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1、抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定 1.文献综述2.单抗的制备与鉴定 目的意义 材料方法 结果与分析3.讨论1.文献综述 1.1 流感的病原学 流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科A型、B型流感病毒属和C型流感病毒属A型流感病毒亚型HA: 16NA: 10高致病性禽流感 (HPAI) -H5 and H7 1.2 流感病毒检测技术 1.2.1 病毒的分离鉴定 1.2.2 血清学诊断技术 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验 琼脂凝胶扩散试验（AGID） 神经氨酸酶抑制试验（NIT） 病毒中和试验（NT） 免疫荧光技术（IFT） 酶联免疫吸附试验 （ELISA）1.2.3 分子生物学诊断技术 PCR
2、诊断技术 实时荧光定量PCR NASBA法 核酸探针技术 M 检测法 基因芯片技术 2 单抗的制备与鉴定2.1 研究目的与意义 流感是第一个实行全球监控的传染性疾病。对人及禽、畜的危害十分巨大。除禽流感外，常见的还有人流感、马流感和猪流感等。 动物流感尤其是禽流感与人类流感和人类健康非常密切，禽流感被认为是人流感病毒的保存和发生变异的新基因的来源，这种联系是通过中间宿主来实现的。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能将流感病毒传播给人。 2.1 研究目的与意义 流感的监控工作是预防与控制该病的一个重要环节。国内对流感病毒的临床诊断主要是对抗体的检测。 病毒抗原检测方面，虽然病毒的
3、分离鉴定是诊断禽流感的一种可靠方法，但病毒的分离鉴定、动物接种试验操作复杂，周期长，难以满足对高致病性禽流感快速诊断的需要。聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针等方法则需要较好的试验条件和较高的人员素质，目前还难以广泛推广 。 流感病毒的HA蛋白具有亚型特异性，但NP蛋白却相对保守。 利用NP蛋白和HA蛋白分别有望建立一种所有亚型禽流感病毒的检测方法和诊断流感病毒亚型的方法。而单克隆抗体由于由于特异性以及高度亲和力，用于病毒学诊断时相较于多抗有许多优点。 本研究利用杂交瘤技术获得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗，为对禽流感病毒的进一步研究和建立针对所有亚型禽流感病毒和H3
4、亚型的检测方法奠定基础。 2.1 研究目的与意义2.2 材料方法2.2.1 细胞、病毒与动物 SP2/0骨髓瘤细胞系由本实验室保存。 流感病毒H9N2、H1N1由本实验室分离鉴定，保存。H3N8由哈尔滨 兽医研究所提供。新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、产蛋下降综合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）购自北京梅里亚维通公司。 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司。 BALB/C小鼠购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。2.2.2 培养基及主要试剂lRPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全与不完全佐剂：G
5、IBCOL公司。l新生小牛血清（超级）：四季青生物工程公司。l精制小牛血清：Hyclone公司。l融合剂50PEG（P7181）、羊抗鼠IgG-HRP、 8氮鸟嘌呤：SIGMA公司。l羊抗鼠IgG1、G2aHRP ：SBA公司。l青、链霉素：华北制药厂。 2.3.3 方法l 病毒粒子的大量制备与纯化 l 免疫原的制备l 动物免疫l SP2/0骨髓瘤细胞的活化与制备l 免疫脾细胞的制备 l 细胞融合 l杂交瘤细胞上清检测 l杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）l杂交瘤细胞染色体数的检测 l单克隆抗体的生产、纯化和效价测定 l单克隆抗体亚类鉴定l单抗特异性鉴定l间接免疫荧光法检测单克隆抗体 2.3.3
6、 方法2.3 结果与分析 2.3.1 抗NP蛋白杂交瘤细胞的筛选 用间接ELISA方法进行筛选。使用A法免疫制备了1株抗NP蛋白的单抗1D10，使用B法获得了4株单抗（4F4、1C3、1G11、1C2），使用C法获得了1株单抗(2E7)。 各株单抗用间接ELISA方法的检测结果如表21所示，其中1D10和1G11效价最高，用于以下的试验。抗抗NP杂交瘤细胞上清杂交瘤细胞上清ELISA检测结果检测结果(OD630)l Antigens 1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.5
7、130.456H9N20.9750.4190.3620.6870.3670.386阴性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示没有检测； 所建立的ELISA临界值均为0.2。 2.3.2 抗HA 蛋白杂交瘤细胞的筛选 通过血凝抑制试验进行筛选。 经2 次检测、3 次克隆后获得3株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，连续培养数月，细胞生长良好，反复冻存复苏后，仍保持稳定的抗体分泌能力，分别命名为2B7、1C11、4G7。2.3.3 杂交瘤细胞染色体数的检测 杂交瘤细胞染色
8、体计数结果见表22。2.3.4 单克隆抗体亚类鉴定 以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP 为二抗用间接ELISA 鉴定了单克隆抗体的亚类。 结果见表22。表表22 单克隆抗体亚型及相应杂交瘤细胞单克隆抗体亚型及相应杂交瘤细胞染色体计数染色体计数AntigenCells Antibody isotypes The number of chromosomes Splenocyte 40 SP2/0 70 Hybridoma NP 1D101G11G2aG1 94(8997)83(8186) HA2B71C114G7 G2aG1G2a 90(8294)98(92103)87(7987) 2.3.5
9、单克隆抗体的生产和效价测定单克隆抗体的生产和效价测定表表23 抗抗NP蛋白杂交瘤上清和腹水的蛋白杂交瘤上清和腹水的ELISA效价测定结果效价测定结果(OD630) 1D10supernatant Ascite fluids 1G11supernatant Ascite fluidsH1N1200213100200212100H3N8400212100400211100H9N2400214100400213100NP200212100200210100表表24 抗抗H3 HA蛋白杂交瘤上清和腹蛋白杂交瘤上清和腹水的效价测定结果水的效价测定结果2B71C114G7ELISAsupernatant3
10、208080Ascite fluids2111002810027100HIsupernatant242121Ascite fluids21228272.3.6 单抗特异性鉴定单抗特异性鉴定 将抗NP单抗1D10、1G11分别用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性喉气管炎病毒包被的酶标板作间接ELISA检测，检测结果全部为阴性，说明所制备的单抗与这些病毒均无交叉反应。 抗H3 HA单抗2B7、1C11、4G7分别用H1、H3、H5、H9亚型禽流感病毒及鸡新城疫病毒作血凝抑制试验，检测结果三种单抗只对H3亚型流感病毒有血凝抑制效价，说明说明所制备的单抗与这些病毒均无交叉反应
11、。 2.3.7 间接免疫荧光 分别以一定浓度H1、H3、H9亚型流感病毒感染MDCK细胞，固定细胞后进行荧光染色检测腹水。抗抗NP单抗与单抗与H3N8感染感染MDCK的的IFA检测检测 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗H3 HA单抗与单抗与H3N8感染感染MDCK的的IFA检测检测 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlE 4G7D 1C11C 2B7抗抗NP单抗与单抗与AIV H9亚型感染亚型感染MDCK的的IFA检测检测 A 1G11B 1D10F Po
12、sitive controlG SP2/0H MDCK cells control抗抗H3 HA单抗与单抗与AIV H9亚型感染亚型感染MDCK的的IFA检测检测 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗NP单抗与单抗与 H1N1亚型感染亚型感染MDCK的的IFA检测检测G SP2/0F Positive controlH MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7抗抗H
13、3HA单抗与单抗与H1N1亚型感染亚型感染MDCK的的IFA检测检测3 讨论讨论3.1 单抗制备中需注意的问题l动物的免疫 l细胞融合 l杂交瘤细胞的筛选 l杂交瘤细胞的克隆 l杂交瘤细胞的冻存和复苏 l污染的预防和排除 3.2 关于抗NP蛋白单抗 由于禽流感病毒NP蛋白相对保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗体来检测所有亚型的禽流感病毒。 NP蛋白并非完全保守，因此要保证所制备的单抗是针对其保守性抗原位点的。 3.2 关于抗NP蛋白单抗 为了证实所产生的单克隆抗体确实是针对病毒NP蛋白保守性位点的，采用了多株禽流感病毒和表达的NP蛋白正筛选、阴性尿囊液及破碎的菌体负筛选的方法，筛选到了6株针对禽
14、流感病毒NP蛋白保守性位点的单抗，其中2株是高效价的单抗。 本实验所制备的2株高效价的抗NP蛋白的单抗用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性喉气管炎病毒检测，均无交叉反应，具有很好的特异性。 3.2 关于抗NP蛋白单抗 本研究所获得的针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体为禽流感的诊断，甚至是A型流感病毒的诊断提供了高质量的试剂。 本实验室已在此基础上进行了双夹心ELISA方法检测不同亚型的禽流感病毒的研究，并已经研制出了相关试剂盒应用于临床检测，为实现实验室诊断的标准化、开展流行病学调查研究奠定了很好的基础 。 3.2 关于抗NP蛋白单抗3.3 关于抗关于抗H3N8 HA
15、蛋白单抗蛋白单抗 本研究所制备的3株高效价的抗HA蛋白的单抗用H1、H3、H5、H9亚型禽流感病毒及鸡新城疫病毒作血凝抑制试验，检测结果三种单抗只对H3亚型禽流感病毒有血凝抑制效价 说明所制备的单抗与这些病毒均无交叉反应，具有很好的特异性。 HA是流感病毒的主要表面抗原，一般情况下，新分离的毒株鉴定，一般要做HA的亚型鉴定，故研究针对HA的Mabs，并以其建立快速的检测方法，具有十分重要的意义。 本研究中制备的3株抗H3亚型的Mabs，为抗原分型、血清学诊断、疫苗质量监控及流行病学调查奠定了基础。3.3 关于抗关于抗H3N8 HA蛋白单抗蛋白单抗致谢致谢 感谢导师金梅林教授的指导和教诲以感谢导师金梅林教授的指导和教诲以及三年来的关心、支持和鼓励。及三年来的关心、支持和鼓励。 感谢我的老师、亲人和朋友，感谢所感谢我的老师、亲人和朋友，感谢所有给我帮助和支持的人。有给我帮助和支持的人。
