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1、细胞划痕实验1听风书屋一、基本原理一、基本原理细胞划痕（细胞划痕（WoundHealing）法是简捷测定细胞迁移运）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移（修
2、复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力可以判断各组细胞的迁移与修复能力2听风书屋二、实验步骤二、实验步骤准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射笔在操作前紫外照射30min（超
3、净台内（超净台内）1.先用先用marker笔在笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔得划横线，大约每隔0.51cm一道，横穿过孔。每一道，横穿过孔。每孔至少穿过孔至少穿过5条线。条线。2.在孔中加入约在孔中加入约5105个细胞，具体数量因细胞不同个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。而不同，掌握为过夜能铺满。3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使用同一枪头。用同一枪头。4.用用PBS洗细胞洗细胞3次，去掉划
4、下的细胞，次，去掉划下的细胞，加入无血清加入无血清或低血清培养基。或低血清培养基。5.放入放入37度度5%CO2培养箱，培养。培养箱，培养。按按0，6，12，24小时取样，拍照小时取样，拍照。3听风书屋cultureInsert方法（保证划痕的均一度）方法（保证划痕的均一度）1.准备细胞，培养液。准备细胞，培养液。2.如图，将细胞接种于如图，将细胞接种于Dish中间的中间的Insert，细胞长满，细胞长满Insert区域后用镊子区域后用镊子移除移除Insert即可产生即可产生500m宽度的划痕。宽度的划痕。3.每隔每隔4-6小时拍照记录。小时拍照记录。4.根据收集图片数据分析实验结果。根据收集
5、图片数据分析实验结果。细胞定位格子培养皿4听风书屋5听风书屋三、实验结果三、实验结果统计方法：使用统计方法：使用ImageJ软件打开图片后，随机划取软件打开图片后，随机划取6至至8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。定量比较细胞迁移的速度。其他结果分析工具：其他结果分析工具：WoundHealingImageAnalysisWimScratchhttp:/dxy.me/UfYziiImageProPlus6听风书屋7听风书屋划痕结果图划痕结果图8听风书屋0h6h12h24h小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T39听
6、风书屋10听风书屋四、注意事项：四、注意事项：1.在用在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝裂霉素处理一小时）裂霉素处理一小时）3.按照按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。后观察时位
7、置不固定的问题。11听风书屋特点：特点：1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。2.价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。环境简单单纯，容易控制。3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。细胞间的相互作用。4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。12听风书屋举例：抗肿瘤药物举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响
8、（细胞划痕法）一、一、实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力二、实验材料：二、实验材料：1）细胞系及其培养：肝肿瘤细细胞系及其培养：肝肿瘤细胞胞HepG22）24孔板孔板移液器移液器倒置显微镜倒置显微镜3）主要试剂：主要试剂：PBSDMEM培养液培养液0.25%胰酶胎牛血清胰酶胎牛血清5-氟尿嘧啶溶液（氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）1
9、3听风书屋三、实验步骤三、实验步骤1制备单层细胞：细胞密度制备单层细胞：细胞密度510105/mLHepG2细胞铺于细胞铺于24孔板孔板（每孔（每孔500uL）上，加入含）上，加入含10胎牛血清的胎牛血清的DMEM培养液培养液培养培养1624h,使形成单层细胞使形成单层细胞2划痕划痕：以五氟尿嘧啶（：以五氟尿嘧啶（5Fu）为例，首先配制）为例，首先配制1g/L母液母液(使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45L该母液用该母液用PBS稀释至稀释至1.1mL，得浓度，得浓度40g/mL5Fu溶液溶液，用，用10uL移液枪枪头（或者移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞
10、上呈一字划痕，用无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗清洗3次，然后加入次，然后加入上面配好上面配好5Fu溶液，平行两个样本，孵育溶液，平行两个样本，孵育24h，换成含，换成含10胎牛胎牛血清的血清的DMEM培养液培养液孵育孵育24h3观察并拍照：吸去培养液，用观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗清洗3次，倒置荧光显微镜下次，倒置荧光显微镜下观察并拍照观察并拍照14听风书屋15听风书屋四、注意事项：四、注意事项：1实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴壁率等，确壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。终止时密度适当。2用用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，免缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，免冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。3药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重要的一方面，要的一方面，实验设计过程需实验设计过程需要选择适当阳性对要选择适当阳性对照组和阴性对照组。照组和阴性对照组。16听风书屋
