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1、重组人胰岛素和重组重组人胰岛素和重组人生长激素生产工艺人生长激素生产工艺2010.4.131重组人胰岛素重组人胰岛素p 定义定义： 胰岛素是由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。p 胰岛素的生物合成胰岛素的生物合成 胰岛素合成的控制基因在第11对染色体短臂上。在细胞的细胞核中，胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由109个氨基酸残基构成的前胰岛素原前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链胰岛素原胰岛素原（Proinsulin）。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经
2、蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素，分泌到细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，生物活性仅有胰岛素的10%。p 结构结构： 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。 2猪胰岛素猪胰岛素牛胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）
3、门冬胰岛素门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效（诺和诺德公司、速效Ins ） 甘精胰岛素甘精胰岛素 (安万特公司、长效安万特公司、长效Ins)人胰岛素原人胰岛素原B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21 ;B31 ;B32 33D Structure of Insulin胰岛素二聚体（胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（胰岛素六聚体（hexamer ）4Ins的性质的性质 5胰岛素的功能胰岛素的功能 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。目前临床使用的胰岛素来源目前临床使用的胰岛素来源
4、1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。61921年年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。的历史。1926年年-重结晶胰岛素重结晶胰岛素1930s-传统中、长效动物胰岛素传统中、长
5、效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和单峰胰岛素和 单组分胰岛素单组分胰岛素 70年代末年代末-半合成胰岛素半合成胰岛素1982年年-采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。和长效人胰岛素类似物。 7动物来源的胰岛素动物来源的胰岛素（28种）种）药品名称药品名称生产企业生产企业药品名称药品名称生产企业生产企业ILETIN I LILLY NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN NOVO NORDISK
6、 INC ILETIN II LILLY PROTAMINE ZINC & ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY INSULIN NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II LILLY INSULIN INSULATARD NPH NORDISK NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK) LILLY INSULIN NORDISK MIXTARD (PORK) NOVO NORDISK INCPROTAMINE ZINC INSULIN BRISTOL MYERS S
7、QUIBB LENTARD NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II LILLY LENTE NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II (PORK) LILLY LENTE ILETIN II LILLY REGULAR PURIFIED PORK INSULIN NOVO NORDISK INC LENTE ILETIN II (PORK) LILLY REGULAR INSULIN NOVO NORDISK INCLENTE INSULIN NOVO NORDISK INC SEMILENTE NOVO NORDISK INC NPH
8、 ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY SEMILENTE INSULIN NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II LILLY ULTRALENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II (PORK) LILLY ULTRALENTE INSULIN NOVO NORDISK INCNPH INSULIN NOVO NORDISK INC VELOSULIN NOVO NORDISK INC 8半合成来源的胰岛素半合成来源的胰岛素（5种）种）药品名称药品名称生产企业生产企业INSULATARD NPH HUMAN NOVO NORD
9、ISK INC MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS NOVOLIN 70/30 NOVO NORDISK INCNOVOLIN L NOVO NORDISK INCNOVOLIN N NOVO NORDISK INC9基因重组来源的胰岛素基因重组来源的胰岛素（27种）种）药品名称药品名称生产企业生产企业药品名称药品名称生产企业生产企业APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG LILLY MIXTARD HUMAN 70/
10、30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50 LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 PEN LILLYNOVOLOG NOVO
11、NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLOG MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY101.通化东宝通化东宝 1998年年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖甘舒霖” 甘舒霖甘舒霖 R- 常规重组人胰岛素注射液常规重组人胰岛素注射
12、液 甘舒霖甘舒霖 N- 低精蛋白重组人胰岛素注射液低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖甘舒霖 30R- 30/70混合重组人胰岛素注射液混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重组人胰岛素和常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素低精蛋白重组人胰岛素）2.深圳科兴深圳科兴 苏泌啉苏泌啉- 常规重组人胰岛素注射液常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩苏泌啉恩- 低精蛋白重组人胰岛素注射液低精蛋白重组人胰岛素注射液 3.徐州万邦徐州万邦 万邦林万邦林- 常规重组人胰岛素注射液常规重组人胰岛素注射液 万苏林万苏林猪胰岛素制剂猪胰岛素制剂胰岛素国内主要生产厂家胰岛素国内主要生产厂家其他其他（持有药品注册证）
13、（持有药品注册证） -南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化 制药厂、武汉生化制药厂制药厂、武汉生化制药厂 等等11临床用胰岛素分类临床用胰岛素分类l普通胰岛素：从动物胰脏中提取普通胰岛素：从动物胰脏中提取l人胰岛素人胰岛素l传统中长效胰岛素传统中长效胰岛素 l长效人胰岛素类似物长效人胰岛素类似物l速效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物l非注射胰岛素非注射胰岛素12传统中长效胰岛素制剂传统中长效胰岛素制剂 低精蛋白锌胰岛素：低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。 例：例：礼来
14、公司，礼来公司， Humulin N(rDNA、大肠杆菌、大肠杆菌) 诺和诺德，诺和诺德， Novolin N (rDNA、酿酒酵母、酿酒酵母) 胰岛素锌混悬液胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液 例：例：礼来公司，礼来公司， Humulin 30/70 (30%常规胰岛素，常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素精蛋白锌胰岛素) Humulin 50/50 诺和诺德，诺和诺德， Novolin 30/70 Novolin 50/50缺陷缺陷：1.作用时间少于作用时间少于24小时小时2.作用峰值明显，夜间低血糖危险性高作用峰值明显，夜间低血糖危险性高3
15、.吸收不稳定吸收不稳定4.结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素再玻璃瓶壁沉淀，丧失活性结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素再玻璃瓶壁沉淀，丧失活性13速效胰岛素特点：特点：起效快，皮下注射后起效快，皮下注射后15分钟起效。分钟起效。 达峰快，注射后达峰快，注射后15分钟起效，分钟起效，3060分钟达到药效高峰。分钟达到药效高峰。药效维持时间短，大约在药效维持时间短，大约在3小时左右（小时左右（24小时）小时）。 药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。能够很好地控制当餐后血糖而且不
16、容易发生低血糖。起效时间起效时间 达峰时间达峰时间峰持续时间峰持续时间 作用消除时间作用消除时间常规皮下常规皮下Ins: 30-90min1.5-2.5h 2-4h6-8h生理生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h14 Lispro （赖脯胰岛素（赖脯胰岛素 ，Humalog ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。 Aspart（门冬胰岛素，（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA （赖谷胰岛素，（赖谷胰岛素，Api
17、dra ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。15长效胰岛素-人胰岛素类似物1. 甘精胰岛素甘精胰岛素（ glargine ）：）： 商品名商品名Lantus-甘氨酸替代胰岛素甘氨酸替代胰岛素A A链链2121位门冬氨酸、并在位门冬氨酸、并在B B链末端增加两链末端增加两 个精氨酸。个精氨酸。 使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性
18、条件下结晶。晶。2. Insulin Detemir：商品名商品名Levemir -胰岛素胰岛素B链链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基烷基 酸的酸的14碳游离脂肪酸碳游离脂肪酸该该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。期。 16Insulin Detemir（Levemir ）诺和诺德公司研制诺和诺德公司研制 glargine （Lantus）安万特公司研制安万特公司研制17胰岛素肺部吸入制剂胰岛素肺部吸入制剂-Exubera辉瑞、万安特以及辉瑞、万安特以及N
19、ektar 共同研发共同研发于于2006.1.27被被FDA批准批准一种作用快的胰岛素干粉吸入剂一种作用快的胰岛素干粉吸入剂适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征速效化的特征18胰岛素制备工艺胰岛素制备工艺 以动物胰脏为原料提取胰岛素以动物胰脏为原料提取胰岛素 -酸醇提取法酸醇提取法 传统胰岛素传统胰岛素-猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 单峰胰岛素单峰胰岛素-凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化 单组分胰岛素单组分胰岛素-凝胶过滤、离子交换纯化凝胶过滤、离子交换纯化 半合成胰岛素半合成胰岛素-以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素以猪胰岛
20、素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组重组DNADNA技术生产人胰岛素技术生产人胰岛素 AB链合成：分别表达链合成：分别表达AB链，化学方法连接链，化学方法连接 逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素19重组重组DNA技术制造人胰岛素技术制造人胰岛素 1.AB链合成法链合成法：以人工合成的人胰岛素以人工合成的人胰岛素A链和链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和链和B链，链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接然后再通过化学氧化作用，通过二硫键
21、连接起来。起来。已被淘汰已被淘汰2.反转录酶法：仿照天然合成途径反转录酶法：仿照天然合成途径3. 通过胰岛素原的通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰肽得人胰岛素。岛素。20Ins A链链Ins B链链转化大肠杆菌转化大肠杆菌发酵发酵A链链B链链纯化纯化二硫键二硫键活性胰岛素活性胰岛素AB链合成人胰岛素链合成人胰岛素21质粒质粒Ins mRNA反转录反转录Ins cDNA转化大肠杆菌转化大肠杆菌PCR连接连接胰岛素原胰岛素原活性胰岛素活性胰岛素二硫键酶切酶切 提取质粒提取质粒限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切 反转录酶法合成人胰岛素反转录酶法合成人胰岛素22破碎菌体 包含体 尿素溶解 复性23酵母系统生产重组胰岛素v优点：二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理v缺点：表达低，发酵时间长v表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS 和微小胰岛素原。 前肽序列引导目的蛋白通过正确的分泌途径至胞外。宿主：贝克酵母。分泌量大，形成二硫键，培养基简单，高密度发酵，无热原和有毒物质2425重组胰岛素的质量控制测定生物活性效价测定控制产品中杂质或潜在有害物质保证产品安全性保证产品安全性和有效性长期重复大剂量使用26
