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1、L/O/G/OL/O/G/O生物技术药物制剂与疫苗生物技术药物制剂与疫苗JARIOS大大连理工大学理工大学Contents生物技术药物制剂概述生物技术药物制剂概述 蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白质类药物新型给药系统蛋白质类药物新型给药系统蛋白质类药物制剂的评价方法蛋白质类药物制剂的评价方法4123 section1Section 2 疫苗疫苗 一、概述一、概述生物技术：是应用生物体或其组成部分，在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。 生物技术药物制剂 是指采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、
2、动物生产的药品。生物技术药物研究概况生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40余种，正在研究的有数百余种，正在研究的有数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。我国已上市的基因工程药物和疫苗我国已上市的基因工程药物和疫苗 19951995年年 白细胞介素白细胞介素-2-2 1996 1996年年 1b-1b-干扰素干扰素2a-2a-干扰素干扰素 2b-2b-干扰素干扰素 19971997年年 粒细胞集落因子粒细胞集落因子 红细胞生成素红细胞生成素 19921992年年 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗生物技术药物的
3、结构特点与理化性质生物技术药物的结构特点与理化性质蛋白质的组成和一般结构 蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质的高级结构包括二级、三级与四级结构。蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质1、蛋白质的一般理化性质旋光性：由螺旋结构引起，通常为右旋紫外吸收：苯核在280nm有最大吸收，氨基酸在230nm显强吸收蛋白质两性性质与电学性质：在不同pH下会成为阳离子，阴离子或两性离子2 2、蛋白质的不稳定性、蛋白质的不稳定性由于共价键引起的不稳定性蛋白质的水解蛋白质的氧化外消旋作用二硫键断裂及其交换由非共价键引起的不稳定性：聚集宏观沉淀表面吸附蛋白质变性蛋白质的理化性质蛋白质的理
4、化性质蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要。 蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法液相色谱法：RP-HPLC,IEC,SEC光谱法:UV,可见吸收光谱，ORD,CD,荧光，IR,拉曼光谱电泳：SDS-PAGE,IEF,EC生物活性测定与免疫测定:重组DNA和杂交瘤技术产品应进行生物活性的测定，蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性。 生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量（绝对量或比活性单位）。免疫测定通常采用免疫化学法在前面讨论蛋白质药物不稳定的原因时已经看出，要开发蛋白质类药物，在前面讨
5、论蛋白质药物不稳定的原因时已经看出，要开发蛋白质类药物，需要多种分析方法。需要多种分析方法。 二、蛋白质类药物制剂的处方与工艺二、蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白类药物的一般处方组成蛋白类注射剂包括：溶液型注射剂：使用方便，需低温保存冻干粉注射剂：稳定，但工艺复杂液体剂型中蛋白类药物的稳定化方法改造其结构加适宜辅料（通过加入各类辅料，改变蛋白类药物溶剂的性质是药物制剂中常用的稳定化方法。 ）蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题。对于注射给药则蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题。对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺，而非注射给药还需解决生物利用度问
6、题。采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺，而非注射给药还需解决生物利用度问题。 蛋白类药物的稳定剂有缓冲液：枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂，磷酸盐缓冲系统表面活性剂：非离子型表面活性剂，如吐温80糖和多元醇：蔗糖，海藻糖，山梨醇等盐类：常用NaCl聚乙二醇类：如PEG200、300、400、600、1000大分子化合物：HSA(人血清蛋白)组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等金属离子：钙、镁、锌等固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺冷冻干燥蛋白质药物制剂 需考虑的问题：选择适宜辅料辅料对冷冻干燥过程中一些参数的影响冻干保护剂：甘露醇，山梨醇，蔗糖，葡萄糖，右旋糖酐等喷雾
7、干燥蛋白质药物制剂： 喷雾干燥工艺广泛应用于蛋白质类药物的控释制剂、吸入剂、微球制剂等新型给药系统的研制中。在喷雾干燥过程中可加入稳定剂，如蔗糖能提高氧血红蛋白（oxyhemoglobin）的稳定性。 缺点是操作过程中损失大，水分含量高高分子聚合物中蛋白质药物的稳定化高分子聚合物中蛋白质药物的稳定化蛋白质药物稳定性 药物的不稳定性通常发生在制备、储存和释放过程中蛋白质药物不稳定机理有：蛋白分子的伸展；水溶性或水不溶性聚集；水解；脱氨和氧化在应用W/O/W复乳溶剂挥发法制备PLGA微球时加入稳定剂BSA或海藻糖可有效提高蛋白质稳定性。包封在聚合物中的蛋白质药物在释放过程中影响稳定性的因素含水量微
8、环境的pH聚合物表面吸附次要因素：水溶性低聚物，渗析效应，蛋白与聚合物之间的直接反应使稳定性研究简化的途径和方法模型蛋白的选用：如以核糖核酸酶A作为模型药物研究蛋白质不稳定性机理聚合物中蛋白质结构的模拟和修饰：模拟蛋白质所处的不利条件以及不稳定机理可用以阐述在蛋白的提取过程之外的不稳定因素。选用不同的聚合物骨架：采用较大几何形状的微柱体来简化蛋白质稳定性的研究与评价。由湿度引起的不稳定性改变固体药物中的含水量，是蛋白质处于非伸展状态以及直接阻断其不稳定机制。锌离子与人生长激素形成不溶性沉淀可提高蛋白质稳定性加入添加剂，可以改变聚合物的吸水量两种常见共价聚集的机制：固体蛋白质在湿环境中二硫键的破
9、环由甲醛介导的聚集过程由酸诱导的蛋白不稳定性提高PLGA包封蛋白稳定性的最直接方法是调节处方以提高微环境的pH值。避免由酸诱导的BSA的物理聚集的方法增加聚合物的通透性，从而使PLGA的水解产物水溶性酸释放出来降低聚酯的降解速率加入适当添加剂，中和聚合物的降解产物弱酸三、蛋白质类药物新型给药系统三、蛋白质类药物新型给药系统n新型注射（植入）给药系统 临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物动力学性
10、质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统（如疫苗）。为满动力学性质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统（如疫苗）。为满足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质进入血流的释放速度等。目前已有用进入血流的释放速度等。目前已有用PEG修饰蛋白质分子以延长蛋白修饰蛋白质分子以延长蛋白质药物在血浆中的半衰期。例如，腺苷酸脱氨酶（质药物在血浆中的半衰期。例如，腺苷酸脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）即采用形成）即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因这种方法，治疗因ADA缺缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已
11、经获乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产。批准生产。控释微球制剂：控释微球制剂： 首次经首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林（leuprolide acetate）聚丙交酯）聚丙交酯乙交酯微球。此种微球供肌内注乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30d之久，改变了普通注射剂之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。需每天注射的传统，使用方便。控释微球制剂常用制备方法复乳液中干燥法（干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素（EPO
12、） 等）低温喷雾提取法喷雾干燥法超临界萃取法脉冲式给药系统：如疫苗或类毒素等抗原蛋白白细胞介素白细胞介素1（IL-1）PLGA微球的制备：微球的制备： Limor Chen等以改良的复乳溶剂挥发法制备。具体方法为：将含有20mg牛血清白蛋白（BSA）和8.5g IL-1的水溶液50l与含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探针式超声乳化（56w）30s，将此初乳分散于1ml用二氯甲烷饱和的1%（w/v）PVA水溶液中，漩涡混悬形成复乳，再将该复乳倾入50ml 0.1%（w/w）PVA水溶液中搅拌5min，再加入50ml含有10%（v/v）2-丙醇的PVA溶液将二氯甲烷抽提到外水相中
13、，连续搅拌30min后，离心10min收集微球，冰冻干燥成流动性粉末状微球。由于皮下注射微球后小于10m微球易被巨噬细胞吞噬，故需将微球粒径控制在10m以上。制备过程中界面张力影响IL-1的活性，加入0.5%（w/w）磷脂酰胆碱（PC）可保护IL-1，并显著减小微球的粒径。微球的体外释放度试验表明，牛血清白蛋白和白细胞介素1在30min钟内分别释放38%和63%，40d内分别释放75%和100%。扫描电镜显示，突释后的释药过程与骨架的溶蚀过程同时进行。n非注射给药系统非注射给药系统 研究非注射途径的给药系统，将有益于增加病人的顺应性研究非注射途径的给药系统，将有益于增加病人的顺应性（compl
14、iance）。蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口）。蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮和肺部给药。目前最有应用前景的属鼻腔给药，服、直肠、口腔、透皮和肺部给药。目前最有应用前景的属鼻腔给药，然而口服给药还是最受欢迎的给药途径，但难度很大。然而口服给药还是最受欢迎的给药途径，但难度很大。蛋白质和多肽类药物的非注射给药系统存在的主要问题是药物透过黏膜能力蛋白质和多肽类药物的非注射给药系统存在的主要问题是药物透过黏膜能力差，易受酶的降解，以致生物利用度很低。差，易受酶的降解，以致生物利用度很低。提高生物利用度的方法：提高生物利用度的方法：对药物进行化学修饰
15、或制成前体药物对药物进行化学修饰或制成前体药物应用吸收促进剂应用吸收促进剂使用酶抑制剂使用酶抑制剂采用离子电渗法皮肤给药采用离子电渗法皮肤给药鼻腔给药系统鼻腔给药系统鼻腔黏膜的特点：鼻腔给药系统存在的问题：吸收促进剂动静脉和毛细淋巴管丰富，大量微小绒毛，穿透性高，酶少，有利于药物吸收分子量大的药物透过性差，生物利用度低，吸收不规则，局部刺激性，妨碍绒毛运动，长期给药的毒性胆酸盐类，脂肪酸及其酯类，其他。胰岛素鼻腔给药系统已进行广泛的研究，胰岛素不用促进剂经鼻腔给药生物利用度小于1，但用葡萄糖胆酸酯作吸收促进剂，其生物利用度可提高到1030。近年来有报道将胰岛素制成淀粉微球，微球直径45m，以0
16、.751Ukg和1.71Ukg剂量喷入鼠鼻腔，达峰时为8min，3040分钟后，血糖分别下降40和64，维持时间4小时，生物利用度约为30。口服给药系统（胰岛素）口服给药系统（胰岛素）存在问题：受胃酸的催化降解；受胃肠道内酶的降解；对胃肠道黏膜的透过性差；受肝脏的首过作用微乳制剂：如自乳化的胰岛素油溶液纳米囊和纳米粒：如胰岛素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米囊胰岛素肠溶胶囊生物黏附材料与肠溶材料的联合应用技术：壳聚糖胰岛素脂质体新型吸收促进剂的应用：SNAC其他给药系统其他给药系统直肠给药系统特点：水解酶活性较低，pH接近中性，避免肝首过效应，一般采用吸收促进剂结肠定位给药系统( OCDDS)口腔黏膜给
17、药系统：避免胃肠消化及肝首过效应经皮给药系统：离子导入技术：指电荷或中性分子在电场作用下迁移进皮肤的过程。肺部给药系统：存在问题：长期给药后安全性评估；肺吸收分子大小的限值；促进吸收的措施；稳定的蛋白质药物的处方设计方法四、蛋白质类药物制剂的评价方法四、蛋白质类药物制剂的评价方法4.1制剂中药物的含量测定提取技术：不能测定包括不溶性聚集蛋白在内的蛋白总量水解技术：在碱性条件下的水解最为常用含量测定方法：紫外分光光度法反相高效液相色谱法：RP-HPLC,IES,SEC法BCA法和Micro BCA法4.2制剂中药物的活性测定制剂中药物的活性测定酶联免疫法是建立在蛋白质类药物的活性部位与抗原决定簇
18、处在相同部位时实施的一种方法。体外药效学方法利用体外细胞与活性蛋白质多肽的特异生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量。是制定药物制剂质量标准最基本的方法。体内药效学方法将药物给予动物或人体后所反应出的药效学反应。4.3制剂中药物的体外释药速率的测定制剂中药物的体外释药速率的测定 蛋白质药物的体内外释药速率的测定方法具体方法：将数个试验组的微球（每个试验组设置数个取样点）置于一定量的溶出介质中，放入37振动孵箱中，定时取样离心分离测定微球中药物含量。影响释放的因素有：介质pH，离子强度，赋形剂，转速，温度等。影响药物释放行为的因素（以微球为例）影响药物释放行为的因素（以微球为例）聚合物的
19、影响聚合物中药物释放的机制：扩散机制和降解机制聚合物的组成对释放的影响聚合物分子量对释放的影响聚合物结构对释放的影响聚合物与药物的相互作用对释放的影响药物对释放的影响药物对释放的影响载药量对释放的影响高载药量的微球突释及累积释放都显著高于低载药量微球。药物稳定性对释放的影响蛋白类药物极易在微球内部聚集称为不溶性沉淀而影响药物释放。制备工艺对释放的影响制备工艺对释放的影响复乳法制备工艺：制备初乳时蛋白质发生复乳法制备工艺：制备初乳时蛋白质发生不可逆聚集，造成释放不完全。不可逆聚集，造成释放不完全。部分无水法制备工艺部分无水法制备工艺低温喷雾提取法制备工艺低温喷雾提取法制备工艺喷雾干燥法制备工艺喷
20、雾干燥法制备工艺附加剂对释放的影响附加剂对释放的影响4.4 制剂的稳定性研究：物理稳定性和化学稳制剂的稳定性研究：物理稳定性和化学稳定性定性4.5 体内药动学研究：体内药动学研究：对于非静脉给药的控缓释制剂的对于非静脉给药的控缓释制剂的体内药动学试验可考虑选择放射标记法测定血浆中药物的量，该方法灵体内药动学试验可考虑选择放射标记法测定血浆中药物的量，该方法灵敏度高，适合多数蛋白质类药物体内血药浓度的测定敏度高，适合多数蛋白质类药物体内血药浓度的测定。 4.6 刺激性及生物相容性研究：刺激性及生物相容性研究：根据我国根据我国SFDA（State Food and Drug Administrat
21、ion）药品注册管理办法）药品注册管理办法规定，皮肤、粘膜及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各规定，皮肤、粘膜及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各类注射（植入）途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进类注射（植入）途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进行所用辅料的生物相容性研究，以确保所用辅料的安全性。行所用辅料的生物相容性研究，以确保所用辅料的安全性。参考文献参考文献1 姜忠义，高蓉，许松伟等. 药物蛋白的聚乙二醇修饰. 中国药学杂志, 2002，37（6）：4092 瞿文，陈庆华，赵瑞钦等. 丙氨瑞林生物可降解缓释微球注射剂的研究. 中国医药工业杂志, 200
22、0,31（1）：14183 毕殿洲主编，药剂学. 北京：人民卫生出版社，19994 吴琼珠等小鼠口服胰岛素复乳后降血糖效果的实验研究中国医药工业杂志，1990，21：445Section 2 疫苗疫苗是指为了预防、控制是指为了预防、控制传染病传染病的发生、流行，用于的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性人体预防接种的疫苗类预防性生物制品生物制品。预防接。预防接种用的种用的生物制品生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素。包括疫苗、菌苗和类毒素。 疫苗（疫苗（vaccine）分为两类。）分为两类。原理：原理： 疫苗是将病原微生物（如疫苗是将病原微生物（如细菌细菌、立克次氏体、立克次氏体、病病毒毒等）
23、及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用用基因工程基因工程等方法制成的用于等方法制成的用于预防传染病预防传染病的的自动自动免疫免疫制剂。制剂。 政府政府自愿、自费自愿、自费种类种类u人工主动免疫制剂人工主动免疫制剂1. 灭活疫苗（甲肝灭活疫苗，就是死疫苗）灭活疫苗（甲肝灭活疫苗，就是死疫苗）2.减毒活疫苗减毒活疫苗 （水痘疫苗水痘疫苗是减毒活疫苗，麻风、是减毒活疫苗，麻风、腮腺炎疫腮腺炎疫苗苗都是属于活疫苗都是属于活疫苗 ）3.类毒素类毒素 （白喉白喉类毒素、类毒素、破伤风破伤风类毒素等）类毒素等）u人工被动免疫制剂人工被动免疫制剂1.抗毒素抗毒素2.人免
24、疫球蛋白制剂人免疫球蛋白制剂3.细胞因子制剂细胞因子制剂4.单克隆抗体制剂单克隆抗体制剂人工主动免疫和人工被动免疫均能使机体增加抗病能力，但人工主动免疫和人工被动免疫均能使机体增加抗病能力，但后者的持续时间短，主要用治疗和紧急预防。后者的持续时间短，主要用治疗和紧急预防。新型疫苗新型疫苗1.亚单位疫苗（亚单位疫苗（subunit vaccine）2.结合疫苗结合疫苗3.合成肽疫苗合成肽疫苗4.基因工程疫苗基因工程疫苗（1）重组抗原疫苗（）重组抗原疫苗（2）重组载体疫苗）重组载体疫苗（3）DNA/RNA疫苗（疫苗（4）转基因植物疫苗）转基因植物疫苗儿童注射疫苗按照我国规定的计划按照我国规定的计划
25、免疫程序免疫程序，宝宝必须在，宝宝必须在1岁内完成岁内完成5种种疫苗的接种疫苗的接种，具体包括以下几种：具体包括以下几种：乙肝疫苗乙肝疫苗 一般在出生两天内、一般在出生两天内、1个月、个月、6个月各注射个月各注射1次，每次，每35年加强注射年加强注射1次。目前使用的多为次。目前使用的多为基因工程基因工程乙肝乙肝疫苗，它可以用于预防所有已知亚型疫苗，它可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感染。的乙肝病毒感染。 不能接种该种疫苗的宝宝有：不能接种该种疫苗的宝宝有：1.发热、患急性传染病、发热、患急性传染病、中耳炎中耳炎、活动活动性结核性结核、心肝肾等疾病；、心肝肾等疾病；2.体制弱，有体制弱，有过敏
26、史过敏史或癫痛者；或癫痛者；3.近期正在进行近期正在进行免疫抑制剂治疗者。免疫抑制剂治疗者。卡介苗卡介苗接种卡介苗可预防结核病。卡介苗在一般婴儿出生后即可接种，如果接种卡介苗可预防结核病。卡介苗在一般婴儿出生后即可接种，如果出生时没接种，可在出生时没接种，可在2个月内接种。在个月内接种。在3岁、岁、7岁及岁及12岁时，如结核试岁时，如结核试验阴性，应进行复种。验阴性，应进行复种。如果宝宝患有这些疾病，就不能进行接种卡介苗，具体为结核病、急如果宝宝患有这些疾病，就不能进行接种卡介苗，具体为结核病、急性传染病、性传染病、肾炎肾炎、心脏病心脏病、免疫缺陷免疫缺陷症、症、湿疹湿疹或其他皮肤病患。或其他
27、皮肤病患。小儿麻痹糖丸小儿麻痹糖丸口服口服小儿麻痹糖丸小儿麻痹糖丸可预防婴儿瘫，即医学上的可预防婴儿瘫，即医学上的“脊髓灰质炎脊髓灰质炎”。现在。现在服用的均是白色三价混和疫苗，出生后满服用的均是白色三价混和疫苗，出生后满2月，初服，以后每隔月，初服，以后每隔1月服月服两次，连服两次，两次，连服两次，4岁加强岁加强1次次不能接种这种疫苗的宝宝有：患严重疾病、发热或有不能接种这种疫苗的宝宝有：患严重疾病、发热或有过敏史过敏史(特别是有特别是有鸡蛋过敏史者鸡蛋过敏史者)不得接种。不得接种。百白破混合制剂百白破混合制剂注射百白破混合制剂可预防注射百白破混合制剂可预防百日咳百日咳、白喉、破伤风。这三种
28、疾病可严、白喉、破伤风。这三种疾病可严重威胁小儿的健康与生命。接种一般是在婴儿出生满重威胁小儿的健康与生命。接种一般是在婴儿出生满3个月时进行，个月时进行，初种必须注射初种必须注射3针，每次间隔针，每次间隔46周，孩子周，孩子1岁到岁到2岁时再复种岁时再复种1次。次。百白破百白破的禁忌：的禁忌：1.有有癫痫癫痫、神经系统疾患及、神经系统疾患及抽风抽风史者禁用；史者禁用；2.急性传急性传染病（包括恢复期）及发热者暂缓注射染病（包括恢复期）及发热者暂缓注射麻疹疫苗麻疹疫苗注射麻疹疫苗可预防麻疹。第一次接种应在婴儿满注射麻疹疫苗可预防麻疹。第一次接种应在婴儿满8个月，到个月，到2岁、岁、7岁、岁、12岁时再进行复种。岁时再进行复种。 强免的疫苗强免的疫苗疫苗疫苗 计划外疫苗计划外疫苗儿童注射疫苗成人可注射的疫苗成人可注射的疫苗乙肝疫苗、甲肝疫苗、肺炎疫苗、水痘疫苗、麻风腮疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗、支气管炎疫苗、流脑疫苗、乙脑疫苗、伤寒疫苗、痢疾疫苗、宫颈癌疫苗、霍乱疫苗等很多
