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1、 第六章第六章 基因文基因文库技技术(The technology of gene libraries) 基因文库技术课件一、基因文一、基因文库(Gene libraries) 汇集着基因集着基因组所有的所有的DNA序列的重序列的重组体体DNA群体群体为 基因文基因文库(Gene libraries) 或基因或基因库(gene libraries) ， DNA文文库(DNA libraries)。 由基因由基因组DNA所制成的基因文所制成的基因文库称称为基因基因组文文库 (genomic libraries )，由互，由互补DNA所制成的称所制成的称为 cDNA文文库(cDNA librari
2、es )。 (bank，libraries， pool，reservoir)基因文库技术课件二、基因二、基因组文文库（ genomic library）n1、基因、基因组文文库的概念的概念 将某种生物的全部将某种生物的全部遗传组成（成（DNA）切成适当）切成适当长度的片段，度的片段，连接在接在载体上，体上，转化到宿主化到宿主细胞胞中而构建的基因文中而构建的基因文库，就称，就称为基因基因组文文库。基因文库技术课件2、构建基因组文库的步骤、构建基因组文库的步骤Preparation genomic DNAProducing DNA fragment by restriction endonucla
3、sesCreating recombinant DNA by ligaseTransformed into competent cellScreening the target DNA基因文库技术课件为了要分离到一个确实含有目的为了要分离到一个确实含有目的基因的克隆，究竟要筛选多少个基因的克隆，究竟要筛选多少个重组体克隆呢？重组体克隆呢？基因文库技术课件3 3、基因组文库的大小、基因组文库的大小 1976年，年，L.Clark和和J. Carbon提出了一个提出了一个经验公式：公式： N=ln(1-p)/ln(1-x/y)N: 完完全全基基因因文文库所所应包包含含的的重重组DNA的的转化化子子
4、克克隆隆数（基因文数（基因文库大小）大小）P：在在重重组体体群群体体中中出出现目目的的基基因因序序列列的的概概率率（一一般般为99%）X：文：文库中每个克隆所含的外源中每个克隆所含的外源DNA片段的平均片段的平均长度度Y：该生物基因生物基因组的大小（的大小（单倍体基因倍体基因组长度）度）基因文库技术课件举例：举例： 为了了获得猪垂体生得猪垂体生长激素激素 PGH 基因，用猪垂基因，用猪垂体体细胞分离制取构建胞分离制取构建 PGH 基因文基因文库时，用上，用上式式计算，算， X：插入的：插入的DNA片段平均片段平均长度度16kb, Y：单倍体倍体长度度3.30106kb， N=9.67105个个
5、，如如果果实验中中得得到到106个个重重组噬噬菌菌体体，符符合合基基因因组文文库大大小小的的要要求求，即即99%可可能能筛选出所需的出所需的PGH基因。基因。基因文库技术课件三、三、cDNA文文库1、概念：、概念： 通通过一系列的一系列的酶酶催作用，使催作用，使总Poly(A) mRNA转变成双成双链cDNA群体，并插入到适当的群体，并插入到适当的载体体分子上，然后再分子上，然后再转化化给大大肠杆菌寄主菌株的杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列序列的的cDNA基因文基因文库 。基因文库技术课件2、cDNA文文库构建的具体步构建的具体步骤基因文
6、库技术课件分离分离细胞胞总RNA,然后从中然后从中纯化出主要含化出主要含mRNA的部分的部分合成第一合成第一链cDNAoligo(dT)引引导的的cDNA合成法、随机引物引合成法、随机引物引导的的cDNA合成法合成法将将 mRNA-DNA杂交分子转变为双链杂交分子转变为双链cDNA分子分子自我引导合成法、自我引导合成法、RNaseH酶降解取代法酶降解取代法将将 cDNA甲基化及加甲基化及加连接子接子将合成的双将合成的双链cDNA重重组到到质粒粒载体或噬菌体体或噬菌体载体体上上导入寄主入寄主细胞增殖胞增殖基因文库技术课件总RNA的完整性的的完整性的鉴定定基因文库技术课件n用纤维素柱纯化用纤维素柱
7、纯化poly(A) mRNA的流程示意图的流程示意图基因文库技术课件基因文库技术课件nlibraries基因文库技术课件基因文库技术课件基因文库技术课件以以噬菌体构建噬菌体构建cDNA文文库基因文库技术课件基因文库技术课件基因文库技术课件 N=P为文文库中包含中包含细胞中任何一种胞中任何一种mRNA序列信息的概序列信息的概率率,通常通常设为99%;N为文文库中以中以P概率出概率出现细胞中任何一种胞中任何一种mRNA序列序列理理论上上应具有的最少重具有的最少重组子克隆数子克隆数;n为细胞中最稀少的胞中最稀少的mRNA序列的拷序列的拷贝数数;T为细胞中表达出的所有胞中表达出的所有mRNA的的总拷拷
8、贝数数.ln(1-P)ln(1-n/T)3、cDNA文文库的的库容量容量计算：算：基因文库技术课件4、cDNA文文库的的优点点1、cDNA克隆以克隆以mRNA为起始材料，起始材料，这对于有些于有些RNA病病毒来毒来说非常适用。因非常适用。因为它它们的增殖并不的增殖并不经过DNA中中间体。体。2、cDNA基因文基因文库的的筛选简单易行。易行。3、每一个、每一个cDNA克隆都含有一种克隆都含有一种mRNA序列，在序列，在选择中出中出现假阳性几率比假阳性几率比较低。低。4、克隆在、克隆在细菌中表达的基因和基因序列菌中表达的基因和基因序列结构的构的测定。定。5、表达序列、表达序列标签的研究（的研究（expressed sequence tags,EST)基因文库技术课件5、cDNA文文库的的应用用1.用于用于筛选基因。通基因。通过cDNA文文库筛选获取取较为完整完整的的cDNA片段。片段。2.构建表达型构建表达型cDNA文文库,通通过筛选特异性表达蛋白特异性表达蛋白质分离基因。分离基因。3.用于分离用于分离发育育阶段特异性及段特异性及组织特异性基因。特异性基因。基因文库技术课件
