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1、第六节第六节抗肿瘤药物体外研究方法抗肿瘤药物体外研究方法 用体外细胞作抗癌药筛选具有用药量少用体外细胞作抗癌药筛选具有用药量少, , 周期短周期短, , 费用低等优点。体外筛选结果与体内试验的相关性好费用低等优点。体外筛选结果与体内试验的相关性好, , 因此因此, , 抗癌药体外筛选已作为常规的抗癌药初筛手段。抗癌药体外筛选已作为常规的抗癌药初筛手段。体外研究方法体外研究方法然而然而, ,体外研究方法也有一定局限性，主要是体内环体外研究方法也有一定局限性，主要是体内环境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，体外筛选的体外筛选的最大缺点是无法获得药物对组织选择
2、性方面的资料。此最大缺点是无法获得药物对组织选择性方面的资料。此外外, , 有些药物须在体内有些药物须在体内代谢活化代谢活化 ( (如环磷酰胺如环磷酰胺) )或通过或通过机机体反应体反应( (生物调节剂生物调节剂) )才能对肿瘤细胞起作用才能对肿瘤细胞起作用, , 因而不能因而不能通过体外筛选寻找。通过体外筛选寻找。体外研究方法体外研究方法目前世界上已建立了很多体外癌细胞系目前世界上已建立了很多体外癌细胞系(株株)。药物筛。药物筛选应选用生长特性稳定选应选用生长特性稳定, , 增殖快增殖快, , 对已知抗癌药敏感的对已知抗癌药敏感的细胞系。小鼠与人的细胞系对药物的反应大致相同细胞系。小鼠与人的
3、细胞系对药物的反应大致相同, , 前前者具有在体内外均可进行试验的优点者具有在体内外均可进行试验的优点, , 故较常应用。故较常应用。体外研究方法体外研究方法 观察药物对肿瘤细胞体外生长的抑制作用，可选择观察药物对肿瘤细胞体外生长的抑制作用，可选择10101515种以上肿瘤细胞系种以上肿瘤细胞系( (株株) )进行体外研究，受试药用进行体外研究，受试药用5 5个或个或5 5个以上不同浓度，观察药物对细胞形态、细胞存个以上不同浓度，观察药物对细胞形态、细胞存活、细胞膜功能、生长曲线、克隆形成能力等指标的影活、细胞膜功能、生长曲线、克隆形成能力等指标的影响。每项指标各有其优缺点，因此，应根据实际情
4、况将响。每项指标各有其优缺点，因此，应根据实际情况将几项指标组合起来应用。几项指标组合起来应用。 体外研究方法体外研究方法 体外培养的肿瘤细胞按其生长方式可分为贴附生长体外培养的肿瘤细胞按其生长方式可分为贴附生长型和悬浮生长型两大类型和悬浮生长型两大类: 贴附生长型: 细胞在培养时能贴附在支持物表面生细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，有时称贴壁生长。长，有时称贴壁生长。体外研究方法体外研究方法 悬浮生长型: 细胞在体外培养时不需要附着于支持细胞在体外培养时不需要附着于支持物而在悬浮状态下生长，如取自血、脾或骨髓的培养物而在悬浮状态下生长，如取自血、脾或骨髓的培养细胞、血白细胞等。细胞、血白细
5、胞等。二、二、MTT法法 基本原理基本原理 MTT MTT是一种溴化四氮唑是一种溴化四氮唑, FW:414.3, , FW:414.3, 是能接受氢原是能接受氢原子的染料。子的染料。MTTMTT可进入细胞内，活细胞线粒体中脱氢可进入细胞内，活细胞线粒体中脱氢酶在细胞内可将黄色的酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶性的蓝紫色的转化成不溶性的蓝紫色的甲臢甲臢, , 而死细胞则无此功能。甲而死细胞则无此功能。甲臢臢的生成量通常与活的生成量通常与活细胞数成正比细胞数成正比, , 在一定波长下用酶标仪测定吸光度值在一定波长下用酶标仪测定吸光度值(A), (A), 即可定量测出细胞的存活率。即可定量
6、测出细胞的存活率。MTT 试剂与器材试剂与器材 1.MTT1.MTT溶液溶液 用生理盐水或用生理盐水或PBSPBS配制成配制成5 mg/ml5 mg/ml贮存液，贮存液，在磁力搅拌机上搅拌在磁力搅拌机上搅拌30min30min使之完全溶解。用前通过使之完全溶解。用前通过0.22m0.22m滤膜滤膜除菌除菌和沉淀物，和沉淀物，44避光保存，两周内有效。避光保存，两周内有效。呈黄色呈黄色, ,无沉淀。暂时不用，可冻存。无沉淀。暂时不用，可冻存。 2. 2.含含10%10%胎牛血清胎牛血清RPMI1640RPMI1640培养液，不含酚红指示剂；培养液，不含酚红指示剂；0.25%0.25%胰酶消化液；
7、胰酶消化液；DMSODMSO原液（分析纯）原液（分析纯）, ,作为甲臢的溶解作为甲臢的溶解液。液。MTT 试剂与器材试剂与器材 3. 96 3. 96孔培养板孔培养板( (用新的用新的）, ,血细胞计数板，微量移液器，血细胞计数板，微量移液器，微型振荡器，微型振荡器，COCO2 2培养箱，倒置显微镜，酶标仪。培养箱，倒置显微镜，酶标仪。 MTT 操作步骤操作步骤 1.1.选用选用对数生长期对数生长期的贴附肿瘤细胞的贴附肿瘤细胞0.25%0.25%胰酶消化胰酶消化悬浮于含悬浮于含10%10%胎牛血清的胎牛血清的RPMI1640RPMI1640培养液培养液( (完全培养液完全培养液) )吹打成细胞
8、悬液。吹打成细胞悬液。 2. 2.用台盼蓝拒染法检测用台盼蓝拒染法检测, ,活细胞应在活细胞应在97%97%以上。以上。 若是悬浮生长细胞若是悬浮生长细胞, , 可直接用台盼蓝排染法计数活细可直接用台盼蓝排染法计数活细胞。胞。MTT3.963.96孔培养板每孔加入细胞悬液孔培养板每孔加入细胞悬液190l190l，每孔含，每孔含500050004000040000个细胞个细胞( (根据细胞的类型而定根据细胞的类型而定) )。接种后，。接种后，3737、5%CO5%CO2 2预培养预培养24h24h。 4. 4.将受试药物配成终浓度的将受试药物配成终浓度的2020倍。受试药可用倍。受试药可用DMS
9、ODMSO、培养液或生理盐水溶解。可设培养液或生理盐水溶解。可设5 57 7个浓度组。个浓度组。 MTT5.5.加药组每孔加入加药组每孔加入10l10l药液。因接种的细胞悬液体药液。因接种的细胞悬液体积为积为190l190l，又加入了，又加入了10l10l药液，因此药液被稀释了药液，因此药液被稀释了2020倍，等于所需要的终浓度。倍，等于所需要的终浓度。每组设每组设3 35 5个平行孔，最个平行孔，最好好5 5个个。 6. 6.细胞在细胞在3737、5%CO5%CO2 2培养箱中连续培养培养箱中连续培养48h48h。然后。然后每孔加入每孔加入5mg/ml5mg/ml的的MTTMTT溶液溶液10
10、l10l，继续培养，继续培养4h4h。MTT7.7.小心吸弃孔内上清液小心吸弃孔内上清液( (若为悬浮培养的细胞，需若为悬浮培养的细胞，需1000r/min1000r/min离心离心5min5min后再吸弃上清后再吸弃上清) )。每孔加入。每孔加入150l 150l DMSODMSO，微型振荡器上振荡约，微型振荡器上振荡约10min10min，使甲臢结晶完全溶，使甲臢结晶完全溶解。解。 MTT96孔板用离心机孔板用离心机8.8.设置对照组设置对照组 ：空白对照孔空白对照孔( (调零孔调零孔) )：培养液、培养液、MTTMTT和和DMSODMSO。 实验对照组实验对照组：细胞、相同浓度溶解药物的
11、溶剂细胞、相同浓度溶解药物的溶剂 + + 培养液、培养液、MTTMTT和和DMSODMSO 加药组加药组 ：细胞、受试药物细胞、受试药物 + + 培养液、培养液、MTTMTT和和DMSODMSO阳性药对照组阳性药对照组: :细胞、阳性药细胞、阳性药 + + 培养液、培养液、MTTMTT和和DMSODMSO （操作步骤同加药组）（操作步骤同加药组）MTT 9. 9.用酶标仪在用酶标仪在570nm570nm波长测定每孔的波长测定每孔的A A值值( (参考波长参考波长450 450 nm)nm)。测定时以空白对照孔调零。应尽快完成测定。测定时以空白对照孔调零。应尽快完成测定。MTT 结果评定结果评定
12、 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： 实验对照照组平均平均A值加加药组平均平均A值肿瘤瘤细胞生胞生长抑制率抑制率(%) 100% 实验对照照组平均平均A值 MTT 以同一样品的不同浓度药物对肿瘤细胞生长抑制率作图以同一样品的不同浓度药物对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线可得到剂量反应曲线, , 从中求出该样品的半数抑制浓度从中求出该样品的半数抑制浓度ICIC5050MTT 评价评价 本方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、一些生物活性因本方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定子的活性检测、细胞毒性试
13、验以及肿瘤放射敏感性测定等。该方法的等。该方法的特点是特点是灵敏度高、重复性好、经济、操作灵敏度高、重复性好、经济、操作简便、易实现自动化、无放射性污染，且与其他检测细简便、易实现自动化、无放射性污染，且与其他检测细胞存活的方法（如细胞计数法、克隆形成试验和胞存活的方法（如细胞计数法、克隆形成试验和3 3H-TdRH-TdR掺掺入试验等）有良好相关性。入试验等）有良好相关性。 MTT 注意事项注意事项 1.MTT 1.MTT被活细胞中脱氢酶还原所形成的结晶产物不溶于被活细胞中脱氢酶还原所形成的结晶产物不溶于水，需加入有机溶剂溶解后才能测定水，需加入有机溶剂溶解后才能测定A A值，选择不同的有值
14、，选择不同的有机溶剂或结晶产物溶解不完全，对结果有一定影响。机溶剂或结晶产物溶解不完全，对结果有一定影响。 2. 2.酶标仪滤光片的选择酶标仪滤光片的选择 甲臢的吸收峰受一些因素的甲臢的吸收峰受一些因素的影响，如溶解甲臢的溶剂、影响，如溶解甲臢的溶剂、pHpH等。因此，首先应用优质等。因此，首先应用优质分光光度计测定实验对照组的最大吸收峰，在此基础上分光光度计测定实验对照组的最大吸收峰，在此基础上选择合适的滤光片。选择合适的滤光片。 MTT 3. 3.细胞系的选择及接种的细胞数细胞系的选择及接种的细胞数 由于实验应设计在由于实验应设计在活细胞数与活细胞数与A A值呈线性关系部分进行，故应选用在
15、值呈线性关系部分进行，故应选用在4 47d7d生生长速度适合作此项分析的细胞系。选择适量接种细胞数长速度适合作此项分析的细胞系。选择适量接种细胞数的原则是，实验对照组的细胞在实验结束时的的原则是，实验对照组的细胞在实验结束时的A A值与活细值与活细胞数之间仍处于线性范围（一般胞数之间仍处于线性范围（一般A A值在值在0.20.22.02.0之间）。之间）。 4. 4.甲臢的生成不仅与活细胞数成正比，也受加入甲臢的生成不仅与活细胞数成正比，也受加入MTTMTT后作用时间的影响，即后作用时间的影响，即A A值可随着放置时间而改变。值可随着放置时间而改变。 MTT 5. 5.培养液中的酚红、人血清蛋
16、白、免疫球蛋白和某些添培养液中的酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加剂可使加剂可使A A值增高。在进行值增高。在进行MTTMTT法测定时应先将这类物质洗法测定时应先将这类物质洗去。去。 6. 6.培养液中的血清可使培养液中的血清可使A A值增高，影响测定结果。解决值增高，影响测定结果。解决方法：方法：应用低于应用低于10%10%的胎牛血清，的胎牛血清，加入加入DMSODMSO之前尽量之前尽量吸去孔内残余上清液，吸去孔内残余上清液，用用10% SDS10% SDS盐酸溶液代替盐酸溶液代替DMSODMSO。 7. 7.如用如用DMSODMSO溶解受试药，溶解受试药，DMSODMSO终浓度应低于终
17、浓度应低于0.5%0.5%。 MTT关于每孔的细胞数关于每孔的细胞数预先摸索预先摸索关于边缘效应关于边缘效应四周的孔只加四周的孔只加 PBS PBS关于测定波长关于测定波长570nm570nm？490nm490nm？(460630nm) ( (460, 503, 540, 570, 590, 630 nm460, 503, 540, 570, 590, 630 nm) )在在44存放的试剂，存放的试剂，MTTMTT、DMSODMSO等用前室温平衡等用前室温平衡30min30min所用试剂要先除菌处理所用试剂要先除菌处理MTT三、三、XTT法法 基本原理基本原理 XTT XTT是是MTTMTT的
18、衍生物的衍生物, FW:673.5, FW:673.5。当。当XTTXTT与电子偶联与电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯剂硫酸酚嗪甲酯(PMS)(PMS)同时使用时，同时使用时，XTTXTT可被活细胞内可被活细胞内线粒体脱氢酶还原形成水溶性棕黄色代谢产物，其生线粒体脱氢酶还原形成水溶性棕黄色代谢产物，其生成量与活细胞的数量呈正相关，在成量与活细胞的数量呈正相关，在450nm450nm波长处有较波长处有较大的吸收峰。在一定范围内吸光度大的吸收峰。在一定范围内吸光度(A)(A)与活细胞的数与活细胞的数量呈线性关系，用酶标仪测定代谢产物的量呈线性关系，用酶标仪测定代谢产物的A A值可反映值可反映活细胞的数量。活
19、细胞的数量。 XTT操作步骤操作步骤1.1.取取对对数数生生长长期期培培养养细细胞胞，经经胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化后后，用用含含10%10%胎胎牛牛血血清清的的培培养养液液配配制制成成密密度度为为1101104 4个个/ml/ml细细胞胞悬悬液。液。9696孔孔培培养养板板每每孔孔加加细细胞胞悬悬液液100l100l，再再每每孔孔加加入入不不同同浓浓度度受受试试药药物物( (每每个个浓浓度度设设3 3个个以以上上复复孔孔)10l)10l，3737、5%CO5%CO2 2培养箱温育培养箱温育48h48h。 XTT2.2.受受试试药药物物处处理理48h48h后后，9696孔孔培培养养板板的的每每孔
20、孔加加50l 50l XTT-PMSXTT-PMS应应用用液液( (内内含含50g 50g XTTXTT、0.3825g 0.3825g PMS)PMS)，3737继续培养继续培养2 24h4h。3 3用微型振荡器振荡培养板用微型振荡器振荡培养板2 23min3min后，使染料分布均后，使染料分布均匀，用酶标仪在匀，用酶标仪在450nm450nm波长测定波长测定A A值。值。 结果评定结果评定 同同MTTMTT法。法。 注意事项注意事项 XTT XTT法尤其适用于悬浮培养细胞的研究。本方法法尤其适用于悬浮培养细胞的研究。本方法的优点是加入的优点是加入XTTXTT后由于代谢产物溶于水，勿需吸去上
21、后由于代谢产物溶于水，勿需吸去上清液即可测定清液即可测定A A值，更简便快捷。值，更简便快捷。 2.XTT 2.XTT不如不如MTTMTT那样容易被线粒体中脱氢酶还原，因此那样容易被线粒体中脱氢酶还原，因此必须同时加入电子偶联剂必须同时加入电子偶联剂PMSPMS。 3.XTT-PMS 3.XTT-PMS应用液需预温至应用液需预温至3737才能加入培养板内。才能加入培养板内。 4.XTT 4.XTT的终浓度为的终浓度为0.297mmol/L0.297mmol/L，PMSPMS终浓度多用终浓度多用5 525mol/L25mol/L，一般后者终浓度为，一般后者终浓度为5mol/L5mol/L即可获得
22、满意即可获得满意结果。每孔加入的结果。每孔加入的XTTXTT量不宜过多，若量不宜过多，若XTTXTT超过超过75g/75g/孔，孔，可使可使A A值下降。当每孔培养液超过值下降。当每孔培养液超过100l100l时，时，XTT PMSXTT PMS应应用液的加入量也要相应增加。用液的加入量也要相应增加。 5.XTT 5.XTT水溶液不稳定，加入水溶液不稳定，加入PMSPMS后更不稳定，因而后更不稳定，因而XTT-XTT-PMSPMS应用液一定要临用前新鲜配制。一般在应用液一定要临用前新鲜配制。一般在XTTXTT中加入中加入PMSPMS并混匀后，应立即加入到并混匀后，应立即加入到9696孔板内。孔
23、板内。 6. 6.由于由于XTTXTT法灵敏度高，每孔接种的细胞数不宜过多法灵敏度高，每孔接种的细胞数不宜过多( (通常为通常为50005000个个/ /孔孔) )。但有些细胞代谢活性低，如淋巴细。但有些细胞代谢活性低，如淋巴细胞、角质细胞和黑色素细胞等，每孔接种细胞数需增加至胞、角质细胞和黑色素细胞等，每孔接种细胞数需增加至2.5102.5105 5个，以获得较多的代谢产物。个，以获得较多的代谢产物。四、四、WST-8法法 基本原理基本原理 WST-8WST-8是四唑单钠盐。是四唑单钠盐。CCK-8CCK-8试剂所含的试剂所含的WST-8WST-8在电子在电子载体载体1-1-甲氧基甲氧基-
24、-硫酸吩嗪甲酯硫酸吩嗪甲酯(1-methoxy PMS)(1-methoxy PMS)作用下，作用下，被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性黄色甲臢。被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性黄色甲臢。细细胞内胞内生成的甲臢数量与活细胞的数量成正比，因此可利生成的甲臢数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖测定、细胞毒性分析和抗用这一特性直接进行细胞增殖测定、细胞毒性分析和抗肿瘤药物筛选等。肿瘤药物筛选等。 操作方法操作方法 1. 1.选用对数生长期贴附生长肿瘤细胞，用胰酶消化后，选用对数生长期贴附生长肿瘤细胞，用胰酶消化后，悬浮于含胎牛血清的培养液中，轻轻吹打使成细胞悬液。悬浮于
25、含胎牛血清的培养液中，轻轻吹打使成细胞悬液。 2.96 2.96孔培养板孔内加入细胞悬液孔培养板孔内加入细胞悬液100l100l，置于，置于3737、5%CO5%CO2 2培养箱中培养。细胞接种后贴附需培养箱中培养。细胞接种后贴附需2 24h4h，如不需要贴，如不需要贴附，可以省去此步骤。附，可以省去此步骤。 3.3.每孔加入不同浓度的受试药物，设相应对照组，每孔加入不同浓度的受试药物，设相应对照组，在在3737、5%CO5%CO2 2培养箱中继续培养。加入药物后的培养培养箱中继续培养。加入药物后的培养时间，依药物的性质而定。时间，依药物的性质而定。 4. 4.每孔加入每孔加入10l CCK-
26、810l CCK-8试剂，轻轻振荡使试剂与试剂，轻轻振荡使试剂与培养液混匀。培养液混匀。 5.5.在在3737、5%CO5%CO2 2培培养养箱箱中中继继续续培培养养1 14h4h。由由于于细细胞胞种种类类不不同同，形形成成的的甲甲臢臢量量也也不不同同。如如果果显显色色不不足足，可可以继续培养，以确认最佳培养时间。以继续培养，以确认最佳培养时间。 6. 6.用微型振荡器振荡培养板使颜色均匀后，用酶标用微型振荡器振荡培养板使颜色均匀后，用酶标仪在仪在450nm450nm波长测定波长测定A A值值( (参考波长参考波长655nm)655nm)。测定时需减。测定时需减去空白对照组去空白对照组( (孔
27、孔) )的的A A值（不含细胞的培养液中加入值（不含细胞的培养液中加入CCK-8CCK-8试剂）。试剂）。 结果评定结果评定 同同MTTMTT法。法。 注意事项注意事项 1. 1.本法采用单一试剂，操作简单，敏感性高，重复本法采用单一试剂，操作简单，敏感性高，重复性好。性好。 2.CCK-8 2.CCK-8试剂在试剂在44、避光条件下可保存、避光条件下可保存1 1年。如需长年。如需长时间保存，应置于时间保存，应置于2020。CCK-8CCK-8试剂应避免反复冻融，试剂应避免反复冻融，经常使用可将试剂置于经常使用可将试剂置于44冰箱。冰箱。 3. 3.由于每孔加入的由于每孔加入的CCK-8CCK
28、-8试剂的量比较少，可能会因试剂试剂的量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而导致误差，故在加完试剂后应轻轻敲击培养板沾在孔壁上而导致误差，故在加完试剂后应轻轻敲击培养板以助混匀。也可以用培养液适当稀释以助混匀。也可以用培养液适当稀释CCK-8CCK-8试剂，混匀后加试剂，混匀后加入。入。 4. 4.与贴附生长的细胞相比，与贴附生长的细胞相比，CCK-8CCK-8试剂用于悬浮生长的试剂用于悬浮生长的细胞显色比较困难。可通过延长加入细胞显色比较困难。可通过延长加入CCK-8CCK-8试剂后的培养试剂后的培养时间或增加细胞数量来解决。时间或增加细胞数量来解决。 5. 5.加入的受试药物如果具有还原性，会
29、与加入的受试药物如果具有还原性，会与CCK-8CCK-8试剂试剂反应，可增加吸光度。反应，可增加吸光度。 6. 6.关于不同种类细胞的适宜接种细胞数、培养基及关于不同种类细胞的适宜接种细胞数、培养基及其用量、其用量、CCK-8CCK-8试剂的用量以及加入试剂的用量以及加入CCK-8CCK-8后的培养时间后的培养时间等，可参考生产商日本同仁化学研究所提供的资料。等，可参考生产商日本同仁化学研究所提供的资料。 7.AlamerBlue 7.AlamerBlue是近年美国是近年美国Biosource IntBiosource Int公司开发公司开发的一种水溶性染料，其用途与的一种水溶性染料，其用途与
30、CCK-8CCK-8试剂相似。试剂相似。五、磺基罗丹明五、磺基罗丹明B法法基本原理基本原理磺基罗丹明磺基罗丹明B(sulforhodamine BB(sulforhodamine B，SRB)SRB)是一种粉红是一种粉红色蛋白质结合染料色蛋白质结合染料, , 含二个磺基含二个磺基, , 可溶于水。在酸性可溶于水。在酸性环境下环境下, SRB, SRB能与三氯醋酸能与三氯醋酸(TCA)(TCA)固定后细胞内大分子固定后细胞内大分子中的碱性氨基酸结合中的碱性氨基酸结合, ,被结合的染料的量在一定范围内被结合的染料的量在一定范围内与活细胞中蛋白质的量成正比与活细胞中蛋白质的量成正比, , 而蛋白质的
31、量与细胞而蛋白质的量与细胞的数量成正比。因此的数量成正比。因此, , 可根据染色强度推测活细胞数。可根据染色强度推测活细胞数。MTTMTT法的一个缺点是法的一个缺点是A A值可随放置时间而改变值可随放置时间而改变, , 而而SRBSRB法无此现象法无此现象, , 因此因此, , 更适用于进行大规模试验。更适用于进行大规模试验。 操作步骤操作步骤 1. 1.用用9696孔培养板进行操作。细胞接种、培养、加药及孔培养板进行操作。细胞接种、培养、加药及药物作用时间等均同药物作用时间等均同MTTMTT法，空白对照组只加入完全培养法，空白对照组只加入完全培养液，不加细胞。液，不加细胞。 2. 2.受试药
32、物处理细胞受试药物处理细胞48 h48 h后，不除去培养液，后，不除去培养液，9696孔板孔板每孔加入预冷的每孔加入预冷的50% TCA50% TCA液液50l(50l(终浓度为终浓度为10%)10%)固定。悬固定。悬浮培养细胞则加入浮培养细胞则加入80%TCA80%TCA液液50l(50l(终浓度为终浓度为16%)16%)。 加入加入TCATCA时必须轻轻地加在培养液的表面，静止时必须轻轻地加在培养液的表面，静止5min5min后再将培养板移至后再将培养板移至44放置放置1h1h，使细胞固定在培养板的，使细胞固定在培养板的孔底。孔底。 同时在加药的即刻将部分接种的细胞用同时在加药的即刻将部分
33、接种的细胞用TCATCA固定，测固定，测定此时细胞的定此时细胞的A A值（值（T T0 0）。）。 3.3.弃固定液弃固定液, , 用去离子水洗用去离子水洗5 5次，甩干次，甩干, , 空气干燥空气干燥. . 4.4.用用1%1%醋醋酸酸配配制制0.4% 0.4% SRBSRB溶溶液液。每每孔孔加加入入100l, 100l, 室室温温染染色色30min. 30min. 然然后后用用1%1%醋醋酸酸洗洗5 5次次, , 洗洗去去未未与与蛋蛋白白结结合合的的SRB,SRB,干燥。干燥。3.3.吸弃含吸弃含TCATCA的培养液，用去离子水洗板的培养液，用去离子水洗板5 5次，甩干，次，甩干，空气干燥
34、至无湿迹。空气干燥至无湿迹。 4. 4.用用1%1%醋酸配制醋酸配制0.4% SRB0.4% SRB溶液。每孔加入溶液。每孔加入SRBSRB液液100l100l，室温染色，室温染色151530 min30 min。然后用。然后用1%1%醋酸洗涤醋酸洗涤5 5次，次，洗去未与蛋白结合的洗去未与蛋白结合的SRBSRB，空气干燥。，空气干燥。 5.5.每孔加入每孔加入10 mmol/L Tris10 mmol/L Tris液（液（pH 10.5pH 10.5）150l150l。用微型振荡器振荡使用微型振荡器振荡使SRBSRB完全溶解。完全溶解。 6. 6.用酶标仪在用酶标仪在490490或或540n
35、m540nm波长测定实验对照组波长测定实验对照组A A值及值及加药组加药组A A值，测定时用空白对照孔调零。值，测定时用空白对照孔调零。 结果评定结果评定 1. 1.可按可按MTTMTT法的计算公式法的计算公式，计算药物对肿瘤细胞的，计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率。生长抑制率。 2. 2.规定对照组的规定对照组的A A值为值为C, C, 加药组的加药组的A A值为值为T, T, 药物作药物作用用0 0时的时的A A值为值为T T0 0, , 即刚刚加药即刚刚加药, , 药物尚未发挥作用时药物尚未发挥作用时的的A A值。如果值。如果TTTT0 0, , 说明肿瘤细胞在加药后仍然生长：说明肿瘤细胞
36、在加药后仍然生长：(TT0)生长率生长率(%)100%(CT0)例如：T=2.0,T0=0.4,C=6.0(TT0)(2.00.4)1.6生长率生长率(%)100=100=28.6%(6.00.4)5.6如果如果TT0,说明加药后细胞被杀伤：说明加药后细胞被杀伤：(TT0)杀伤率杀伤率(%)=100T0(0.40.8)杀伤率杀伤率(%)=100=50%0.8 注意事项注意事项 1.1.空空白白A A值值的的高高低低与与TCATCA的的固固定定时时间间、培培养养液液的的血血清清浓浓度有关度有关, , 固定时间越长固定时间越长, , 血清浓度越高血清浓度越高, , 空白空白A A值越大。值越大。2
37、.2.对对于于大大多多数数细细胞胞而而言言, , 用用490490530nm530nm波波长长测测定定A A值值, , 效果均可。效果均可。目前可应用目前可应用MTT法的法的公式公式，直接计算瘤细胞生长抑，直接计算瘤细胞生长抑制率制率3.3.本本法法用用TCATCA固固定定细细胞胞后后, ,可可随随时时用用SRBSRB作作蛋蛋白白含含量量测测定定, ,不不受受测测定定时时间间影影响响。SRBSRB用用TrisTris溶溶解解后后也也可可稳稳定定一一个个较长的时期。较长的时期。 4.A 4.A与与SRBSRB浓度作图时，在浓度作图时，在A A单位单位1.51.52.02.0之间为线性之间为线性,
38、 , 当超出线性范围时当超出线性范围时, , 必须稀释后重新测定。必须稀释后重新测定。六、克隆形成试验六、克隆形成试验克克隆隆形形成成试试验验（clony-formation clony-formation testtest，也也称称集集落落形形成成试试验验）是是评评价价抗抗肿肿瘤瘤药药物物作作用用的的简简便便、可可靠靠的的体体外外方方法，目前较为常用。法，目前较为常用。 基本原理基本原理 克隆克隆(clone)(clone)是指一个细胞在特定条件下培养增殖是指一个细胞在特定条件下培养增殖而产生的而产生的细胞群细胞群. . 单个细胞能连续分裂单个细胞能连续分裂6 6代或以上时代或以上时, ,
39、其后代所组成的群体即集落其后代所组成的群体即集落, , 凡一个集落超过凡一个集落超过5050个细个细胞者即为胞者即为一个克隆一个克隆, , 大小在大小在0.30.31.0mm, 1.0mm, 能形成克隆的能形成克隆的细胞称克隆原细胞细胞称克隆原细胞( (干细胞干细胞) )。肿瘤细胞的生长、转移、。肿瘤细胞的生长、转移、复发均以干细胞的增殖为基础。复发均以干细胞的增殖为基础。 当接种的细胞分布较稀疏时，每个克隆彼此不接当接种的细胞分布较稀疏时，每个克隆彼此不接触，通过克隆计数，可对单个细胞的增殖能力进行定触，通过克隆计数，可对单个细胞的增殖能力进行定量分析，故能较灵敏地检测药物的抗肿瘤活性。量分
40、析，故能较灵敏地检测药物的抗肿瘤活性。 克隆形成试验可分为两种克隆形成试验可分为两种: : 平板克隆形成试验平板克隆形成试验 软琼脂克隆形成试验软琼脂克隆形成试验( (一一) )平板克隆形成试验平板克隆形成试验 是指在培养皿上观察克隆形成，该法适合于贴附生是指在培养皿上观察克隆形成，该法适合于贴附生长的培养细胞，如口腔癌长的培养细胞，如口腔癌KBKB、B16B16等。等。 操作步骤操作步骤 1 1取生长良好的贴附生长细胞取生长良好的贴附生长细胞1 1瓶，瓶口过火后弃瓶，瓶口过火后弃去培养液，用去培养液，用PBSPBS洗洗1 1次。次。 2 2用胰蛋白酶消化用胰蛋白酶消化5min5min左右，在
41、显微镜下观察细左右，在显微镜下观察细胞呈球状时，加入含胞呈球状时，加入含10%10%小牛血清的培养液。小牛血清的培养液。 3 31000r/min1000r/min离心离心10min10min后收集细胞，用含后收集细胞，用含10%10%小牛小牛血清的培养液制成单细胞悬液，并调节至每血清的培养液制成单细胞悬液，并调节至每1ml1ml含含6060个个细胞。细胞。 4 4取取5ml5ml单细胞悬液注入直径单细胞悬液注入直径60mm60mm塑料培养皿中，塑料培养皿中，每皿含每皿含300300个细胞。以个细胞。以“十十”字方向轻轻晃动培养皿，字方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散铺满培养皿后，将培养皿置于
42、使细胞均匀分散铺满培养皿后，将培养皿置于5%CO5%CO2 2培培养箱养箱3737过夜。过夜。5 5在倒置显微镜下观察细胞贴附和分布情况，若贴在倒置显微镜下观察细胞贴附和分布情况，若贴附良好，分布均匀，弃去培养液即可加入附良好，分布均匀，弃去培养液即可加入5 5个以上不同浓个以上不同浓度的受试药度的受试药( (一般用含一般用含10%10%小牛血清的培养液配制小牛血清的培养液配制) )，每个，每个浓度至少浓度至少3 3皿，受试药与细胞作用一定时间皿，受试药与细胞作用一定时间(2(224h24h或更长或更长) )后，弃去含药培养液。后，弃去含药培养液。 6 6用新配制的培养液漂洗用新配制的培养液漂
43、洗3 3次后，加入无药含血清培次后，加入无药含血清培养液，静止培养至养液，静止培养至101012d,12d,即可进行克隆计数。即可进行克隆计数。7 7计计数数前前弃弃去去培培养养液液，用用PBSPBS洗洗涤涤l l2 2次次，加加入入新新配配制制的的甲甲醇醇- -冰冰醋醋酸酸液液(3/l)3(3/l)35ml5ml固固定定10min10min，弃弃去去固固定定液液。待待稍稍干干燥燥后后加加入入10%Giemsa10%Giemsa染染色色液液染染色色约约20min20min，当当克克隆隆明明显显着着色色时时，用用水水洗洗去去染染色色液液。以以含含5050个个细细胞胞以以上上的的细细胞胞团团作作为
44、一个克隆，在为一个克隆，在2020倍解剖显微镜下进行克隆计数。倍解剖显微镜下进行克隆计数。 结果评定结果评定 按下述公式计算克隆形成率和克隆形成抑制率：按下述公式计算克隆形成率和克隆形成抑制率： 克隆数克隆数克隆形成率（克隆形成率（%） 100% 接种接种细胞数胞数 加加药组平均克隆数平均克隆数克隆形成抑制率（克隆形成抑制率（%）（）（1 ）100% 实验对照照组平均克隆数平均克隆数 一一般般以以克克隆隆形形成成抑抑制制率率与与剂剂量量的的对对数数作作图图, , 得得出出一一条条S S形形曲曲线线即即剂剂量量反反应应曲曲线线, , 并并求求出出药药物物的的半半数数抑抑制制浓浓度度(IC(IC5
45、050),),受试药的受试药的 IC IC5050小于小于10g/ml10g/ml时值得进一步试验时值得进一步试验. . 注意事项注意事项 1.1.细细胞胞悬悬液液中中的的细细胞胞应应充充分分分分散散, ,单单个个细细胞胞至至少少在在90%90%以上以上, ,否则试验误差大。否则试验误差大。 2. 2.在培养早期不要晃动培养皿。在培养早期不要晃动培养皿。 3.3.实实验验对对照照组组（不不加加药药物物仅仅加加生生理理盐盐水水）的的克克隆隆形形成率应在成率应在40%40%60%60%。 4.4.若若待待试试药药为为中中药药粗粗制制剂剂, , 如如水水煎煎剂剂, ,醇醇提提液液, , 应应用用含药
46、血清。含药血清。 ( (二二) )软琼脂克隆形成试验软琼脂克隆形成试验悬浮生长的细胞必须在软琼脂培养基内增殖才能形悬浮生长的细胞必须在软琼脂培养基内增殖才能形成克隆。当然成克隆。当然, , 很多贴壁生长的细胞也能在软琼脂中形很多贴壁生长的细胞也能在软琼脂中形成克隆。本方法适用于成克隆。本方法适用于L1210L1210、HL-60HL-60、B16B16、KBKB细胞。细胞。 软琼脂克隆形成法通常在塑料培养皿中进行，由两层软琼脂克隆形成法通常在塑料培养皿中进行，由两层琼脂构成：琼脂构成： 上层上层为接种层，含细胞，琼脂浓度为为接种层，含细胞，琼脂浓度为0.3%0.3%0.4%0.4% 下层下层为
47、铺底层，琼脂浓度为为铺底层，琼脂浓度为0.5%0.5%1.0%1.0% 上层软琼脂可使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支上层软琼脂可使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑可防止细胞贴附生长。撑可防止细胞贴附生长。 细胞增殖形成的克隆形态有块状、盘状和蘑菇状等。细胞增殖形成的克隆形态有块状、盘状和蘑菇状等。操作步骤操作步骤1.1.将将5g5g精制琼脂精制琼脂(special agar)(special agar)加到盛有加到盛有100ml100ml双蒸双蒸水的瓶内，瓶内壁不要粘挂琼脂颗粒，水的瓶内，瓶内壁不要粘挂琼脂颗粒，68kPa(115)68kPa(115)高高压灭菌压灭菌15min15min。
48、趁热取出后振荡均匀，置。趁热取出后振荡均匀，置5050水浴中降水浴中降温，降至温，降至5050时备用。时备用。 2. 2.取对数生长期细胞取对数生长期细胞1 1瓶，进行活细胞计数，用含瓶，进行活细胞计数，用含15%15%小牛血清小牛血清RPMI 1640RPMI 1640培养液配成每毫升含培养液配成每毫升含10001000个细个细胞的悬液，置胞的悬液，置3737预温。根据实验要求可作稀释。预温。根据实验要求可作稀释。3.3.取取35 mm35 mm培养皿若干，培养皿若干，3 3个为一组，加药组各加入不个为一组，加药组各加入不同浓度的受试药物（同浓度的受试药物（20l/20l/皿），实验对照组加
49、入等体皿），实验对照组加入等体积的相应溶剂。药物作用一定时间后，弃去含药培养液。积的相应溶剂。药物作用一定时间后，弃去含药培养液。 4. 4.铺底层琼脂铺底层琼脂 取在操作方法取在操作方法1 1中制备的中制备的5%5%琼脂液琼脂液1 1份，迅速加到份，迅速加到9 9份份3737含含15%15%小牛血清的新鲜小牛血清的新鲜RPMI 1640RPMI 1640培养液中培养液中(0.5%(0.5%琼脂琼脂) )，摇匀后立即加入平皿中，每皿，摇匀后立即加入平皿中，每皿1 1 mlml，室温水平放置使琼脂充分凝固。，室温水平放置使琼脂充分凝固。 5. 5.铺上层琼脂铺上层琼脂 取预温取预温3737的细胞
50、悬液的细胞悬液9.4ml9.4ml，移入，移入小烧杯中，加入小烧杯中，加入5050的的5%5%琼脂琼脂0.6ml(0.3%0.6ml(0.3%琼脂细胞琼脂细胞) )，迅速混匀，加到底层琼脂的上面，每皿迅速混匀，加到底层琼脂的上面，每皿1ml1ml，室温水平静，室温水平静置使软琼脂凝固。置使软琼脂凝固。 6. 6.将平皿置于密闭的盒中，放入将平皿置于密闭的盒中，放入5%CO5%CO2 2培养箱培养箱3737培培养养7 710d10d。 7. 7.在在1616倍解剖镜下计数直径大于倍解剖镜下计数直径大于75m(5075m(50个细胞以上个细胞以上) )的克隆。的克隆。 8. 8.按平板克隆形成法的
51、公式计算克隆形成抑制率，判按平板克隆形成法的公式计算克隆形成抑制率，判断受试药物对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用。断受试药物对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用。 软软琼琼脂脂克克隆隆形形成成 结果评定结果评定 1.1.按平板克隆形成试验的公式计算克隆形成抑制率，按平板克隆形成试验的公式计算克隆形成抑制率，以克隆形成抑制率对受试药物剂量的对数作图，可得以克隆形成抑制率对受试药物剂量的对数作图，可得到一条到一条S S形曲线，从中可求出受试药物的半数抑制浓度形曲线，从中可求出受试药物的半数抑制浓度ICIC5050。 2. 2.当受试药的当受试药的ICIC505010g/ml(10g/ml(或或1010-5-5
52、mol/L)mol/L)时，表时，表示该受试药值得进一步研究。示该受试药值得进一步研究。 七、染料拒染试验法七、染料拒染试验法 基本原理基本原理 活细胞有排斥某些染料如台盼蓝、伊红、苯胺黑等的能活细胞有排斥某些染料如台盼蓝、伊红、苯胺黑等的能力力, , 而死亡的细胞由于膜完整性破坏而死亡的细胞由于膜完整性破坏, , 可被着色可被着色。 操作步骤操作步骤 1 1选用对数生长期的肿瘤细胞，用含选用对数生长期的肿瘤细胞，用含10%10%小牛血清的小牛血清的RPMI 1640RPMI 1640培养液配成培养液配成5105104 4个细胞个细胞/ml/ml的悬液，分装在的悬液，分装在培养瓶中，加药组加入
53、不同浓度的受试药，实验对照组培养瓶中，加药组加入不同浓度的受试药，实验对照组加入等体积溶解受试药的溶剂，在含加入等体积溶解受试药的溶剂，在含5%CO5%CO2 2的的3737培养培养箱中培养箱中培养3 34d4d。 2.2.取细胞悬液取细胞悬液 ( (贴壁细胞先用胰蛋白酶消化贴壁细胞先用胰蛋白酶消化) 0.4ml, ) 0.4ml, 加入加入0.4%0.4%台酚蓝液台酚蓝液0.1ml, 0.1ml, 在室温作用在室温作用5min, 5min, 在在15min15min内用内用血细胞计数板计数血细胞计数板计数200200个细胞。个细胞。 未染色的是活细胞未染色的是活细胞, , 染蓝色是死细胞。染
54、蓝色是死细胞。 分别计数染色细胞数和未染色细胞数，求出细胞存活分别计数染色细胞数和未染色细胞数，求出细胞存活率。率。 未染色细胞数未染色细胞数 细胞存活率（细胞存活率（%） 100% 细胞总数细胞总数 结果评定结果评定 1. 1.实验对照组为未经任何处理的培养细胞，细胞存实验对照组为未经任何处理的培养细胞，细胞存活率应在活率应在95%95%以上。在观察药物对肿瘤细胞作用时，可以上。在观察药物对肿瘤细胞作用时，可对加药组和实验对照组分别计数活细胞数，求得每毫升对加药组和实验对照组分别计数活细胞数，求得每毫升细胞数，再用下列公式求出细胞生长抑制率。细胞数，再用下列公式求出细胞生长抑制率。 实验对照
55、组活细胞数加药组活细胞数实验对照组活细胞数加药组活细胞数细胞生长抑制率（细胞生长抑制率（%） 100% 实验对照组活细胞数实验对照组活细胞数2.2.以细胞存活率对药物浓度的对数作图，可得一条以细胞存活率对药物浓度的对数作图，可得一条S S形剂量反应曲线，从中求出半数杀伤浓度（形剂量反应曲线，从中求出半数杀伤浓度（LCLC5050），当），当LCLC505010g/ml10g/ml并能重复时，应做进一步研究。并能重复时，应做进一步研究。 注意事项注意事项 1 1由于下列原因，可能低估药物抑制肿瘤细胞生长的由于下列原因，可能低估药物抑制肿瘤细胞生长的作用：作用： 受致死损伤的细胞，细胞膜完整性的破
56、坏可以在药受致死损伤的细胞，细胞膜完整性的破坏可以在药物作用后物作用后3 34d4d后才表现出来，在此期间存活细胞可能继续后才表现出来，在此期间存活细胞可能继续增殖，使活细胞数增多；增殖，使活细胞数增多； 某些受致死损伤的细胞可能过早地崩解，细胞计数某些受致死损伤的细胞可能过早地崩解，细胞计数时已不存在，使着色细胞比例下降。因此，这一方法不时已不存在，使着色细胞比例下降。因此，这一方法不太适合于仅抑制细胞分裂或使细胞增殖死亡的药物，比太适合于仅抑制细胞分裂或使细胞增殖死亡的药物，比较适合于可使细胞间期死亡的药物。较适合于可使细胞间期死亡的药物。 2. 2.细胞悬液与台盼蓝染色液混匀后，应在细胞
57、悬液与台盼蓝染色液混匀后，应在15min15min内计内计数完毕，时间过长，会引起细胞膜通透性增加，影响结数完毕，时间过长，会引起细胞膜通透性增加，影响结果。果。 八、细胞生长曲线法八、细胞生长曲线法 基本原理基本原理 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数（取细胞数的对数（Y Y轴）对培养时间（轴）对培养时间（X X轴）作图，可得一轴）作图，可得一条斜率向上的直线。但随着培养时间的延长，细胞密度不条斜率向上的直线。但随着培养时间的延长，细胞密度不断增加，由于代谢产物的堆积及营养物质的消耗，细胞生断增加，由于代谢产物的堆积及营
58、养物质的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，生长曲线的斜率逐渐变平，进入平长逐渐减慢以致停止，生长曲线的斜率逐渐变平，进入平台期。因此，药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映台期。因此，药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。出来。 操作方法操作方法 以悬浮生长细胞为例。以悬浮生长细胞为例。 1. 1.选用对数生长期的肿瘤细胞，用含选用对数生长期的肿瘤细胞，用含10%10%小牛血清的小牛血清的RPMI 1640RPMI 1640培养液配成培养液配成1101104 4个细胞个细胞/ml/ml的悬液，在的悬液，在25ml25ml培养瓶中接种培养瓶中接种5ml5ml。加药组加入不同浓度的受试药物。加
59、药组加入不同浓度的受试药物50 50 ll，实验对照组加入等体积溶剂。，实验对照组加入等体积溶剂。 2. 2.细胞置细胞置3737、5%CO25%CO2培养箱中培养，在培养后即刻及培养箱中培养，在培养后即刻及1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6和和7d7d分别取样分别取样40l40l，加，加0.4%0.4%台盼蓝染台盼蓝染色液色液10l10l，用血细胞计数板计数。以每毫升活细胞数的，用血细胞计数板计数。以每毫升活细胞数的对数对培养时间作图，可得出生长曲线。对数对培养时间作图，可得出生长曲线。 结果评定结果评定 1. 1.药物对细胞的杀伤率药物对细胞的杀伤率 将实验对照组及加药组生将实
60、验对照组及加药组生长曲线的线性部分延伸至长曲线的线性部分延伸至Y Y轴，可分别得到截距轴，可分别得到截距NoNo和和NoNo，它们代表接种后具有增殖能力的细胞数，按下述公式，它们代表接种后具有增殖能力的细胞数，按下述公式计算药物对增殖细胞的杀伤率。计算药物对增殖细胞的杀伤率。 NoNo药物对增殖细胞的杀伤率（药物对增殖细胞的杀伤率（%）=100%No 2. 2.药物对细胞倍增时间（药物对细胞倍增时间（T TD D）的影响）的影响 细胞倍增时间细胞倍增时间是指细胞数增加是指细胞数增加1 1倍所需的培养时间。以倍所需的培养时间。以t t代表培养时间，代表培养时间，NoNo和和NtNt分别代表接种细
61、胞后和培养分别代表接种细胞后和培养t t小时后的细胞数。小时后的细胞数。按下述细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如倍增时按下述细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如倍增时间延长表明药物抑制了细胞增殖，即增殖能力减弱。间延长表明药物抑制了细胞增殖，即增殖能力减弱。 0.301tTDlgNtlgNo第七节第七节肿瘤侵袭与转移的研究方法肿瘤侵袭与转移的研究方法 肿瘤细胞具有多种生物学特性，其中侵袭和转移是肿瘤细胞具有多种生物学特性，其中侵袭和转移是最重要的特性之一，也是恶性肿瘤的重要标志。最重要的特性之一，也是恶性肿瘤的重要标志。肿瘤肿瘤侵袭侵袭(invasion)(invasion)是指恶性肿瘤细胞
62、突破基膜和细胞外是指恶性肿瘤细胞突破基膜和细胞外基质基质(ECM)(ECM)构成的构成的组织学屏障组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续繁殖生长的过程。侵袭是贯穿肿瘤转移并在该处继续繁殖生长的过程。侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤，瘤细胞穿入、穿出血管或淋巴管全过程的重要步骤，瘤细胞穿入、穿出血管或淋巴管和侵入靶器官都是侵袭行为的具体表现。和侵入靶器官都是侵袭行为的具体表现。 肿瘤侵袭是一系列多步骤的复杂过程，可分为四个肿瘤侵袭是一系列多步骤的复杂过程，可分为四个步骤：步骤： 肿瘤细胞彼此间的粘附力减低，使细胞彼此分散；肿瘤细胞彼此间的粘附力减低，使细胞彼此分散
63、； 肿瘤细胞通过细胞膜表面粘附分子受体与基膜、肿瘤细胞通过细胞膜表面粘附分子受体与基膜、ECMECM成分的层粘蛋白、纤连蛋白及胶原蛋白等结合；成分的层粘蛋白、纤连蛋白及胶原蛋白等结合；细胞间粘附力减低细胞间粘附力减低粘附分子受体与粘附分子受体与ECM成分结合成分结合 肿瘤细胞分泌和活化蛋白水解酶前体，蛋白水解酶降肿瘤细胞分泌和活化蛋白水解酶前体，蛋白水解酶降解由细胞间基质和基膜组成的解由细胞间基质和基膜组成的ECMECM，主要是降解构成基膜的，主要是降解构成基膜的主要成分主要成分型胶原；型胶原； 肿瘤细胞穿过破损的基膜和基质，借助于自身的阿米肿瘤细胞穿过破损的基膜和基质，借助于自身的阿米巴运动
64、而游出，迁移到其周围，发生侵袭性生长。巴运动而游出，迁移到其周围，发生侵袭性生长。 上述步骤反复进行，肿瘤逐渐向深层及周围侵袭。上述步骤反复进行，肿瘤逐渐向深层及周围侵袭。蛋白酶降解蛋白酶降解ECM肿瘤细胞穿过破损基膜和基质肿瘤细胞穿过破损基膜和基质 肿瘤转移肿瘤转移(metastasis)(metastasis)即恶性肿瘤细胞借助血道、淋即恶性肿瘤细胞借助血道、淋巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位形成继发瘤的过程。巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位形成继发瘤的过程。 肿瘤转移始于恶性侵袭，转移是连续多步骤的过程，肿瘤转移始于恶性侵袭，转移是连续多步骤的过程，主要有：主要有： 原发瘤增殖，肿瘤
65、新血管生成；原发瘤增殖，肿瘤新血管生成； 肿瘤细胞侵袭毗邻的肿瘤细胞侵袭毗邻的基膜基膜、基质和正常细胞；、基质和正常细胞； 瘤细胞瘤细胞穿入血管穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活；或淋巴管并在循环系统中存活； 瘤细胞栓塞、滞留于远处靶器官的微血管中并增殖；瘤细胞栓塞、滞留于远处靶器官的微血管中并增殖； 瘤细胞瘤细胞穿出血管穿出血管，在靶器官内形成微转移灶；，在靶器官内形成微转移灶； 肿瘤间质内新血管生成，转移瘤快速生长。肿瘤间质内新血管生成，转移瘤快速生长。 可见，在转移过程中肿瘤细胞需穿过可见，在转移过程中肿瘤细胞需穿过三个基膜屏障三个基膜屏障而形而形成转移灶。成转移灶。 恶性肿瘤侵袭与血行
66、转移恶性肿瘤侵袭与血行转移 侵袭和转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。侵袭和转侵袭和转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。侵袭和转移的关系密切，高侵袭性肿瘤通常具有高转移能力。就大移的关系密切，高侵袭性肿瘤通常具有高转移能力。就大多数恶性肿瘤而言，侵袭和转移是一个过程的两个阶段，多数恶性肿瘤而言，侵袭和转移是一个过程的两个阶段，即侵袭是转移的前奏和基础，转移是侵袭的结果。即侵袭是转移的前奏和基础，转移是侵袭的结果。 侵袭和转移是恶性肿瘤威胁人类健康与生命的主要原侵袭和转移是恶性肿瘤威胁人类健康与生命的主要原因，防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤死亡率的重要途径因，防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤死亡率的重要途
67、径之一。之一。一、肿瘤侵袭的常用体内模型一、肿瘤侵袭的常用体内模型 ( (一一) )小鼠子宫颈癌小鼠子宫颈癌U14U14肾侵袭模型肾侵袭模型 现多以昆明小鼠为宿主。小鼠子宫颈癌现多以昆明小鼠为宿主。小鼠子宫颈癌U14U14为实体型，为实体型，具有血液和淋巴系统双重转移特点，淋巴转移率具有血液和淋巴系统双重转移特点，淋巴转移率90%90%，并可发生肺转移，但自发转移率不高。并可发生肺转移，但自发转移率不高。 造模原理造模原理 肾包膜是缺乏免疫监视的部位，局部血供丰富。将肾包膜是缺乏免疫监视的部位，局部血供丰富。将U14U14瘤块接种于近交系瘤块接种于近交系615615小鼠的肾包膜下，肿瘤生长并向
68、肾小鼠的肾包膜下，肿瘤生长并向肾实质内侵袭。实质内侵袭。 对荷瘤肾脏进行组织病理学观察，并用半定量分级方对荷瘤肾脏进行组织病理学观察，并用半定量分级方法判断肿瘤侵袭到肾实质的程度。该模型可用于癌细胞侵法判断肿瘤侵袭到肾实质的程度。该模型可用于癌细胞侵袭能力的检测和抗肿瘤侵袭药物的筛选。袭能力的检测和抗肿瘤侵袭药物的筛选。 操作方法操作方法 1. 1.将将U14U14瘤细胞接种于近交系瘤细胞接种于近交系615615小鼠背部皮下，成瘤小鼠背部皮下，成瘤后，在无菌条件下剥离瘤块。后，在无菌条件下剥离瘤块。 2. 2.去除瘤块的坏死部分，剪成去除瘤块的坏死部分，剪成1mm1mm直径的小块，直径的小块，
69、PBSPBS冲冲洗洗5 5次，置冰浴上备用。次，置冰浴上备用。 3. 3.用用2%2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉戊巴比妥钠腹腔注射麻醉615615小鼠。小鼠。 4. 4.将小鼠右侧背部皮肤消毒，在右侧脊肋角处切开皮将小鼠右侧背部皮肤消毒，在右侧脊肋角处切开皮肤长肤长1cm1cm，分离组织暴露右肾。用无钩镊子夹持右肾。用，分离组织暴露右肾。用无钩镊子夹持右肾。用套管针或穿刺针吸取制备好的小瘤块，穿刺把瘤块移植于套管针或穿刺针吸取制备好的小瘤块，穿刺把瘤块移植于肾外侧中线处的包膜下。将肾复位，缝合切口。肾外侧中线处的包膜下。将肾复位，缝合切口。 5 5继续喂养继续喂养10d10d后，颈椎脱臼法处死小鼠
70、，取出右肾。后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出右肾。 6. 6.称小鼠体重、右肾重。称小鼠体重、右肾重。 7. 7.解剖显微镜下测量右肾内肿瘤的最长径解剖显微镜下测量右肾内肿瘤的最长径(a)(a)和最短径和最短径(b)(b)。按公式计算肿瘤体积。按公式计算肿瘤体积(V)(V)，V Vabab2 2/2/2。 8. 8.甲醛液固定右肾，制备组织切片后光学显微镜观察。甲醛液固定右肾，制备组织切片后光学显微镜观察。 9. 9.利用计算机图像分析系统可测量肿瘤的总面积、侵袭利用计算机图像分析系统可测量肿瘤的总面积、侵袭到肾实质的肿瘤面积及两者的比值。到肾实质的肿瘤面积及两者的比值。 10 10肿瘤肾实质侵袭
71、程度组织学分级参考标准肿瘤肾实质侵袭程度组织学分级参考标准, ,进行进行侵袭程度的侵袭程度的半定量（判断标准略）。半定量（判断标准略）。 模型评价模型评价 1. 1.肾皮质区血管床丰富，可为瘤细胞的成活、生长和肾皮质区血管床丰富，可为瘤细胞的成活、生长和侵袭提供充足的血液供应。侵袭提供充足的血液供应。 2. 2.肾包膜透明，且移植于肾包膜下的瘤组织局限于一肾包膜透明，且移植于肾包膜下的瘤组织局限于一定位置，便于测量其大小和形态学观察。定位置，便于测量其大小和形态学观察。 3. 3.肾组织结构分明，层次清楚，容易与瘤组织相区别，肾组织结构分明，层次清楚，容易与瘤组织相区别，便于侵袭过程的形态学观
72、察。便于侵袭过程的形态学观察。 注意事项注意事项 1. 1. 无菌操作。无菌操作。 2. 2.手术后小鼠必需保暖，直至苏醒，否则极易死亡。手术后小鼠必需保暖，直至苏醒，否则极易死亡。 3. 3.穿刺肾包膜时，需小心操作，以免包膜破裂。穿刺肾包膜时，需小心操作，以免包膜破裂。 4. 4.组织切片如未切到最大的侵袭部位时，可产生较大组织切片如未切到最大的侵袭部位时，可产生较大误差，连续切片观察可以减少误差。误差，连续切片观察可以减少误差。 ( (二二)W256)W256癌肉瘤骨侵袭模型癌肉瘤骨侵袭模型 ( (三三) )肿瘤细胞侵袭的其他常用体内模型肿瘤细胞侵袭的其他常用体内模型 主要有皮下移植、肌
73、肉移植、腹腔内移植、睾丸包主要有皮下移植、肌肉移植、腹腔内移植、睾丸包膜下移植、耳廓皮下移植、爪垫皮下移植、视网内界膜下移植、耳廓皮下移植、爪垫皮下移植、视网内界膜侵袭模型等。膜侵袭模型等。 二、肿瘤侵袭的常用体外研究方法二、肿瘤侵袭的常用体外研究方法 ( (一一) )重组基膜侵袭实验重组基膜侵袭实验 基本原理基本原理 重组基膜侵袭实验又称重组基膜侵袭实验又称BoydenBoyden小室肿瘤侵袭实验。小室肿瘤侵袭实验。基膜是限制肿瘤细胞侵袭生长的组织屏障。肿瘤细胞基膜是限制肿瘤细胞侵袭生长的组织屏障。肿瘤细胞侵袭时，首先通过膜表面受体与基膜成分粘附，然后侵袭时，首先通过膜表面受体与基膜成分粘附
74、，然后释放和激活多种蛋白酶降解基膜，继而穿越基膜的缺释放和激活多种蛋白酶降解基膜，继而穿越基膜的缺损部位。突破基膜屏障是肿瘤侵袭至周围正常组织的损部位。突破基膜屏障是肿瘤侵袭至周围正常组织的启始步骤和关键环节。启始步骤和关键环节。 Matrigel Matrigel（基质胶）是从（基质胶）是从EHSEHS鼠肉瘤中提取的基质成分，鼠肉瘤中提取的基质成分，含有层粘蛋白、含有层粘蛋白、型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。将型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。将其铺在无聚乙烯吡咯烷酮的其铺在无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯聚碳酸酯(PVPF(PVPF，孔径，孔径8 m)8 m)多多孔滤膜上，能在培养基中重组形成与天
75、然基膜极为相似的孔滤膜上，能在培养基中重组形成与天然基膜极为相似的人工基膜结构。人工基膜结构。Boyden小室小室上室上室下室BoydenBoyden小室分为上室和下室，小室分为上室和下室，两室以两室以MatrigelMatrigel隔开。隔开。上室上室-肿瘤细胞，肿瘤细胞，下室下室-趋化因子趋化因子. .Matrigel聚碳酸酯膜 当肿瘤细胞分泌的蛋白酶降解了当肿瘤细胞分泌的蛋白酶降解了MatrigelMatrigel后，细后，细胞运动到膜的下室面。通过计数膜下室面上的细胞胞运动到膜的下室面。通过计数膜下室面上的细胞数可定量地反映肿瘤细胞在体外的侵袭能力。数可定量地反映肿瘤细胞在体外的侵袭能
76、力。 本方法操作简单、快速，可以定量检测肿瘤本方法操作简单、快速，可以定量检测肿瘤细胞的侵袭能力，与动物体内侵袭模型具有良细胞的侵袭能力，与动物体内侵袭模型具有良好的相关性，近年应用较多。好的相关性，近年应用较多。 BoydenBoyden小室肿瘤侵袭实验小室肿瘤侵袭实验 1. 1.条件培养液的制备条件培养液的制备 NIH 3T3 NIH 3T3细胞用含细胞用含10%10%小牛血清小牛血清的高糖的高糖DMEMDMEM培养液培养，当细胞铺满瓶底时培养液培养，当细胞铺满瓶底时( (约约1101107 7个细个细胞胞) )，弃培养液，用无血清培养液洗，弃培养液，用无血清培养液洗2 23 3次，然后加
77、入次，然后加入1.5ml1.5ml无血清培养液，无血清培养液，3737、5% CO5% CO2 2培养箱培养培养箱培养24h24h。收集。收集上清液，即为含趋化因子的上清液，即为含趋化因子的条件培养液条件培养液，作为趋化因子的，作为趋化因子的来源。过滤除菌，来源。过滤除菌，2020保存。保存。 2. 2.铺基质胶铺基质胶 使用前使用前1 1天将基质胶从天将基质胶从2020置于置于44融融化，并用无血清培养液按化，并用无血清培养液按1:31:3稀释，即稀释，即60l60l基质胶加入基质胶加入180l180l无血清培养液，混匀。将稀释的基质胶铺在已置于无血清培养液，混匀。将稀释的基质胶铺在已置于B
78、oydenBoyden小室上室的小室上室的PVPFPVPF滤膜上，分滤膜上，分2 2次铺放，每次间隔次铺放，每次间隔10 10 min(min(此操作均在冰上进行此操作均在冰上进行) )。然后将。然后将BoydenBoyden小室置于小室置于3737孵育孵育30 min30 min。 4. 4.取出制备好的取出制备好的BoydenBoyden小室，在小室，在2424孔培养板内加孔培养板内加入入NIH 3T3NIH 3T3细胞条件培养液细胞条件培养液200l200l，将，将BoydenBoyden小室置小室置于其内，向小室上室面加入于其内，向小室上室面加入100l100l肿瘤细胞悬液，于肿瘤细胞
79、悬液，于3737、5%CO5%CO2 2条件下孵育条件下孵育4 46 h6 h。 3. 3.收集细胞收集细胞 用用0.25%0.25%胰蛋白酶消化肿瘤细胞，用胰蛋白酶消化肿瘤细胞，用无血清培养液调节细胞浓度为无血清培养液调节细胞浓度为2102106 6个细胞个细胞/ml/ml。 5. 5.取出取出BoydenBoyden小室，弃去上室中的培养液，并用生理小室，弃去上室中的培养液，并用生理盐水棉签轻轻擦去滤膜上室面的细胞，盐水棉签轻轻擦去滤膜上室面的细胞，PBSPBS洗洗3 3次，醋酸次，醋酸- -酒精酒精- -甲醛固定液固定甲醛固定液固定20min20min，HEHE染色，中性树胶封片。染色，
80、中性树胶封片。 6. 6.侵袭细胞的计数侵袭细胞的计数 在在400400倍视野下任取倍视野下任取1010个不重复视个不重复视野，利用方格式目镜测微尺计数每个视野中膜下室面的肿野，利用方格式目镜测微尺计数每个视野中膜下室面的肿瘤细胞数目，计算平均值。瘤细胞数目，计算平均值。 膜下室面的肿瘤细胞膜下室面的肿瘤细胞未给抗肿瘤药物未给抗肿瘤药物给予抗肿瘤药物后给予抗肿瘤药物后 3. 3.使用时将使用时将基质胶基质胶放在冰上，铺胶时使用的器具需预冷。放在冰上，铺胶时使用的器具需预冷。 4. 4.因肿瘤细胞种类的不同，其穿过人工基膜的时间也不因肿瘤细胞种类的不同，其穿过人工基膜的时间也不相同，一般在相同，
81、一般在3737、5%CO5%CO2 2条件下孵育条件下孵育4 46 h6 h，穿过人工基，穿过人工基膜的细胞以每视野膜的细胞以每视野5050100100个为宜。个为宜。 注意事项注意事项 1.Boyden 1.Boyden小室为杯状器皿，形状不尽相同，名称不一，小室为杯状器皿，形状不尽相同，名称不一，但工作原理基本一致。但工作原理基本一致。 2. 2.基质胶在基质胶在2020以下为黄绿色固体以下为黄绿色固体, 44时是液体，在时是液体，在2222以上时可形成胶冻状物以上时可形成胶冻状物, 不可逆不可逆, , 用前用前44过夜可融化。过夜可融化。 ( (二二) )肿瘤细胞球体的侵袭实验肿瘤细胞球
82、体的侵袭实验（x）三、肿瘤转移的常用体内模型三、肿瘤转移的常用体内模型 ( (一一)B16-BL6)B16-BL6小鼠黑色素瘤自发转移模型小鼠黑色素瘤自发转移模型 造模原理造模原理 B16 B16细胞是细胞是19541954年在年在C57BL/6C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤细胞，移植后主要发生肺转移。的自发性黑色素瘤细胞，移植后主要发生肺转移。 B16-BL6 B16-BL6细胞来源于细胞来源于B16B16细胞，具有高度转移能力。细胞，具有高度转移能力。将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常组织
83、和血管，进入血循环，到达远处部位发生转移，称组织和血管，进入血循环，到达远处部位发生转移，称为为自发性转移自发性转移。此模型可反映瘤。此模型可反映瘤”细胞侵袭血行播散细胞侵袭血行播散侵袭侵袭”的完整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭和的完整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭和转移能力的影响。转移能力的影响。 操作方法操作方法 1. 1.瘤液制备瘤液制备 取对数生长期的取对数生长期的B16-BL6B16-BL6细胞，吸弃培细胞，吸弃培养液，用养液，用PBSPBS洗净，用洗净，用EDTAEDTA消化，加一定量培养液离心收消化，加一定量培养液离心收集细胞，重悬于集细胞，重悬于PBSPBS中，将细胞浓度调
84、整为中，将细胞浓度调整为1101107 7个个/ml/ml。 2. 2.肿瘤接种肿瘤接种 在每只在每只C57BL/6C57BL/6小鼠后肢爪垫皮下注射小鼠后肢爪垫皮下注射50l50l瘤液（含瘤液（含5105105 5个细胞）。个细胞）。 3. 3.分组与给药分组与给药 肿瘤接种次日将动物随机分组，设给肿瘤接种次日将动物随机分组，设给药组、阳性对照药组（环磷酰胺药组、阳性对照药组（环磷酰胺100mg/kg100mg/kg）及实验对照组，）及实验对照组，每组每组1010只小鼠，连续给药只小鼠，连续给药3 3周。周。 4. 4.切除原发灶切除原发灶 给药给药3 3周后（瘤体周后（瘤体10mm10mm
85、），称体重，），称体重，乙醚麻醉下结扎股动脉后，截除荷瘤小鼠的后肢。乙醚麻醉下结扎股动脉后，截除荷瘤小鼠的后肢。 5. 5.观察肺转移瘤灶观察肺转移瘤灶 停药停药1d1d后，继续连续给药后，继续连续给药3 3周。于周。于末次给药末次给药24h24h后，处死小鼠，解剖取肺，用后，处死小鼠，解剖取肺，用BouinBouin液固定，液固定，在在1010倍解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数。倍解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数。 黑色素瘤肺黑色素瘤肺转移移 ( (二二)Lewis)Lewis肺癌自发性肺转移模型肺癌自发性肺转移模型 Lewis Lewis肺癌种植于动物皮下后可通过血行播散到肺部形肺
86、癌种植于动物皮下后可通过血行播散到肺部形成转移灶，故常被用作肿瘤血行转移研究的模型。成转移灶，故常被用作肿瘤血行转移研究的模型。LewisLewis肺肺癌移植于动物皮下、肌肉、爪垫等特定部位，移植瘤增殖癌移植于动物皮下、肌肉、爪垫等特定部位，移植瘤增殖后侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形后侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形成血行播散，成血行播散，粘附于靶器官（主要是肺脏的血管壁）。粘附于靶器官（主要是肺脏的血管壁）。 随后，癌细胞穿出血管，在肺内增殖最终形成肺转移随后，癌细胞穿出血管，在肺内增殖最终形成肺转移瘤。上述移植后的增殖、侵袭、转移到最终形成转移瘤的瘤。上述
87、移植后的增殖、侵袭、转移到最终形成转移瘤的过程，基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的过程，基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤，故称之为癌的一系列步骤，故称之为癌的“自发性转移模型。自发性转移模型。 Lewis Lewis肺癌是迄今研究肿瘤转移的首选模型。肺癌是迄今研究肿瘤转移的首选模型。 操作方法操作方法 1. 1.取皮下接种取皮下接种101014d14d的的LewisLewis肺癌作为瘤源，剥离肿瘤，肺癌作为瘤源，剥离肿瘤，选取生长良好的瘤块，按肿瘤选取生长良好的瘤块，按肿瘤: :生理盐水生理盐水1:31:3匀浆，制备匀浆，制备成成(1(12)102)107 7/
88、ml/ml单细胞匀浆液。单细胞匀浆液。 2. 2.在在C57BL/6C57BL/6小鼠腋窝皮下接种匀浆液，每只鼠小鼠腋窝皮下接种匀浆液，每只鼠0.2ml0.2ml（2102106 64104106 6个个/0.2ml/0.2ml）。）。 3. 3.接种次日开始治疗，接种后接种次日开始治疗，接种后28d28d颈椎脱臼处死动物，颈椎脱臼处死动物，结束实验。结束实验。 4. 4.称小鼠体重和肺重，肺转移瘤越多则肺越重。称小鼠体重和肺重，肺转移瘤越多则肺越重。 5. 5.肺用肺用BouinBouin液固定液固定48h48h后，可见肺组织呈黄色，肿瘤后，可见肺组织呈黄色，肿瘤转移灶呈白色隆起。肉眼或在解
89、剖显微镜下计数肺转移转移灶呈白色隆起。肉眼或在解剖显微镜下计数肺转移瘤灶，正、反面及肺叶间的瘤灶均应计数在内。计数后瘤灶，正、反面及肺叶间的瘤灶均应计数在内。计数后按下式计算肺转移抑制率：按下式计算肺转移抑制率： 给药组平均肺转移瘤数给药组平均肺转移瘤数肺转移抑制率肺转移抑制率(%)（1 ）100% 实验对照组平均肺转移瘤数实验对照组平均肺转移瘤数 注意事项注意事项 1. 1.为确保为确保LewisLewis肺癌的高转移性，必须正规传代。肺癌的高转移性，必须正规传代。 2. 2.实验周期较长，小鼠易发生营养不良，应加营养。实验周期较长，小鼠易发生营养不良，应加营养。 3. 3. 小周龄的小鼠体
90、内小周龄的小鼠体内NKNK细胞活性较低，细胞活性较低，6 61010周龄活性达周龄活性达到高峰，到高峰，1010周龄后逐渐下降，故较小或较老的小鼠肺转移周龄后逐渐下降，故较小或较老的小鼠肺转移率会升高。率会升高。 4. 4.如果采用爪垫皮下接种的方法，则在如果采用爪垫皮下接种的方法，则在C57BL/6C57BL/6小鼠小鼠后爪垫接种上述肿瘤匀浆液后爪垫接种上述肿瘤匀浆液0.02 ml/0.02 ml/鼠鼠( (含细胞含细胞2102105 5 4104105 5个个) )，101012d12d左右从膝关节截除荷瘤后肢，此时肺左右从膝关节截除荷瘤后肢，此时肺内肿瘤微转移灶已形成。第内肿瘤微转移灶已
91、形成。第3030天结束实验，观察肺转移天结束实验，观察肺转移瘤。机制可能是由于切除荷瘤足后可以促进肿瘤自发性瘤。机制可能是由于切除荷瘤足后可以促进肿瘤自发性肺转移。肺转移。 ( (三三)LA-795)LA-795小鼠肺腺癌转移模型小鼠肺腺癌转移模型( (略）略） ( (四四) )小鼠黑色素瘤小鼠黑色素瘤B16-F10B16-F10人工肺转移模型人工肺转移模型 造模原理造模原理 B16-F10 B16-F10是是FidlerFidler从从B16B16细胞中筛选出的肺部高转移细胞中筛选出的肺部高转移克隆株，命名为克隆株，命名为B16-F10B16-F10。小鼠静脉内移植。小鼠静脉内移植B16-F
92、10B16-F10细胞细胞后主要形成肺转移瘤，肺外转移极少。后主要形成肺转移瘤，肺外转移极少。B16-F10B16-F10人工肺人工肺转移模型是将瘤细胞直接注射到小鼠血液循环中，导致转移模型是将瘤细胞直接注射到小鼠血液循环中，导致肿瘤的肺部转移。肿瘤的肺部转移。 把大量瘤细胞直接移植入血液循环，实质上省略了肿把大量瘤细胞直接移植入血液循环，实质上省略了肿瘤转移过程中瘤细胞局部侵袭和侵入血管的步骤，故称为瘤转移过程中瘤细胞局部侵袭和侵入血管的步骤，故称为“人工转移人工转移”(artificial metastasis)”(artificial metastasis)或或“实验性转移实验性转移”模
93、型，有别于肿瘤的模型，有别于肿瘤的“自发性转移自发性转移”模型。模型。 人工转移模型集中体现了肿瘤细胞进入血液循环之后人工转移模型集中体现了肿瘤细胞进入血液循环之后肿瘤转移的几个步骤，对于研究肿瘤细胞在循环系统中的肿瘤转移的几个步骤，对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生存能力、瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力以及探讨生存能力、瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力以及探讨肿瘤转移的器官特异性等，具有其独特优势。肿瘤转移的器官特异性等，具有其独特优势。 操作方法操作方法 1. 1.用胰酶消化体外培养的用胰酶消化体外培养的B16-F10B16-F10细胞，以细胞，以PBSPBS冲洗冲洗3 3次，过次，过20
94、0200目筛网，获得单细胞。用目筛网，获得单细胞。用PBSPBS调整瘤细胞调整瘤细胞浓度为浓度为10106 6个个/ml/ml。 2. 2.将将C57BL/6C57BL/6小鼠尾巴浸泡于小鼠尾巴浸泡于4545的温水中的温水中2min2min，使尾静脉扩张。每只鼠尾静脉注射使尾静脉扩张。每只鼠尾静脉注射0.2ml0.2ml瘤液。瘤液。 3. 3.第第2020天颈椎脱臼法处死小鼠，结束实验。称体重、天颈椎脱臼法处死小鼠，结束实验。称体重、肺重，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶。转移瘤呈黑肺重，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶。转移瘤呈黑色或灰色，相互间很少汇合。色或灰色，相互间很少汇合。 4.Bouin 4.
95、Bouin液固定、制片，进行组织病理学观察。液固定、制片，进行组织病理学观察。 注意事项注意事项 1.C57BL/6 1.C57BL/6小鼠尾静脉较细，更受黑色皮肤遮盖而难小鼠尾静脉较细，更受黑色皮肤遮盖而难以辨认。局部加温后可使尾静脉充分扩张，提高静脉注以辨认。局部加温后可使尾静脉充分扩张，提高静脉注射的成功率。射的成功率。 2.B16-F10 2.B16-F10细胞须分散成单细胞后才可静脉注射，粘细胞须分散成单细胞后才可静脉注射，粘附成团的瘤细胞会增加肺转移瘤数，导致组内误差增大。附成团的瘤细胞会增加肺转移瘤数，导致组内误差增大。 ( (五五) )小鼠小鼠HepHep肝癌脾内移植肝转移模型
96、（略）肝癌脾内移植肝转移模型（略） ( (六六) )黑色素瘤脾内移植肝转移模型（略）黑色素瘤脾内移植肝转移模型（略）第八节第八节肿瘤细胞分化诱导的肿瘤细胞分化诱导的体外研究方法体外研究方法 肿瘤细胞可视为正常细胞分化受阻或分化失控，成肿瘤细胞可视为正常细胞分化受阻或分化失控，成为不衰老的永生细胞。近年研究表明，某些恶性肿瘤细为不衰老的永生细胞。近年研究表明，某些恶性肿瘤细胞在体内外诱导剂的作用下，可重新分化，向正常细胞胞在体内外诱导剂的作用下，可重新分化，向正常细胞逆转，这种现象就是肿瘤细胞的诱导分化（逆转，这种现象就是肿瘤细胞的诱导分化（induction induction of diff
97、erentiationof differentiation）。肿瘤分化诱导疗法具有特殊的）。肿瘤分化诱导疗法具有特殊的优越性。优越性。 可用人早幼粒白血病可用人早幼粒白血病HL-60HL-60细胞、小鼠黑色素瘤细胞、小鼠黑色素瘤B16B16细胞、肝癌细胞、肝癌Bel 7402Bel 7402细胞、人结肠癌细胞、人结肠癌HT-29HT-29细胞等进细胞等进行细胞的分化诱导试验，但不同组织来源的肿瘤细胞行细胞的分化诱导试验，但不同组织来源的肿瘤细胞其分化标志不尽相同。目前应用较多的是其分化标志不尽相同。目前应用较多的是HL-60HL-60细胞。细胞。第九节第九节逆转肿瘤耐药性药物的逆转肿瘤耐药性药
98、物的研究方法研究方法 几乎所有抗癌药物长期应用后都会诱导耐药性，肿瘤几乎所有抗癌药物长期应用后都会诱导耐药性，肿瘤细胞对药物产生耐药性是肿瘤化学治疗失败的主要原因细胞对药物产生耐药性是肿瘤化学治疗失败的主要原因之一。之一。 按耐药性的来源，肿瘤细胞耐药性可分为：按耐药性的来源，肿瘤细胞耐药性可分为： 先天性耐药（先天性耐药（intrinsic drug resistanceintrinsic drug resistance） 获得性耐药（获得性耐药（acquired drug resistanceacquired drug resistance）按耐药特点可分为：按耐药特点可分为： 原药耐药性
99、（原药耐药性（primary drug resistanceprimary drug resistance） 多药耐药性（多药耐药性（multidrug resistancemultidrug resistance，MDRMDR） 原药耐药性原药耐药性只对诱导的原药产生耐药，而对其他药物不只对诱导的原药产生耐药，而对其他药物不产生交叉耐药；产生交叉耐药； 多药耐药性多药耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生的同时，对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生耐药性。耐药性。 产生多药耐药性的药物多数为分
100、子量较大的天然产物，产生多药耐药性的药物多数为分子量较大的天然产物，脂溶性较大，包括长春碱类、秋水仙碱、高三尖杉碱、脂溶性较大，包括长春碱类、秋水仙碱、高三尖杉碱、蒽环类抗生素、更生霉素、丝裂霉素、紫杉醇等。蒽环类抗生素、更生霉素、丝裂霉素、紫杉醇等。 MDR MDR的发生机制十分复杂，其中多药耐药基因的发生机制十分复杂，其中多药耐药基因MDRMDR编码编码的的P P糖蛋白糖蛋白(P-gp(P-gp，P-170)P-170)高表达是主要机制。高表达是主要机制。 P-gp P-gp是分子量为是分子量为170kD170kD、具有能量依赖性药泵功能的、具有能量依赖性药泵功能的跨膜糖蛋白，在人类主要由
101、跨膜糖蛋白，在人类主要由MDR1MDR1产生。产生。MDRMDR表达产物表达产物P-gpP-gp可将亲脂类化疗药物泵出细胞外，从而产生耐药性。可将亲脂类化疗药物泵出细胞外，从而产生耐药性。 用肿瘤耐药细胞株在体外筛选新的逆转剂，是寻找肿用肿瘤耐药细胞株在体外筛选新的逆转剂，是寻找肿瘤耐药性逆转剂的有效方法。耐药细胞株可以由实验室瘤耐药性逆转剂的有效方法。耐药细胞株可以由实验室自行建立，也可以从国内细胞库购得。自行建立，也可以从国内细胞库购得。 操作方法操作方法 1. 1.耐药细胞株的建立耐药细胞株的建立 2. 2.检测受试药物的细胞毒性检测受试药物的细胞毒性 采用采用MTTMTT法测定受试法测
102、定受试药物对敏感细胞株和耐药细胞株的细胞毒性。药物对敏感细胞株和耐药细胞株的细胞毒性。 3. 3.细胞存活率的测定和逆转倍数的计算细胞存活率的测定和逆转倍数的计算 采用采用MTTMTT法测定细胞存活率。存活率按以下公式计算：法测定细胞存活率。存活率按以下公式计算： 加药组加药组A值不加细胞组值不加细胞组A值值存活率存活率=100%不加药对照组不加药对照组A值值 从各组求出存活率的直线回归方程，再从此方程求出从各组求出存活率的直线回归方程，再从此方程求出半数抑制浓度半数抑制浓度ICIC5050。用逆转倍数。用逆转倍数(fold reversal, FR)(fold reversal, FR)评评
103、价逆转效果，逆转倍数的计算公式为：价逆转效果，逆转倍数的计算公式为： IC50（不加逆转剂）（不加逆转剂）逆转倍数逆转倍数IC50（加逆转剂）（加逆转剂） 本章学习要点本章学习要点 自发性、诱发性和移植性肿瘤的概念自发性、诱发性和移植性肿瘤的概念自发性、诱发性和移植性肿瘤的概念自发性、诱发性和移植性肿瘤的概念 实体型移植性肿瘤接种的基本过程实体型移植性肿瘤接种的基本过程实体型移植性肿瘤接种的基本过程实体型移植性肿瘤接种的基本过程 腹水型肿瘤移植的主要步骤腹水型肿瘤移植的主要步骤腹水型肿瘤移植的主要步骤腹水型肿瘤移植的主要步骤 瘤重抑制率和生命延长率的计算瘤重抑制率和生命延长率的计算瘤重抑制率和
104、生命延长率的计算瘤重抑制率和生命延长率的计算 MTTMTTMTTMTT法的基本原理和主要操作方法法的基本原理和主要操作方法法的基本原理和主要操作方法法的基本原理和主要操作方法 克隆形成试验的基本原理和主要操作方法克隆形成试验的基本原理和主要操作方法克隆形成试验的基本原理和主要操作方法克隆形成试验的基本原理和主要操作方法 重组基膜侵袭实验的基本原理重组基膜侵袭实验的基本原理重组基膜侵袭实验的基本原理重组基膜侵袭实验的基本原理 自发性转移模型和人工转移模型的概念自发性转移模型和人工转移模型的概念自发性转移模型和人工转移模型的概念自发性转移模型和人工转移模型的概念 LewisLewisLewisLewis肺癌自发性肺转移模型的原理和主要操作方法肺癌自发性肺转移模型的原理和主要操作方法肺癌自发性肺转移模型的原理和主要操作方法肺癌自发性肺转移模型的原理和主要操作方法 肿瘤细胞冻存及复苏的方法肿瘤细胞冻存及复苏的方法肿瘤细胞冻存及复苏的方法肿瘤细胞冻存及复苏的方法正置显微镜正置显微镜倒倒置置显显微微镜镜
