以一定间隔拍摄一次细胞形状，当影片或电视录像以正常速度反映时，所拍摄的情节形状，当影片或电视录像以正常速度反映时，所拍摄的情节就被大大加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞其就被大大加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞其的运动过程和速度。的运动过程和速度。六微分干涉显微镜六微分干涉显微镜A普透明视场显微镜；普透明视场显微镜；B相差显微镜；
19、相差显微镜；C微分干涉显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜以微分干涉显微镜以平面偏振光为光源。光平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分成两线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束经过另一棱镜将这两束光会合，从而样品中厚光会合，从而样品中厚度上的微小区别就会转度上的微小区别就会转化成明暗区别，添加了化成明暗区别，添加了样品反差并且极有很强样品反差并且极有很强立体感，适于研讨细胞立体感，适于研讨细胞中较大的细胞器。中较大的细胞器。荧光共振能量转移原理图荧光共振能量转移原理图七荧光能量共振转移技术七荧光能量共振转移技术FRE
20、T八荧光漂白恢复技术八荧光漂白恢复技术(FRAP)荧光漂白恢复技术原理图荧光漂白恢复技术原理图二、电子显微镜二、电子显微镜一透射电子显微镜一透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM1. 原理原理 以以电子束作光源，子束作光源，电磁磁场作透作透镜。电子束子束波波长短，且波短，且波长与加速与加速电压(通常通常为50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。由由电子照明系子照明系统、电磁透磁透镜成像系成像系统、真、真空系空系统、记录系系统、电源系源系统等等5部分构成。部分构成。分辨力分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。用于察看超微构
21、造用于察看超微构造ultrastructure，即，即小于小于0.2m、光学、光学显微微镜下无法看清的构造，下无法看清的构造， 又称又称亚显微构造微构造submicroscopic structures。透射电镜透射电镜光学显微镜光学显微镜电子束经过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，电子束经过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只需剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。只需剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。由于散射的电子不参与成像，故标本中密度大的部分成像后构成电子流由于散射的电子不参与成像，故标本中密度大的部分
22、成像后构成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而构成明区。量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而构成明区。2.透射电镜生物标本制造：透射电镜生物标本制造：取材取材取材取材固定：防止固定：防止固定：防止固定：防止产产生构造改生构造改生构造改生构造改动动。戊二戊二戊二戊二醛醛：在蛋白：在蛋白：在蛋白：在蛋白质质分子之分子之分子之分子之间间构成共价构成共价构成共价构成共价键键, ,将它将它将它将它们们交交交交联联在一同。在一同。在一同。在一同。四氧化四氧化四氧化四氧化锇锇：除与蛋白共价：除与蛋白共价：除与蛋白共价：除与蛋白共价结结合外，合外，合外，合外，还对还对脂脂脂脂类类有良有良有良
23、有良好的固定效果。好的固定效果。好的固定效果。好的固定效果。(3)(3)脱水：脱水：脱水：脱水：标标本必需置于高真空中本必需置于高真空中本必需置于高真空中本必需置于高真空中进进展展展展电镜电镜察看察看察看察看, ,所以所以所以所以电镜电镜生物生物生物生物标标本不能含水。梯度乙醇。本不能含水。梯度乙醇。本不能含水。梯度乙醇。本不能含水。梯度乙醇。(4)(4)包埋：包埋：包埋：包埋：为为使柔使柔使柔使柔软软生物生物生物生物组织组织制成超薄切片制成超薄切片制成超薄切片制成超薄切片, ,并使切片并使切片并使切片并使切片耐受高真空、耐受高真空、耐受高真空、耐受高真空、电电子子子子轰击轰击，应应在切片前将
24、在切片前将在切片前将在切片前将标标本本本本进进展包展包展包展包埋埋埋埋, ,常用常用常用常用环环氧氧氧氧树树脂。脂。脂。脂。(5)(5)切片：切片：切片：切片：电电子穿透力很弱子穿透力很弱子穿透力很弱子穿透力很弱, ,需将需将需将需将样样品制成品制成品制成品制成5050100nm100nm厚薄片。厚薄片。厚薄片。厚薄片。约为细约为细胞的胞的胞的胞的1/2001/200厚度。厚度。厚度。厚度。(6)(6)染色：生物分子由原子序数低的染色：生物分子由原子序数低的染色：生物分子由原子序数低的染色：生物分子由原子序数低的轻轻元素元素元素元素组组成，它成，它成，它成，它们们散射散射散射散射电电子才干弱子
25、才干弱子才干弱子才干弱, ,在在在在电镜电镜下几乎不存在明暗反差下几乎不存在明暗反差下几乎不存在明暗反差下几乎不存在明暗反差, ,需需需需加大生物加大生物加大生物加大生物样样品反差，品反差，品反差，品反差，进进展染色。重金属浸染。展染色。重金属浸染。展染色。重金属浸染。展染色。重金属浸染。3 3、透射电镜提高样品反差的方法、透射电镜提高样品反差的方法原理：用只堆积于样品周原理：用只堆积于样品周围的、比样品密度高的物质围的、比样品密度高的物质(如如磷钨酸磷钨酸)对样品进展染色，使样对样品进展染色，使样品和背景构成显著的明暗对比品和背景构成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法这种染背景而不染
26、样品的方法叫负染。叫负染。运用：适用于颗粒或纤维运用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是在病毒等游离的样品。特别是在病毒性致病因子的超微病理诊断中性致病因子的超微病理诊断中广泛运用。广泛运用。1负染技术负染技术冰冻蚀刻冰冻蚀刻freeze-etchingfreeze-etching 标本置于干冰或液氮中标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴显露了断面构造。冰升华，暴显露了断面构造。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜为复膜replicare
27、plica。随随随随样样品外表品外表品外表品外表构造的高低起构造的高低起构造的高低起构造的高低起伏，重金属构伏，重金属构伏，重金属构伏，重金属构成不同厚度的成不同厚度的成不同厚度的成不同厚度的薄膜，薄膜，薄膜，薄膜，显显示了示了示了示了投影效果，投影效果，投影效果，投影效果，给给出了一个出了一个出了一个出了一个样样品品品品外表构造的三外表构造的三外表构造的三外表构造的三维图维图像。像。像。像。4、电镜三维重建技术、电镜三维重建技术二扫描电子显微镜二扫描电子显微镜Scanningelectronmicroscope，SEM1、扫描电镜的成像原理、扫描电镜的成像原理阴极钨丝加热后产生的阴极钨丝加热
28、后产生的电子束经过栅极和阳极加电子束经过栅极和阳极加速和会聚，再经二级聚光速和会聚，再经二级聚光镜及物镜会聚构成具有一镜及物镜会聚构成具有一定能量、一定束流强度和定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束；束斑直径的微细电子束；电子束在扫描线圈驱动下，在试样外表按一定时间、空间顺序作栅电子束在扫描线圈驱动下，在试样外表按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子发射量随试样外表形貌而变化；发射量随试样外表形貌而变化；二次电子信号被搜集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。二次电子信号被搜
29、集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).蛙蛙的的内内耳耳毛毛细胞胞三扫描隧道显微镜三扫描隧道显微
30、镜scanningtunnelingmicroscope，STM1、原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的、原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在一定高度针尖在一定高度100nm以内上扫描样品时，以内上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压此处电子云重叠，外加一电压2mV2V，针，针尖与样品之间构成隧道电流。电流强度与针尖和尖与样品之间构成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的间隔有函数关系，将扫描过程中电流的样品间的间隔有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子程度的凹凸形变化转换为图像，即可显示出原子程度的凹凸形状。状。2、分辨率：横向为、分辨率：横向为0.10.2nm
31、，纵向可达，纵向可达0.001nm。3、用途：三态固态、液态和气态物质均可、用途：三态固态、液态和气态物质均可进展察看。进展察看。第二节第二节细胞组分的分别及分析技术细胞组分的分别及分析技术一、一、细胞胞组分的分分的分别离心技离心技术 是分别细胞器如细胞核、线粒体、高尔基体是分别细胞器如细胞核、线粒体、高尔基体及各种大分子根本手段。及各种大分子根本手段。 转速为转速为1025kr/min1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。 转速转速25kr/min25kr/min，离心力，离心力89K89K者称为超速离心者称为超速离心机。机。 目前超速离心机的最高转速可达目前超
32、速离心机的最高转速可达100000r/min100000r/min。一差速离心一差速离心Differentialcentrifugation1 1、特点：、特点： 介介质密度均一；密度均一； 速度由低向高，逐速度由低向高，逐级离心。离心。2 2、用途：、用途： 分分别大小相差大小相差悬殊的殊的细胞和胞和细胞器。胞器。 沉降沉降顺序：核序：核线粒体粒体溶溶酶体与体与过氧化物氧化物酶体体内内质网与高基体网与高基体核蛋白体。核蛋白体。 可将可将细胞器初步分胞器初步分别，常需，常需进一步一步经过密度密度梯离心再行分梯离心再行分别纯化。化。二密度梯度离心二密度梯度离心 用介质在离心管内构成一延续或不延续
33、的密度梯用介质在离心管内构成一延续或不延续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，经过离心度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，经过离心力场的作用使细胞分层、分别。力场的作用使细胞分层、分别。 类型：速度沉降、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分别活细胞的介质要求：分别活细胞的介质要求：1 1能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2 2pHpH中性或易调为中性；中性或易调为中性；3 3浓度大时浸透压不大；浓度大时浸透压不大；4 4对细胞无毒。对细胞无毒。1 1、速度沉降、速
34、度沉降velocity sedimentationvelocity sedimentation 用途：分别密度相近而大小不等的细胞或用途：分别密度相近而大小不等的细胞或细胞器。细胞器。 原理：介质密度梯度平缓，分别物按各自原理：介质密度梯度平缓，分别物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而到达分别的目的沉降系数以不同的速度沉降而到达分别的目的。的。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分别生物颗粒的最小密度。小于被分别生物颗粒的最小密度。2.2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation isopycnic sedimentati
35、on用途：分别密度不等的颗粒。用途：分别密度不等的颗粒。原理：样品各成分在延续梯度的介质中经过一定时原理：样品各成分在延续梯度的介质中经过一定时间的离心那么沉降到与本身密度相等的介质处，并间的离心那么沉降到与本身密度相等的介质处，并停留在那里到达平衡，从而将不同密度的成分分别。停留在那里到达平衡，从而将不同密度的成分分别。特点：特点： 1 1介质密度较高，陡度大，介质的最高密度介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分别组分的最大密度。应大于被分别组分的最大密度。 2 2所需的力场通常比速率沉降法大所需的力场通常比速率沉降法大1010100100倍，倍，往往需求高速或超速离心。往往需求高速
36、或超速离心。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation组织化学和细胞化学染色方法组织化学和细胞化学染色方法histochemicalandcytochemicalstainingmethod用于对某些用于对某些细胞成分进展定性和定位研讨。细胞成分进展定性和定位研讨。一固定一固定1.物理固定：血膜空气快速枯燥、冷冻枯燥。物理固定：血膜空气快速枯燥、冷冻枯燥。2.化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定
37、。甲醛丙酮缓冲液固定。二显示方法二显示方法二、细胞组分的化学染色二、细胞组分的化学染色1. 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反响产物最终生金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反响产物最终生成成CoSCoS或或PbSPbS有色沉淀，而显示出酶活性。有色沉淀，而显示出酶活性。2. Schiff2. Schiff反响：细胞中的醛基可使反响：细胞中的醛基可使SchiffSchiff试剂中的无色品红变试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸FeulgenFeulgen反响。反响。3. 3. 联苯胺反响：过氧化物酶分解联苯胺反响：过氧化物酶分解H20
38、2H202，产生新生氧，后者再将，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4. 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5. 5. 茚三酮反响：显示蛋白质。茚三酮反响：显示蛋白质。三、放射自显影术三、放射自显影术 用于研用于研讨标志化合物在机体、志化合物在机体、组织和和细胞中胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。作用部位等等。 原理：将放射性同位素原理：将放射性同位素标志的化合物志的化合物导入生入生物体
39、内，物体内，经过一段一段时间后，制取切片，涂上后，制取切片，涂上卤化化银乳胶，乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。放射性曝光，使乳胶感光。 普通用普通用14C14C和和3H3H标志。常用志。常用3H-TdR3H-TdR来来显示示DNADNA，用，用3H-UdR3H-UdR显示示RNARNA；用；用3H3H氨基酸研氨基酸研讨蛋白蛋白质，用，用3H3H甘露糖、甘露糖、3H3H岩藻糖研岩藻糖研讨多糖。多糖。 14C 14C半衰期半衰期为57305730年，年，3H3H为12.512.5年。年。四、显微光谱分析技术四、显微光谱分析技术细胞中一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、细胞中一些成分具有特定的吸收光谱
40、，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有本人特征性的蛋白质、细胞色素、维生素等都有本人特征性的吸收谱线。吸收谱线。可利用显微分光光度计对某些成分进展定位、可利用显微分光光度计对某些成分进展定位、定性和定量测定。定性和定量测定。五、分子杂交技术五、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，经过氢键结合，构成在适当条件下，经过氢键结合，构成DNA-DNADNA-DNA，DNA-DNA-RNARNA或或RNA-RNARNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间能否具有互补
41、关系。单链分子核苷酸序列间能否具有互补关系。一原位杂交一原位杂交in situ hybridizationin situ hybridization 用于检测染色体上的特殊用于检测染色体上的特殊DNADNA序列。最初是运用序列。最初是运用带放射性的带放射性的DNADNA探针，后来又发明了荧光探针法。探针，后来又发明了荧光探针法。人类染色体端人类染色体端粒粒DNADNA的荧光的荧光原位杂交照片原位杂交照片二二SouthernSouthern杂交杂交是体外分析特异是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核制性内切酶将核DNA或线粒体或线粒体DNA切成切成DN
42、A片段，片段，经凝胶电泳分别后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探经凝胶电泳分别后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，经过放射自显影，即可识别出与探针互补的针杂交，经过放射自显影，即可识别出与探针互补的特殊核苷序列。特殊核苷序列。将将RNA转移到薄膜上，转移到薄膜上，用探针杂交，用探针杂交，那么称为那么称为Northern杂交。杂交。1、PCR：polymerasechainreaction2、反响体系：、反响体系：样品品DNA；引物引物primer，约15-20个核苷酸；个核苷酸；4种种dNTP；TagDNA聚合聚合酶，来自于嗜来自于嗜热水生菌水生菌Thermusaquaticus，最适作用，最
43、适作用温度温度7580，短，短时间在在95下不失活。下不失活。缓冲体冲体系和系和Mg2+。3、反响、反响过程：程：变性：性：约90-95；复性：复性：约60左右；左右；延伸：延伸：70-75；反复反复“变性性-复性复性-延延伸伸过程程20-30次循次循环。三三PCRPCR技术技术PCR原理六、流式细胞技术六、流式细胞技术用途：对单个细胞进展快速定量分析与分选的一门技用途：对单个细胞进展快速定量分析与分选的一门技术。术。原理：包在鞘液中的细胞经过高频振荡控制的喷嘴，原理：包在鞘液中的细胞经过高频振荡控制的喷嘴，构成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞构成包含单个细胞的液滴，在激光束的照
44、射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处置，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高计算机处置，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分别纯度可达纯度的细胞亚群，分别纯度可达99%。包被细胞的液流称。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪flowcytometer。细胞电泳细胞电泳原理：在一定原理：在一定pH值下细胞外表带有净的正值下细胞外表带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理形状的同种
45、细胞各种细胞或处于不同生理形状的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。速度不同。用途：检测细胞生理形状和病理形状、分用途：检测细胞生理形状和病理形状、分别不同种类的细胞，如分别哺乳动物的别不同种类的细胞，如分别哺乳动物的XY精精子。子。单细胞凝胶胞凝胶电泳泳单细胞程度的胞程度的DNA损伤检测原理：真核原理：真核细胞的胞的DNA分子量很大，分子量很大，DNA超螺旋构造附着在核基超螺旋构造附着在核基质中，中，该方法用方法用琼脂脂糖凝胶将糖凝胶将细胞包埋在胞包埋在载玻片上，在玻片上，在细胞裂解胞裂解液作用下，液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破
46、坏，胞膜、核膜及其它生物膜破坏，细胞内的胞内的RNA、蛋白、蛋白质及其它成分及其它成分进入凝胶，入凝胶，继而分散到裂解液中，唯独核而分散到裂解液中，唯独核DNA仍仍坚持持缠绕的的环区区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并附着在剩余的核骨架上，并留在原位。假留在原位。假设细胞未受胞未受损伤，电泳中核泳中核DNA因其分子量大停留在核基因其分子量大停留在核基质中，中，经荧光光染色后呈染色后呈现圆形的形的荧光光团，无拖尾景象。假，无拖尾景象。假设细胞受胞受损，在中性，在中性电泳液泳液(pH=8)中，核中，核DNA仍仍坚持双螺旋构造，偶有持双螺旋构造，偶有单链断裂断裂(SSBs)并不影响并不影响DNA双
47、螺旋大分子的延双螺旋大分子的延续性。性。只需当只需当DNA双双链断裂断裂(DSBs)时，其断片，其断片进入入凝胶中，凝胶中，电泳泳时断片向阳极迁移，构成断片向阳极迁移，构成荧光光拖尾景象，形似彗星。拖尾景象，形似彗星。用途：用途：检测单细胞程度的胞程度的DNA损伤。小鼠胚胎肝细胞经不同浓度阿霉素处置后小鼠胚胎肝细胞经不同浓度阿霉素处置后DNA损伤情况损伤情况对照组对照组100ng/ml阿霉素阿霉素200ng/ml阿霉素阿霉素一免疫细胞化学一免疫细胞化学immunocytochemistry 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专注结合，对抗根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专注结合，对抗原进展定
48、位测定的技术。常用的标志物有荧光素和酶。原进展定位测定的技术。常用的标志物有荧光素和酶。 免疫荧光法免疫荧光法immunofluorescent techniqueimmunofluorescent technique：常用：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 酶标免疫法酶标免疫法enzyme-labeled antibody methodenzyme-labeled antibody method：常：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反响后构成不透明用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反响后构成不透明的堆积物，从而显示出抗原存在的部位。的堆积物
49、，从而显示出抗原存在的部位。七、免疫学方法对细胞组分的分析七、免疫学方法对细胞组分的分析二免疫电镜技术二免疫电镜技术GoldparticlescoatedwithproteinAareusedtodetectanantibody-boundproteinbytransmissionelectronmicroscopy.三免疫印迹三免疫印迹Westernblotting技技术八、其它生化分析方法八、其它生化分析方法1.三三维构造的分析构造的分析X射射线晶体衍射晶体衍射2.蛋白蛋白质的分的分别纯化化电泳、泳、层析、析、色色谱等等第三节第三节细胞培育及细胞工程细胞培育及细胞工程一、细胞培育一、细胞培
50、育一动物细胞培育一动物细胞培育 群体培育群体培育mass culturemass culture：将含有一定数量：将含有一定数量细胞的悬液置于培育瓶中，让细胞贴壁生长，集合细胞的悬液置于培育瓶中，让细胞贴壁生长，集合confluenceconfluence后构成均匀的单细胞层；后构成均匀的单细胞层； 克隆培育克隆培育clonal cultureclonal culture：培育高度稀释：培育高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞构成一个的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞构成一个细胞集落，称为克隆。细胞集落，称为克隆。 Population cell cultureCloning cel
51、l culture 原代培育原代培育primary culture：即培育直接来自动物机：即培育直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培育瓶转移到另外一个培育瓶称体的细胞群，将细胞从一个培育瓶转移到另外一个培育瓶称为传代或传代培育为传代或传代培育Passage。 细胞系细胞系cell line：具有特定生物学与遗传学特征，：具有特定生物学与遗传学特征，且能在体外稳定永久生生长的细胞群体。通常可来自肿瘤组且能在体外稳定永久生生长的细胞群体。通常可来自肿瘤组织的细胞群或培育中发生突变或转化的细胞。织的细胞群或培育中发生突变或转化的细胞。 有限细胞系有限细胞系 永生化细胞系永生化细胞系 细胞株细胞株
52、cell strain：从原代培育细胞群中挑选出的：从原代培育细胞群中挑选出的具有特定性质或标志的细胞群。具有特定性质或标志的细胞群。常用的几种细胞系常用的几种细胞系二植物细胞培育二植物细胞培育 1. 1. 外植体培育：外植体培育：诱发产生愈生愈伤组织。用于研。用于研讨植物植物的生的生长发育、分化和育、分化和变异；异；进展无性繁衍；制取代展无性繁衍；制取代谢产物。物。 2. 2. 悬浮浮细胞培育：适宜于胞培育：适宜于进展展产业化大化大规模模细胞培胞培育，制取植物代育，制取植物代谢产物。物。 3. 3. 原生原生质体培育：培育脱壁后的体培育：培育脱壁后的细胞，特点：胞，特点： 比比较容易容易摄取
53、外来的取外来的遗传物物质，如，如DNADNA； 便于便于进展展细胞交融，构成胞交融，构成杂交交细胞；胞； 适宜条件下可适宜条件下可产生生细胞壁，胞壁，经诱导分化成完好分化成完好植株。植株。 4. 4. 单倍体培育：倍体培育：经过花花药或花粉培育可或花粉培育可获得得单倍体倍体植株。植株。二、细胞工程二、细胞工程一细胞交融一细胞交融 经过培育和介导，两个或多个细胞合并经过培育和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞交融成一个双核或多核细胞的过程称为细胞交融cell fusion或细胞杂交。或细胞杂交。 同核体：一样基因型的细胞交融而成。同核体：一样基因型的细胞交融而成。 异核体
54、：不同基因型的细胞交融而成。异核体：不同基因型的细胞交融而成。 自发交融：同种细胞在培育过程中自发自发交融：同种细胞在培育过程中自发合并的景象。合并的景象。 诱发交融：异种间的细胞必需经诱导剂诱发交融：异种间的细胞必需经诱导剂处置才干交融。处置才干交融。 诱导细胞交融的方法：生物方法仙台诱导细胞交融的方法：生物方法仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒、化学病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒、化学方法聚乙二醇方法聚乙二醇PEG、物理方法电击和、物理方法电击和激光。激光。二单克隆抗体技术二单克隆抗体技术 正常淋巴细胞如小鼠脾细胞具正常淋巴细胞如小鼠脾细胞具有分泌抗体的才干，但不能长期培育，有分泌抗体的才
55、干，但不能长期培育，瘤细胞如骨髓瘤可以在体外长期培瘤细胞如骨髓瘤可以在体外长期培育，但不分泌抗体。于是英国人育，但不分泌抗体。于是英国人KohlerKohler和和Milstein 1975Milstein 1975将两种细胞杂交而发将两种细胞杂交而发明了单克隆抗体技术，获明了单克隆抗体技术，获19841984年诺贝尔年诺贝尔奖。奖。三显微注射技术三显微注射技术尼康尼康NT-88NE显微操作显微操作/注射仪注射仪显微操作技术显微操作技术micromanipulationtechnique是是指在高倍复式显微镜下，利用显微操指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器作器micromanipulator
56、进展细胞进展细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内挪动的机械安装。视野内挪动的机械安装。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，移植技术已有几十年的历史，Gordon等人等人1962对非洲爪蟾进展核移植获得胜利。我国著对非洲爪蟾进展核移植获得胜利。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进展了许名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进展了许多任务，并获得了
57、丰盛成果。多任务，并获得了丰盛成果。第四节第四节方式生物方式生物由于基因在进化上的保守性和遗传密由于基因在进化上的保守性和遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息通常也适用于基因性质或功能方面的信息通常也适用于其他生物。其他生物。方式生物通常具有个体小、容易培育、方式生物通常具有个体小、容易培育、操作简单、生长繁衍快等特点。操作简单、生长繁衍快等特点。思索题u名词解释：名词解释：u激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术荧光能量共荧光能量共振转移技术振转移技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术电镜负染技术电镜负染技术透射电子显微透射电子显微镜镜显微分光光度术显微分光光度术原代培育原代培育克隆培育克隆培育细胞系细胞系细细胞株胞株原生质体原生质体方式生物方式生物u简述生物学研讨的普通战略道路。简述生物学研讨的普通战略道路。u决议显微镜分辨率的参数有哪些？提高显微镜分辨率的途决议显微镜分辨率的参数有哪些？提高显微镜分辨率的途径有哪些？径有哪些？u免疫荧光显微术的原理与运用。免疫荧光显微术的原理与运用。u流式细胞技术的原理及运用。流式细胞技术的原理及运用。u透射电镜及扫描电镜技术的原理及成像特点。透射电镜及扫描电镜技术的原理及成像特点。
