药物分析湖南大学第04章药物定量分析与分析方法验证

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1、第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法第二节第二节 定量分析方法的特点定量分析方法的特点第三节第三节 药品分析方法的验证药品分析方法的验证第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法在在进进行行药药物物定定量量分分析析之之前前，一一般般需需根根据据分分析析方方法法的的特特点点，化化学学原原料料药药的的结结构构与与性性质质及及药药物物制制剂剂的的处处方方组组成成采采用用不不同同的的方方法法对对试试样样进进行行前前处处理，以满

2、足所选用的分析方法对试样的要求。理，以满足所选用的分析方法对试样的要求。含含金金属属或或卤卤素素、氮氮、硫硫、磷磷等等元元素素的的药药物物的的分分析方法通常可分为：析方法通常可分为：（1 1）不经有机破坏的分析方法）不经有机破坏的分析方法（2 2）经有机破坏的分析方法）经有机破坏的分析方法一、不经有机破坏的分析方法一、不经有机破坏的分析方法l不对药物分子中的有机结构进行完全破坏不对药物分子中的有机结构进行完全破坏;l仅仅选选用用适适当当的的溶溶剂剂溶溶解解样样品品使使待待测测元元素素离离子子电电离离或或经经简简单单回回流流处处理理使使有有机机结结合合的的待待测元素原子离解而转化为无机盐类后测定

3、。测元素原子离解而转化为无机盐类后测定。l适适用用于于含含金金属属有有机机药药物物或或结结合合不不牢牢固固的的含含卤素等药物的分析。卤素等药物的分析。l根根据据操操作作方方法法不不同同，主主要要有有：直直接接测测定定法法、经水解后测定法、经还原分解后测定法经水解后测定法、经还原分解后测定法。1.直接测定法直接测定法凡凡金金属属原原子子不不直直接接与与碳碳原原子子相相连连的的含含金金属属的的有有机机药药物物或或某某些些C-MC-M（金金属属原原子子直直接接与与碳碳原原子子相相连连）键键结结合合不不牢牢固固的的有有机机金金属属药药物物，在在水水溶溶液液中中可可电电离离，不不需需经有机破坏，直接进行

4、测定。经有机破坏，直接进行测定。配配位位滴滴定定法法：利利用用二二价价金金属属离离子子可可与与乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸二二钠钠形形成成配配位位化化合合物物，直直接接乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸二二钠钠滴定液滴定。滴定液滴定。氧氧化化还还原原滴滴定定法法：利利用用不不同同价价态态的的金金属属离离子子的的氧氧化化还还原原性性，选选用用适适当当的的滴滴定定液液直直接接或或间间接接滴滴定定法法测定含量。测定含量。例例1 1：葡萄糖酸钙的含量测定：葡萄糖酸钙的含量测定取取本本品品，加加水水溶溶解解后后，在在氢氢氧氧化化钠钠碱碱性性条条件件下下，以以钙钙紫紫红红素素为为指指示示剂剂，用用乙乙二二胺胺四四乙乙酸

5、酸二二钠钠滴滴定定液液滴滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色。定至溶液自紫色转变为纯蓝色。例例2 2：葡萄糖酸锑钠的含量测定：葡萄糖酸锑钠的含量测定本本品品所所含含的的五五价价锑锑具具有有氧氧化化性性，在在酸酸性性溶溶液液中中可可氧氧化化碘碘化化钾钾并并析析出出碘碘，选选用用间间接接碘碘量量法法，用用硫硫代代硫硫酸酸钠滴定液滴定。钠滴定液滴定。2.经水解后测定法经水解后测定法碱碱水水解解后后测测定定法法：将将含含卤卤素素的的有有机机药药物物溶溶解解于于适适当当的的溶溶剂剂中中，加加NaOHNaOH溶溶液液回回流流使使其其水水解解，将将有有机机结结合合的的卤卤素素转转变变为为无无机机形形式式的的卤卤素素

6、离离子子，然然后后选选用用间间接接银银量量法法。本本法法适适用用于于含含卤卤素素有有机机药药物物结结构构中中卤卤素素原原子子结结合合不不牢牢固固的的药药物物，如如卤卤素素和和脂脂肪肪碳碳相连者。相连者。酸酸水水解解后后测测定定法法：将将含含金金属属的的有有机机药药物物与与适适当当的的矿矿酸酸（如如盐盐酸酸）共共热热，将将不不溶溶性性金金属属盐盐类类水水解解置置换换为为可可溶溶性性盐盐，然然后后选选用用配配位位滴滴定定或或剩剩余余酸酸碱碱滴滴定法测定。定法测定。例例2 2：三氯叔丁醇的含量测定：三氯叔丁醇的含量测定取取本本品品，溶溶于于乙乙醇醇后后，加加NaOHNaOH溶溶液液并并加加热热回回流

7、流，使使有有机机结结合合的的氯氯水水解解生生成成NaClNaCl，与与AgNOAgNO3 3生生成成AgClAgCl沉沉淀淀，过量的过量的AgNOAgNO3 3用用NHNH4 4SCNSCN溶液滴定溶液滴定( (指示剂指示剂:Fe:Fe3+3+) )。例例1 1：十一烯酸锌的含量测定：十一烯酸锌的含量测定本本品品与与稀稀盐盐酸酸共共沸沸，水水解解生生成成十十一一烯烯酸酸和和氯氯化化锌锌，用乙二胺四乙酸钠滴定液直接滴定锌离子。用乙二胺四乙酸钠滴定液直接滴定锌离子。CCl3- -C(CH3)2- -OH + 4NaOH 回流回流(CH3)2- -CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O

8、NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCNAgSCN + NH4NO3（淡棕红色）（淡棕红色）(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.010- -12 )Fe3+ + SCN Fe (SCN) 2+ 3.经还原分解后测定法。经还原分解后测定法。含含碘碘有有机机药药物物，当当碘碘原原子子直直接接与与芳芳环环连连接接时时，碘碘的的结结合合比比较较牢牢固固，采采用用碱碱性性溶溶液液回回流流是是难难以以使使C-I键键断断裂裂，但但可可在在碱碱性性人人溶溶液液中中加加入入还还原原剂剂（如如锌锌粉粉）回回流，使其转化为无机碘化物后测定。流，使其转化为无机碘化物后测

9、定。例：泛影酸的含量测定例：泛影酸的含量测定取取本本品品约约0.4g0.4g（精精密密称称定定），加加NaOHNaOH试试液液30ml30ml与与锌锌粉粉1.0g1.0g，加加热热回回流流30min30min，放放冷冷，冷冷凝凝管管用用少少量量水水洗洗涤涤，滤滤过过，烧烧瓶瓶与与滤滤器器用用水水洗洗涤涤三三次次，每每次次15ml15ml，洗洗液液与与滤滤液液合合并并，加加冰冰醋醋酸酸5ml5ml与与曙曙红红钠钠指指示示液液5 5滴滴，用用AgNOAgNO3 3（0.1mol/L0.1mol/L）滴定液滴定。）滴定液滴定。+ 11NaOH + 3Zn + 11NaOH + 3Zn + 3NaI

10、+ 2CH+ 3NaI + 2CH3 3COONa + 3NaCOONa + 3Na2 2ZnOZnO2 2 + 3H + 3H2 2O OCOONaNH2NH2NaINaI + AgNo + AgNo3 3 AgIAgI+ NaNO+ NaNO3 3碘他拉酸、胆影酸、碘番酸等均采用同法测定碘他拉酸、胆影酸、碘番酸等均采用同法测定胆影酸胆影酸碘他碘他拉酸拉酸碘番酸碘番酸二、经有机破坏的分析方法二、经有机破坏的分析方法l含含金金属属及及含含卤卤素素、氮氮、硫硫、磷磷等等有有机机药药物物结结构构中中的的待待测测原原子子与与碳碳原原子子结结合合牢牢固固者者，用用水水解解或或氧氧化化还还原原的的方方法

11、法难难以以将将有有机机结结合合的待测原子转变为无机形式；的待测原子转变为无机形式；l须须采采用用有有机机破破坏坏的的方方法法将将药药物物分分子子中中有有机机结结构构部部分分完完全全破破坏坏，使使有有机机结结合合形形式式的的待待测测原原子子转转变变为为可可测测的的无无机机离离子子（或或氧氧化化物物、无无氧氧酸酸等等）后后方方可可分分析析。有有机机破破坏坏方方法法包包括：括：湿法破坏、干法破坏。湿法破坏、干法破坏。1.湿法破坏湿法破坏适适用用于于含含氮氮有有机机合合成成药药物物分分析析的的前前处处理理，在在生生物物制制品品分分析析中中用用于于氮氮（包包括括蛋蛋白白质质）、磷磷、硫硫柳柳汞汞及及氯氯

12、化钠测定法的前处理；化钠测定法的前处理； 亦亦可可用用于于生生物物样样品品中中金金属属元元素素测测定定时时生生物物基基质质的的去去除。除。主要分解剂：硫酸主要分解剂：硫酸辅助分解剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢。辅助分解剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢。湿湿法法破破坏坏可可分分为为：硫硫酸酸- -硝硝酸酸法法、硫硫酸酸- -高高氯氯酸酸法法、硫酸硫酸- -硫酸盐法硫酸盐法、硝酸、硝酸- -高锰酸钾法。高锰酸钾法。以硫酸以硫酸- -硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法分析方法凯氏定氮法凯氏定氮法原理原理将将含含氮氮有有机机药药物物与与硫硫酸酸和和硫硫酸酸盐盐在在凯凯氏氏烧

13、烧瓶瓶中中共共热热，药药物物分分子子中中有有机机结结构构被被氧氧化化分分解解成成二二氧氧化化碳碳和和水水，有有机机结结合合的的氮氮则则转转变变为为无无机机氨氨，并并于于过过量量的的硫硫酸酸结结合为硫酸氢铵及硫酸铵；合为硫酸氢铵及硫酸铵；经经NaOHNaOH碱碱化化后后释释放放出出氨氨气气，并并随随水水蒸蒸汽汽馏馏出出，用用硼硼酸酸溶溶液液或或定定量量的的酸酸滴滴定定液液吸吸收收后后，再再用用酸酸或或碱碱滴滴定定液滴定。液滴定。加加入入硫硫酸酸盐盐的的作作用用是是：提提高高硫硫酸酸的的沸沸点点，增增强强硫硫酸酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。以硫酸以硫

14、酸- -硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法分析方法凯氏定氮法凯氏定氮法原理原理（续）（续）催催化化剂剂（如如汞汞或或汞汞盐盐、硒硒粉粉、铜铜盐盐、二二氧氧化化锰锰）：加快氧化分解的速度，以缩短反应时间。加快氧化分解的速度，以缩短反应时间。硫硫酸酸铜铜因因价价廉廉易易得得，且且无无挥挥发发、毒毒性性低低，常常被被用用作作本法的催化剂。本法的催化剂。对对某某些些难难以以分分解解的的药药物物（如如含含氮氮杂杂环环结结构构药药物物），在在氧氧化化分分解解过过程程中中常常需需加加入入辅辅助助氧氧化化剂剂，使使分分解解完完全全并并缩缩短短分分解解时时间间。常常用用的的

15、辅辅助助氧氧化化剂剂有有30%30%过过氧氧化化氢和高氯酸。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。氢和高氯酸。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。以硫酸以硫酸- -硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法分析方法凯氏定氮法凯氏定氮法操作（常量法）操作（常量法）氧化分解氧化分解供试品适量供试品适量置于置于500ml500ml凯氏烧瓶中凯氏烧瓶中依次加入依次加入10g 10g K K2 2SO4SO4和和0.5g 0.5g CuSOCuSO4 4粉末粉末沿瓶壁加入沿瓶壁加入20ml H20ml H2 2SOSO4 4加热至溶液加热至溶液成澄明的绿成澄明的绿色后，继续色后，继续

16、加热加热30min30min放冷，沿瓶壁放冷，沿瓶壁加加250ml250ml水，水，振摇混合振摇混合放冷，加放冷，加75ml 40% 75ml 40% NaOHNaOH溶液溶液加锌粒数粒加锌粒数粒（防爆沸）（防爆沸）用氮气球将用氮气球将凯氏烧瓶与凯氏烧瓶与冷凝管连接冷凝管连接吸收与滴定吸收与滴定取取2%2%硼酸溶液硼酸溶液50ml50ml置置500ml500ml锥形瓶中锥形瓶中加甲基红加甲基红- -溴溴甲酚绿混合指甲酚绿混合指示剂示剂1010滴滴将冷凝管下端将冷凝管下端插入硼酸溶液插入硼酸溶液的液面下的液面下轻轻摆动凯轻轻摆动凯氏烧瓶后，氏烧瓶后，加热蒸馏加热蒸馏馏出液用硫酸滴定馏出液用硫酸滴

17、定液（液（0.05mol/L0.05mol/L）滴定至溶液由蓝绿滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色色变为灰紫色将滴定的结果用将滴定的结果用空白实验校正空白实验校正以硫酸以硫酸- -硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法分析方法凯氏定氮法凯氏定氮法应用范围应用范围中中国国药药典典主主要要应应用用本本法法测测定定含含氨氨基基或或酰酰胺胺结结构构的的药药物含量；物含量；对对于于以以偶偶氮氮或或肼肼等等结结构构存存在在的的含含氮氮药药物物，因因在在消消解解过过程程中中易易于于生生成成氮氮气气而而损损失失，需需在在消消解解前前加加入入锌锌粉粉还原后再依法处理；还原后再依法处理

18、；杂杂环环中中的的氮氮，因因不不易易断断键键而而难难以以消消解解，可可用用氢氢碘碘酸酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解；或红磷还原为氢化杂环后再行消解；对对于于含含氮氮量量较较高高（10%10%）的的样样品品，可可在在消消解解液液中中加加入入少少量量多多碳碳化化合合物物，如如蔗蔗糖糖、淀淀粉粉等等作作为为还还原原剂剂，以利于氮转变为氨。以利于氮转变为氨。2.干法破坏干法破坏本本法法主主要要适适用用于于含含卤卤素素、硫硫、磷磷等等有有机机药药物物分分析析的的前前处处理理，亦亦可可用用于于某某些些药药物物中中硒硒及及砷砷盐盐的的检检查查。根根据破坏方式可分为高温炽灼法和氧瓶燃烧法。据破坏方式可分为高

19、温炽灼法和氧瓶燃烧法。高温炽灼法高温炽灼法：a)a)原理：原理：b)b)将将含含待待测测元元素素的的有有机机药药物物经经高高温温灼灼烧烧灰灰化化，使使有有机机结结构构分分解解而而到到测测元元素素转转化化为为无无机机元元素素或可溶性无机盐，以供分析。或可溶性无机盐，以供分析。b)b)应应用用范范围围：本本法法主主要要适适用用于于含含卤卤素素药药物物的的鉴鉴别别，亦亦可可用用于于含含磷磷药药物物的的定定量量测测定定和和药药物物中中砷砷盐盐的的检检查查。根根据据分分析析对对象象与与目目的的不不同同，常常加加无无水水NaNa2 2COCO3 3、MgMg（NONO3 3) )2 2、Ca(OH)Ca(

20、OH)2 2、ZnOZnO等等辅辅助灰化。助灰化。c)c)含含碘碘药药物物的的鉴鉴别别：将将适适量量样样品品置置于于坩坩锅锅中中。直直火火炽炽灼灼，或或与与无无水水NaNa2 2COCO3 3混混匀匀后后，炽炽灼灼至至紫紫色的碘蒸汽产生。色的碘蒸汽产生。d)d)含含氟氟、氯氯、溴溴等等元元素素药药物物的的鉴鉴别别：将将适适量量样样品品置置于于坩坩锅锅中中，与与无无水水NaNa2 2COCO3 3（或或NaNa2 2COCO3 3- -K K2 2COCO3 3混混合合物物）混混合合，炽炽灼灼至至完完全全灰灰化化，加加水水溶解后鉴别。溶解后鉴别。e.e.含含磷磷药药物物（如如甘甘油油磷磷酸酸钠钠

21、注注射射液液）的的定定量量测测定定：精精密密称称取取样样品品1ml1ml，置置于于瓷瓷坩坩锅锅中中，加加氧氧化化锌锌1g1g，加加热热碳碳化化后后在在600600炽炽灼灼1h1h，放放冷冷，加加水水与与盐盐酸酸个个5ml5ml，加加热热煮煮沸沸使使溶溶解解后后，用用钼钼蓝蓝比比色色法法测测定。定。f.f.砷砷盐盐的的检检查查：有有机机结结合合的的砷砷经经与与无无水水NaNa2 2COCO3 3或或Ca(OH)Ca(OH)2 2、Mg(NOMg(NO3 3) )2 2共共热热（700700）转转化化为为无无机机砷砷酸酸盐盐后后，依依法法检检查查。本本法法主主要要用用于于高高分分子子化化合合物物（

22、如如：右右旋旋糖糖酐酐铁铁）或或植植物物提提取取物物（如如：大大豆豆油油）中中砷砷盐盐的的检检查查，亦亦应应用用与与少少数数有有机机药药物物（如如吡吡罗罗昔康、布美他尼等）昔康、布美他尼等）. .氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法：a)a)原原理理：将将含含待待测测元元素素的的有有机机药药物物置置于于充充满满氧氧气气的的密密闭闭燃燃烧烧瓶瓶中中充充分分燃燃烧烧，使使有有机机结结构构部部分分彻彻底底分分解解为为COCO2 2和和H H2 2O O，而而待待测测元元素素根根据据电电负负性性的的不不同同转转化化为为不不同同的的氧氧化化物物（或或无无氧氧酸酸），被被吸吸收收于于适适当当的的吸吸收收液液中中（多多以以

23、酸酸根根离离子子形形式式存存在在）以以供供分分析析。本本法法适适用用于于含含卤卤素素或或硫硫、磷磷等等元元素素的的有有机机药药物物的的鉴鉴别别、限限度度检检查查或或含含量测定，亦可用于药物中杂质硒的检查。量测定，亦可用于药物中杂质硒的检查。b)b)仪仪器器装装置置：燃燃烧烧瓶瓶为为500ml500ml、1000ml1000ml或或2000ml2000ml的的磨磨口口、硬硬质质锥锥形形瓶瓶，瓶瓶塞塞应应严严密密，底底部部熔熔封封铂铂丝丝一一根根（直直径径：1mm1mm），铂铂丝丝下下端端做做成成网网状状或或螺螺旋旋状状，长长度度约约为为瓶瓶身身长长度度的的2/32/3。通通常常取取样样量量为为1

24、01020mg20mg，使使用用500ml500ml燃燃烧烧瓶瓶；加加大大样样 品品 取取 样样 量量 （ 200mg200mg） 时时 可可 选选 用用 1000ml1000ml或或2000ml2000ml的燃烧瓶的燃烧瓶A AF F氧瓶燃烧装置与样品包装操作图氧瓶燃烧装置与样品包装操作图c)c)吸吸收收液液的的选选择择：根根据据待待测测元元素素的的种种类类与与所所选选用用的的分分析析方方法法选选择择适适当当的的吸吸收收液液，可可使使样样品品经经燃燃烧烧分分解解所所生生成成的的不不同同价价态态的的待待测测元元素素定定量量地地被被吸吸收收并并转转变变为为单单一一价价态态，以以满满足足分分析析方

25、法的要求。方法的要求。d)d)含含氟氟药药物物一一般般选选用用茜茜素素氟氟蓝蓝比比色色法法检检查查氟氟含含量量，其其燃燃烧烧产产物物为为单单一一的的氟氟化化氢氢，可可选选用用水作为吸收液。水作为吸收液。e)e) 吸吸收收液液的的选选择择 采采用用银银量量法法测测定定含含氯氯药药物物时时，燃燃烧烧产产物物亦亦为为单单一一的的氯氯化化氢氢，但但氯氯化化氢氢在在水水中中溶溶解解度度较较低低，需用需用H H2 2O-NaOHO-NaOH溶液作为吸收液。溶液作为吸收液。采采用用银银量量法法测测定定含含溴溴药药物物时时，分分解解产产生生的的溴溴化化氢氢可可被被氧氧气气氧氧化化成成单单质质溴溴，故故其其燃燃

26、烧烧产产物物为为单单质质溴溴和和溴溴化化氢氢的的混混合合物物，可可在在H H2 2O-NaOHO-NaOH吸吸收收液液中中加加入入还还原原剂剂SOSO2 2饱饱和和溶溶液液，将将单单质质溴溴还还原为溴负离子。原为溴负离子。吸吸收收液液的的选选择择 测测定定含含碘碘药药物物时时，分分解解产产生生的的碘碘化化氢氢可可被被氧氧气气进进一一步步氧氧化化，其其燃燃烧烧产产物物主主要要为为单单质质碘碘，并并含含有有少少量量的的五五价价碘碘（HIOHIO3 3）与与一一价价碘碘（HIHI）。当当使使用用AgNOAgNO3 3滴滴定定法法测测定定含含量量时时，用用H H2 2O-NaOHO-NaOH溶溶液液-

27、SO-SO2 2饱饱和和溶溶液液作作为为吸吸收收液液，上上述述不不同同价价态态的的碘碘均均转转变变为为负负一一价价的的碘碘（NaINaI）；若若使使用用间间接接碘碘量量法法测测定定时时，用用H H2 2O-NaOHO-NaOH溶溶液液为为吸吸收收液液，此此时时吸吸收收液液中中的的待待测测物物转转变变为为碘碘酸酸钠钠（NaIONaIO3 3）与与碘碘化化钠钠，可可用用溴溴- -醋醋酸酸溶溶液液将将其其氧氧化化为为同同一一价价态态，即即HIOHIO3 3后后，再再加加KIKI使使之之定定量量生生成成单单质质碘，再用硫代硫酸钠滴定生成的碘。碘，再用硫代硫酸钠滴定生成的碘。吸吸收收液液的的选选择择 含

28、含硫硫药药物物的的燃燃烧烧产产物物主主要要为为SOSO3 3，可可用用浓浓H H2 2O O2 2与与水水的的混混合合液液作作为为吸吸收收液液，燃燃烧烧产产物物经经吸吸收收转转变变为为H H2 2SOSO4 4，加加入入盐盐酸酸溶溶液液并并煮煮沸沸除除去去剩剩余余的的过过氧氧化化氢氢后后，加加入入BaClBaCl2 2，使使硫硫酸酸生生成成BaSOBaSO4 4，以重量法测定含量。，以重量法测定含量。含含磷磷药药物物（有有机机膦膦酸酸类类）的的燃燃烧烧产产物物为为P P2 2O O5 5，以以水水为为吸吸收收液液，加加入入少少量量硝硝酸酸溶溶液液并并经经煮煮沸沸使使焦焦磷磷酸酸（H H4 4P

29、 P2 2O O7 7）和和偏偏磷磷酸酸(HPO(HPO3 3)n)n转转化化为为磷酸后，采用钼蓝比色法测定含量。磷酸后，采用钼蓝比色法测定含量。硒硒化化合合物物在在有有机机燃燃烧烧分分解解的的同同时时转转化化为为SeOSeO2 2（含含有有少少量量的的SeOSeO3 3），经经硝硝酸酸溶溶液液（130130）吸吸收收后后转转变变为为硒硒酸酸（H H2 2SeOSeO4 4），再再用用二二氨氨基基奈奈比色法测定。比色法测定。吸吸收收液液的的选选择择 d)d)操作法：操作法：燃燃烧烧瓶瓶内内加加入入规规定定的的吸吸收收液液瓶口用水湿润瓶口用水湿润小小心心急急速速通通入入氧氧气后盖上表面皿气后盖上

30、表面皿点点燃燃包包有有供供试试品品的的滤滤纸纸，迅迅速速放放入燃烧瓶中入燃烧瓶中按按紧紧瓶瓶塞塞，用用少少量量水水封封闭瓶口闭瓶口俟燃烧完毕后充分俟燃烧完毕后充分振摇，使生成的烟振摇，使生成的烟雾完全吸收雾完全吸收用少量水冲洗瓶用少量水冲洗瓶塞和铂丝，合并塞和铂丝，合并洗液和吸收液洗液和吸收液用用同同法法另另作作空白实验空白实验依依法法进进行行鉴鉴别别、检查或含量测定检查或含量测定例：例：碘苯碘苯酯的含量测定酯的含量测定本本品品主主要要为为10-10-对对碘碘苯苯基基十十一一酸酸乙乙酯酯与与邻邻、间间位位的的碘碘苯基十一酸乙酯的混合物。苯基十一酸乙酯的混合物。碘苯酯碘苯酯I精精密密称称定定本本

31、品约品约20mg20mg照照氧氧瓶瓶燃燃烧烧法法进行有机破坏进行有机破坏吸吸收收液液：2ml2ml氢氢氧氧化钠试液化钠试液+10ml+10ml水水吸吸收收完完全全后后，加加10ml10ml溴溴- -醋酸溶液醋酸溶液密密塞塞，振振摇摇，放放置置数数分分钟钟，加甲酸约加甲酸约1ml1ml用水洗涤瓶口，用水洗涤瓶口，通空气通空气3 35 5分钟分钟除去剩余除去剩余BrBr蒸汽蒸汽加加碘碘化化钾钾2g2g，密塞，摇匀密塞，摇匀用用NaNa2 2S S2 2O O3 3（0.02mol/L0.02mol/L）滴滴定定，指指示示剂剂：淀淀粉粉；结果用空白实验校正结果用空白实验校正测定方法测定方法IO O2

32、 2/ /燃烧燃烧I I2 2(HIO(HIO3 3、HIOHIO、HI)HI)I2 + 2NaOHNaIO + NaI + H2O3NaIONaIO3 + 2NaI3Br2 + I- + 3H2OIO3- + 6HBrBr2 （过量的过量的）+ HCOOH2HBr + CO2IO3- + 5I- + 6H+3I2+ 3H2OOHOH- -I2 + 2Na2S2O32NaI + Na2S4O61.1.氧瓶燃烧法中的装置和材料有氧瓶燃烧法中的装置和材料有（）（）A. A. 磨口硬质玻璃锥形瓶磨口硬质玻璃锥形瓶B. B. 磨口软质玻璃锥形瓶磨口软质玻璃锥形瓶C. C. 铂丝铂丝D. D. 铁丝铁丝

33、E. E. 无灰滤纸无灰滤纸F. F. 铝丝铝丝自测题自测题2. 氧瓶燃烧法可用于氧瓶燃烧法可用于A. A. 含卤素有机药物的含量测定含卤素有机药物的含量测定B. B. 醚类药物的含量测定醚类药物的含量测定C. C. 检查甾体激素类药物中的氟检查甾体激素类药物中的氟D. D. 检查甾体激素类药物中的硒检查甾体激素类药物中的硒E. E. 芳酸类药物的含量测定芳酸类药物的含量测定3.3.氧氧瓶瓶燃燃烧烧法法测测定定含含氯氯有有机机药药物物时时所所用用的吸收液多数为（）的吸收液多数为（）3.3.A. HA. H2 2O O2 2溶液溶液4.4.B. HB. H2 2O O2 2- -NaOHNaOH

34、溶液溶液5.5.C. C. NaOHNaOH溶液溶液6.6.D D硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液7.7.E. E. NaOHNaOH- -硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液第二节第二节 定量分析法的特点定量分析法的特点一、容量分析法一、容量分析法容容量量分分析析法法（也也称称滴滴定定法法），是是将将已已知知浓浓度度的的标标准准物物质质溶溶液液（滴滴定定液液）滴滴定定被被测测药药物物溶溶液液，直直至至滴滴定定液液与与被被测测药药物物反反应应完完全全（通通过过适适当当方方法法指指示示），根根据据滴滴定定液液的的浓浓度度和和消消耗耗的的体体积积，按按化化学学计计量量关关系系计计算算出出被被测测药药物物的的含量。含量

35、。1.容量分析法的特点容量分析法的特点在在容容量量分分析析法法中中，常常需需借借助助指指示示剂剂的的颜颜色色改改变变来来判判断断滴滴定定终终点点的的到到达达。但但滴滴定定终终点点与与反反应应的的化化学学计计量量点点不不一一定定恰恰好好符符合合，二二者者之之差差称称为为滴滴定定误误差差，是是容容量量分分析析误误差差的的来来源源之之一一，为为了了减减少少滴滴定定误误差差，需需要要选择合适的指示剂。选择合适的指示剂。容容量量分分析析法法所所用用仪仪器器价价廉廉易易得得，操操作作简简便便、快快捷捷，方方法法耐耐用用性性高高，测测定定结结果果准准确确（通通常常相相对对误误差差0.2%100100）；）；

36、100100：浓度换算因素，将：浓度换算因素，将g/100mlg/100ml换算成换算成g/mlg/ml。c.c.显显色色法法: :当当供供试试品品在在紫紫外外- -可可见见光光区区没没有有强强吸吸收收，或或虽虽有有吸吸收收，但但为为了了避避免免干干扰扰或或提提高高灵灵敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。2.2.荧光分析法荧光分析法利用荧光强度与溶液中发射荧光的物质的浓度成正利用荧光强度与溶液中发射荧光的物质的浓度成正比关系进行定量分析。比关系进行定量分析。特点特点a.a.灵敏度高（灵敏度高（1010-10-101010-12-12g/mlg/ml）b.

37、b.适用与低浓度溶液（浓度太高可致适用与低浓度溶液（浓度太高可致“自熄灭自熄灭”）c.c.对对易易被被光光分分解解的的样样品品，需需使使用用基基准准溶溶液液代代替替对照品溶液校正仪器的灵敏度。对照品溶液校正仪器的灵敏度。d.d.能能产产生生荧荧光光的的物物质质较较少少，常常需需使使用用荧荧光光衍衍生生试剂得到强荧光，以提高灵敏度和选择性。试剂得到强荧光，以提高灵敏度和选择性。干扰因素的排除干扰因素的排除a.a.溶剂：溶剂：溶剂不纯会带来较大误差，蒸馏后再溶剂不纯会带来较大误差，蒸馏后再使用。使用。b.b.溶液：溶液：悬浮物对光有散射作用，悬浮物对光有散射作用，过滤或离心过滤或离心除去；溶解氧有

38、降低荧光的作用，通入惰性除去；溶解氧有降低荧光的作用，通入惰性气体除氧。气体除氧。c.c.玻璃仪器：玻璃仪器：玻璃仪器和测定池应高度洁净。玻璃仪器和测定池应高度洁净。d.d.温度：温度：温度对荧光强度有较大影响，需控制温度对荧光强度有较大影响，需控制温度。温度。测定法测定法C CX X：供试品溶液的浓度：供试品溶液的浓度C Cr r：对照品溶液的浓度：对照品溶液的浓度R RX X：供试品溶液的荧光强度：供试品溶液的荧光强度R Rr r：对照品溶液的荧光强度：对照品溶液的荧光强度R RXbXb：供试品溶液试剂空白的荧光强度：供试品溶液试剂空白的荧光强度R Rrbrb：对照品溶液试剂空白的荧光强度

39、：对照品溶液试剂空白的荧光强度3.3.色谱分析法色谱分析法利利用用混混合合物物中中各各组组分分在在吸吸附附剂剂上上的的吸吸附附能能力力的的不不同同或或在在两两相相中中的的分分配配系系数数的的不不同同，先先行行分分离离后后再再在在线线对各组分逐一进行分析。对各组分逐一进行分析。高效液相色谱法：高效液相色谱法：l灵敏度高（灵敏度高（1010-12-121010-15-15g/mlg/ml）l高选择性高选择性l高效能高效能l高速度高速度l应用广泛应用广泛a.a.对仪器的一般要求对仪器的一般要求b.b.色色谱谱柱柱填填充充剂剂：十十八八烷烷基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶、辛辛基基（或或氨氨基基、氰氰基基

40、）硅硅烷烷键键和和硅硅胶胶、离离子子交交换换剂剂（离离子子交交换换色色谱谱）、凝凝胶胶或或高高分分子子多多孔微球（分子排阻色谱）；孔微球（分子排阻色谱）；十十八八烷烷基基硅硅烷烷键键合合硅硅胶胶（C C1818）固固定定相相：甲甲醇醇- -水水、乙乙腈腈、缓缓冲冲液液、反反离离子子物物质质等等可可为为流流动动相相。但但流流动动相相中中有有机机溶溶剂剂不不应应5%99.599.5) )或或对对照照品品考考察察方方法法的的精精密密度度，相相对对标标准准差差：0.20.2；回回收收率率：99.799.7100.3100.3。 UVUV法法用用适适当当浓浓度度的的精精制制品品进进行行测测定定，RSDR

41、SD1 1；制制剂剂的的测测定定，回回收收率率：9898102102；吸吸光光度度A A：0.20.20.70.7；浓浓度度点点：n n5 5。用用浓浓度度c c 对对A A 作作线线性性回回归归处处理理，得一直线方程，得一直线方程，r r0.999(0.999(n n5)5)，方程截距应近零。，方程截距应近零。各种含量测定方法对效能指标的要求各种含量测定方法对效能指标的要求HPLCHPLC法法RSD2RSD0.9990.999，截距应趋于零，截距应趋于零; ;专专属属性性：要要考考查查辅辅料料、有有关关物物质质或或降降解解产产物物对对主主药药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除的色谱峰是否

42、有干扰，如有干扰应设法排除. .各种含量测定方法对效能指标的要求（续）各种含量测定方法对效能指标的要求（续）1.1.精密度是指（）精密度是指（）A.A.测得的测量值与真值接近的程度测得的测量值与真值接近的程度B.B.测得的一组测量值彼此符合的程度测得的一组测量值彼此符合的程度C.C.表示该法测量的正确性表示该法测量的正确性D.D.在在各各种种正正常常试试验验条条件件下下，对对同同一一样样品品分分析所得结果的准确程度析所得结果的准确程度E.E.对供试物准确而专属的测定能力对供试物准确而专属的测定能力自测题自测题2.2.药物杂质检查所要求的效能指标为（）药物杂质检查所要求的效能指标为（） A. A

43、. 准确度准确度 B. B. 精密度精密度 C C选择性选择性 D. D. 检测限检测限 E. E. 耐用性耐用性 3.3.精密度的一般表示方法有精密度的一般表示方法有( ( ) )3.3.A. A. 相对标准差相对标准差4.4.B. B. 相对平均偏差相对平均偏差5.5.C. C. 相对误差相对误差6.6.D. D. 绝对误差绝对误差7.7.E. E. 标准差标准差 4.4.检测限的表示方法有（）检测限的表示方法有（）4.4.A. A. 百分数百分数 5.5.B. B. ppmppm 6.6.C. ppbC. ppb7.7.D. g D. g 8.8.E. E. ngng5.5.用用信信噪噪

44、比比法法表表示示检检测测限限时时，信信噪噪比比一一般应为（）般应为（）A. 1A. 11 1 B. 3B. 31 1C. 4C. 41 1 D. 5D. 51 16.6.用用碘碘量量法法测测定定维维生生素素C C原原料料药药时时，要要求碘量法应具备（）求碘量法应具备（）A. A. 选择性选择性 B. B. 定量限定量限C. C. 精密度精密度 D. D. 检测限检测限E. E. 线性线性7.7.测测定定药药物物片片剂剂的的溶溶出出度度或或释释放放度度时时，对所用测定方法应要求对所用测定方法应要求( ( ) )A. A. 精密度精密度 B. B. 定量限定量限C. C. 耐用性耐用性 D. D.

45、 回收率回收率E. E. 检测限检测限 8.8.药物鉴别试验所要求的效能指标（）药物鉴别试验所要求的效能指标（）A. A. 准确度准确度B. B. 精密度精密度C. C. 选择性选择性D. D. 检测限检测限E. E. 耐用性耐用性第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏一、常用样品的种类、采集和贮藏生生物物样样品品包包括括各各种种体体液液和和组组织织。在在体体内内药药物物分析中常用的是血液、尿液和唾液。分析中常用的是血液、尿液和唾液。1.血样血样2.包包 括括 血血 浆浆 、 血血 清清 和和 全全 血血 。 其其 中中 血血 浆浆（p

46、lasmaplasma）和血清（）和血清（serumserum）为常用生物样品。）为常用生物样品。3.3.测测定定血血中中的的药药物物浓浓度度通通常常是是指指测测定定血血浆浆或或血清中的药物浓度，而非全血中的药物浓度。血清中的药物浓度，而非全血中的药物浓度。供供测测定定用用血血样样的的采采集集：动动物物实实验验时时，可可从从动动脉脉或或心心脏脏取取血血；对对与与患患者者或或志志愿愿者者，采采取取静静脉脉血血（或或用毛细管采血）。用毛细管采血）。血血浆浆的的制制备备：将将采采取取全全血血置置于于含含有有抗抗凝凝剂剂（如如肝肝素素、草草酸酸盐盐、EDTAEDTA等等）的的试试管管中中，混混匀匀后后

47、，以以250025003000r/min3000r/min离离心心5min5min使使血血浆浆与与血血细细胞胞分分离离，上清液为血浆。上清液为血浆。血血清清的的制制备备：将将采采取取全全血血在在室室温温下下放放置置0.50.51 1小小时时，待待血血液液凝凝固固后后，用用细细玻玻棒棒剥剥离离血血饼饼，以以200020003000r/min3000r/min离心离心5 510min10min，上清液为血清。，上清液为血清。药药物物与与纤纤维维蛋蛋白白几几乎乎不不结结合合，血血浆浆与与血血清清中中的的药药物物浓浓度度测测定定值值通通常常是是相相同同的的。但但血血浆浆比比血血清清分分离离快，且制取的

48、量多，所以血浆较血清更常用。快，且制取的量多，所以血浆较血清更常用。血血样样采采取取后后，应应及及时时分分离离血血浆浆或或血血清清，并并立立即即进进行行分分析析。如如不不能能立立即即测测定定，应应置置于于具具塞塞硬硬质质玻玻璃璃管或聚乙烯塑料离心管中密塞保存。管或聚乙烯塑料离心管中密塞保存。短短期期保保存存时时，可可置置于于冰冰箱箱冷冷藏藏（4 4C C）；长长期期保保存需在存需在-20-20C C或或-80-80C C下冷冻贮藏。下冷冻贮藏。2.唾液唾液由由腮腮腺腺、额额下下腺腺、舌舌下下腺腺和和口口腔腔粘粘膜膜内内腺腺体体分分泌泌液液混混合合组组成成的的。口口腔腔粘粘膜膜受受化化学学刺刺激

49、激，各各唾唾液液腺腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变化。的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变化。唾唾液液的的采采集集：在在安安静静状状态态下下进进行行，漱漱口口后后1515分分钟钟收收集集；采采集集后后立立即即除除去去泡泡沫沫，并并以以3000r/min3000r/min离离心心1010分钟，取上清液分析。分钟，取上清液分析。若若分分泌泌量量少少，可可转转动动舌舌尖尖促促进进唾唾液液分分泌泌，也也可可采采用用物物理理的的（如如嚼嚼石石蜡蜡）或或化化学学的的（如如酒酒石石酸酸）方方法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。唾液采集后，应在

50、唾液采集后，应在4 4C以下保存。以下保存。3.尿液尿液其其主主要要成成分分：水水、含含氮氮化化合合物物（大大部部分分为为尿尿素素）及盐类。及盐类。体体内内药药物物（原原型型或或代代谢谢物物及及其其缀缀合合物物）的的清清除除主主要通过尿液排出。要通过尿液排出。尿尿液液中中药药物物浓浓度度高高，采采集集方方便便、且且采采集集量量大大。但但尿尿液液浓浓度度变变化化较较大大。尿尿液液中中药药物物浓浓度度的的改改变变不不能能直接反应血药中的浓度。直接反应血药中的浓度。尿尿液液测测定定主主要要用用于于药药物物剂剂量量回回收收，尿尿清清除除率率、生生物物利利用用度度、以以及及药药物物代代谢谢及及其其代代谢

51、谢途途径径、类类型型、速率等的研究。速率等的研究。采集的尿液是自然排尿。采集的尿液是自然排尿。测测定定尿尿中中药药物物的的总总量量时时，应应收收集集用用药药后后的的一一定定时时间间内内（如如8h8h、12h12h或或24h24h）排排泄泄的的全全部部尿尿液液，记记录录体体积积后后，量量取取一一部部分分用用于于药药物物浓浓度度的的测测定定，在在乘乘以尿量求得排泄总量。以尿量求得排泄总量。肾功能不良者不宜采集尿样。肾功能不良者不宜采集尿样。尿尿液液采采集集后后应应立立即即测测定定，否否则则应应加加入入防防腐腐剂剂后后置置于冰箱中保存。于冰箱中保存。常常用用防防腐腐剂剂：甲甲苯苯、二二甲甲苯苯、三三

52、氯氯甲甲烷烷，以以及及醋醋酸、盐酸等。酸、盐酸等。二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术生生物物样样品品的的前前处处理理应应主主要要考考虑虑生生物物样样品品的的种种类、被测药物的性质和所采用的测定方法。类、被测药物的性质和所采用的测定方法。依据生物样品类型：依据生物样品类型：l血血浆浆或或血血清清需需除除蛋蛋白白，使使药药物物从从蛋蛋白白结结合合物物中释出。中释出。l唾液样品应采用离心去除粘蛋白。唾液样品应采用离心去除粘蛋白。l尿尿液液样样品品常常采采用用酸酸或或酶酶水水解解药药物物使使从从缀缀和和物物中释出。中释出。 依据被测药物的结构及性质，以及存在形式：依据被测药物的结构及

53、性质，以及存在形式：l药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。l是是否否具具有有挥挥发发性性涉涉及及能能否否采采用用气气相相色色谱谱法法测测定。定。l光光谱谱特特性性及及官官能能团团性性质质涉涉及及是是否否需需要要制制成成衍衍生物。生物。l浓浓度度大大的的样样品品对对前前处处理理要要求求低低，浓浓度度越越低低的的样品对前处理要求越高，样品对前处理要求越高， 依据所采用的测定方法：依据所采用的测定方法：l纯纯化化程程度度与与所所采采用用的的测测定定方方法法的的专专属属性性、检检测系统对不纯样品污染的程度密切相关。测系统对不纯样品污染的程度密切相关。l放放射

54、射免免疫疫测测定定法法具具有有较较高高的的灵灵敏敏度度和和专专属属性性，生生物物样样品品只只需需经经初初步步处处理理除除去去主主要要干干扰扰物物即即可测定。可测定。l高高效效液液相相色色谱谱法法要要求求除除去去生生物物样样品品中中的的蛋蛋白白质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。1.蛋白质的去除蛋白质的去除原因：原因：l除除去去蛋蛋白白质质可可使使蛋蛋白白质质结结合合型型的的药药物物释释放放出出来。来。l避免溶剂萃取过程中的乳化现象。避免溶剂萃取过程中的乳化现象。l保保护护仪仪器器性性能能（如如保保护护HPLCHPLC柱柱不不被被玷玷污污），延长使用寿命。

55、延长使用寿命。2.2.方法：方法：加入与水混融的有机溶剂加入与水混融的有机溶剂l有有机机溶溶剂剂使使蛋蛋白白质质凝凝聚聚，释释放放与与之之结结合合的的药物。药物。l常常用用有有机机溶溶剂剂：乙乙腈腈、甲甲醇醇、丙丙酮酮、四四氢氢呋喃。呋喃。l含含药药物物的的血血浆浆与与有有机机溶溶剂剂的的体体积积为为1:1:(1(13)3)时，可除去时，可除去90%90%以上的蛋白质。以上的蛋白质。加入中性盐加入中性盐l中中性性盐盐使使溶溶液液离离子子强强度度发发生生变变化化，将将与与蛋蛋白白质质结结合合的的水水置置换换出出来来，使使蛋蛋白白质质脱脱水水而而沉淀。沉淀。l常常用用中中性性盐盐：饱饱和和硫硫酸酸

56、铵铵、硫硫酸酸钠钠、镁镁盐盐、磷酸盐及枸橼酸盐磷酸盐及枸橼酸盐加入强酸加入强酸l当当溶溶液液的的pHpH低低于于蛋蛋白白质质的的等等电电点点时时，以以阳阳离离子子形形式式存存在在的的蛋蛋白白质质可可与与酸酸根根离离子子形形成成不溶性盐而沉淀析出。不溶性盐而沉淀析出。l含含药药物物血血清清与与强强酸酸比比例例为为1:0.61:0.6混混合合，可可除除去去90%90%以上蛋白质。以上蛋白质。l常常用用强强酸酸：10%10%三三氯氯醋醋酸酸、65%65%高高氯氯酸酸、5%5%偏磷酸。偏磷酸。l过过量量的的三三氯氯醋醋酸酸经经加加热热分分解解为为三三氯氯甲甲烷烷和和二氧化碳而除去。二氧化碳而除去。l过

57、过量量的的高高氯氯酸酸可可用用碳碳酸酸钾钾、醋醋酸酸钾钾、氢氢氧氧化化钠钠等等中中和和后后，加加乙乙醇醇使使之之生生成成高高氯氯酸酸钾钾（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂l当当pH高高于于蛋蛋白白质质的的等等电电点点时时，蛋蛋白白质质分分子子中中带带负负电电荷荷的的羧羧基基与与金金属属阳阳离离子子形形成成不不溶溶性盐而沉淀性盐而沉淀。l含药物血清与沉淀剂比例为含药物血清与沉淀剂比例为1:21:2混合。混合。l常用沉淀剂：常用沉淀剂：CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4、ZnSOZnSO4

58、 4-NaOH-NaOH。酶解法酶解法l测测定定某某些些与与蛋蛋白白质质结结合合牢牢固固、且且对对酸酸不不稳稳定定的的药药物物时时，需需用用酶酶解解法法使使蛋蛋白白质质分分解解而而释放出药物。释放出药物。l常常用用酶酶：枯枯草草菌菌溶溶素素（适适用用pHpH：7.07.011.011.0，温度：，温度：50506060C ）。）。2.缀合物的水解缀合物的水解原因：原因：l含含羟羟基基、羧羧基基、氨氨基基和和巯巯基基的的药药物物可可与与内内源源性性物物质质葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸或或硫硫酸酸形形成成葡葡萄萄糖糖酸酸酐酐或或硫酸酯缀合物。硫酸酯缀合物。l缀缀合合物物较较原原型型药药物物具具有有较较大大

59、的的极极性性，不不易易被被有机溶剂萃取。有机溶剂萃取。l尿尿中中药药物物多多数数呈呈缀缀合合物物状状态态，测测定定之之前前，需需将缀合物中的药物释放出来。将缀合物中的药物释放出来。方法：方法：l酸水解：加入适量的盐酸溶液进行水解。酸水解：加入适量的盐酸溶液进行水解。l酶水解酶水解遇酸及受热不稳定的药物，可用酶水解；遇酸及受热不稳定的药物，可用酶水解；酶酶水水解解具具有有较较高高的的选选择择性性、很很少少使使被被测测药药物发生降解，常被优先采用；物发生降解，常被优先采用；常用葡萄酸酐酶或硫酸酯酶或二者混合物；常用葡萄酸酐酶或硫酸酯酶或二者混合物；但但酶酶水水解解时时间间长长、酶酶制制剂剂带带入入

60、的的粘粘液液蛋蛋白白可能导致乳化及污染色谱柱。可能导致乳化及污染色谱柱。3.有机破坏有机破坏l生生物物样样品品中中的的金金属属离离子子常常与与蛋蛋白白结结合合且且难难以以用溶剂萃取，同时金属离子可耐受高温。用溶剂萃取，同时金属离子可耐受高温。l测测定定生生物物样样品品中中金金属属离离子子时时，多多采采用用有有机机破破坏方法进行前处理。坏方法进行前处理。l常常用用HNOHNO3 3-HClO-HClO4 4作作为为消消解解剂剂，其其破破坏坏能能力力强强，适适用用与与各各种种生生物物样样品品。所所得得金金属属离离子子一一般般为为高价态。高价态。l仪器常用硅玻璃和磞玻璃制成的凯氏烧瓶。仪器常用硅玻璃

61、和磞玻璃制成的凯氏烧瓶。4.分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集生生物物样样品品中中的的药药物物浓浓度度较较低低或或分分析析方方法法的的特特异异性性或或灵灵敏敏度度不不够够高高时时，生生物物样样品品需需进进行行分分离离、纯纯化化与浓集处理。与浓集处理。液液- -液萃取法液萃取法l多多数数药药物物是是亲亲酯酯性性的的，而而血血样样或或尿尿样样中中的的多多数数内内源源性性干干扰扰物物是是强强极极性性的的水水溶溶性性物物质质。有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。l有有机机溶溶剂剂的的要要求求：对对被被测测药药物物的的溶溶解解度度大大、沸沸点点低低、易易于于挥挥发发浓浓集集、与

62、与水水不不相相混混溶溶、无毒、不易乳化。无毒、不易乳化。l常用有机溶剂：乙醚和三氯甲烷常用有机溶剂：乙醚和三氯甲烷l有机溶剂相与水相的容积比为有机溶剂相与水相的容积比为1:11:1或或2:12:1。l多多数数药药物物是是亲亲酯酯性性的的碱碱性性物物质质，而而生生物物样样品品中中的的内内源源性性物物质质多多数数是是酸酸性性的的，生生物物样样品中的药物一般在碱性下萃取。品中的药物一般在碱性下萃取。l对对碱碱性性pHpH不不稳稳定定的的药药物物，可可在在近近中中性性pHpH处处用三氯甲烷和异丙醇萃取。用三氯甲烷和异丙醇萃取。l中性药物则在中性药物则在pH=7pH=7附近萃取。附近萃取。液液- -固萃

63、取法固萃取法将将具具有有吸吸附附、分分配配及及离离子子交交换换性性质质的的、表表面面积积大大的的担担体体作作为为萃萃取取剂剂填填入入小小柱柱，以以溶溶剂剂淋淋洗洗后后，将将生生物物样样品品通通过过，使使其其药药物物或或内内源源性性干干扰扰物物保保留留在在担担体体上上，用用适适当当的的溶溶剂剂洗洗去去干扰物后，再用适当的溶剂将药物洗脱下来。干扰物后，再用适当的溶剂将药物洗脱下来。 优优点点：较较少少引引入入杂杂质质、消消除除了了乳乳化化现现象象、萃萃取取效效率率高高、处处理理样样品品速速度度快快，在在室室温温下下操操作、适于处理挥发性及对热不稳定的药物。作、适于处理挥发性及对热不稳定的药物。担担

64、体体：亲亲水水性性的的硅硅藻藻土土、疏疏水水性性的的活活性性炭炭、聚苯乙烯或聚苯乙烯或C C1818化学键合硅胶。化学键合硅胶。浓集浓集a.a.末次少量溶剂萃取法末次少量溶剂萃取法b.b.在在末末次次萃萃取取时时加加入入的的萃萃取取液液尽尽量量少少，使使被被测测组组分分萃萃取取到到小小体体积积溶溶剂剂中中，然然后后直直接吸取适量供测定。接吸取适量供测定。b.b.挥发萃取溶剂法。挥发萃取溶剂法。l避避免免直直接接加加热热，防防止止被被测测组组分分破破坏坏或或挥挥发损失。发损失。l挥挥发发萃萃取取溶溶剂剂的的常常用用方方法法是是直直接接通通入入氮氮气流吹干。气流吹干。l对对与与易易随随气气流流挥挥

65、发发或或遇遇热热不不稳稳定定的的药药物物，可用减压法挥发溶剂。可用减压法挥发溶剂。l溶溶剂剂蒸蒸发发所所用用试试管管，底底部部应应为为尖尖锥锥形形，便于最终量取。便于最终量取。5.化学衍生化化学衍生化药药物物中中含含有有活活泼泼H H者者（如如 -COOH-COOH、-OH-OH、-NH-NH2 2、- -NH-NH-、-SH-SH）均均可可被被化化学学衍衍生生化化。生生物物样样品品经经化化学学衍生化在进行分离的目的：衍生化在进行分离的目的：l使样品中的药物转变成具可被分离的性质使样品中的药物转变成具可被分离的性质l提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度l增强药物的稳定性增强药物的稳定性l提高对光学

66、异构体分离的能力提高对光学异构体分离的能力GCGC中化学衍生化中化学衍生化l衍衍生生化化可可使使药药物物分分子子中中的的极极性性基基团团，如如羟羟基基、氨氨基基、羧羧基基等等变变成成无无极极性性的的、易易于于挥挥发的药物，从而降低发的药物，从而降低GCGC温度。温度。l主要衍生化反应：烷基化、酰化、硅烷化。主要衍生化反应：烷基化、酰化、硅烷化。l常常用用烷烷基基化化试试剂剂：碘碘庚庚烷烷、叠叠氮氮甲甲烷烷、氢氢氧化三甲基苯胺（氧化三甲基苯胺（TMAHTMAH）等。）等。l常用酰化试剂：已酸酐、丙酸酐等。常用酰化试剂：已酸酐、丙酸酐等。l常常用用硅硅烷烷化化试试剂剂：三三甲甲基基氯氯硅硅烷烷（T

67、MCSTMCS）、双双- -三三甲甲基基硅硅烷烷乙乙酰酰胺胺（BSABSA）、双双- -三三甲甲基基硅硅烷烷三三氟氟乙乙酰酰胺胺（BSTFABSTFA）、三三甲甲基基硅硅烷烷咪咪唑（唑（TMTSTMTS）。）。HPLCHPLC中化学衍生化中化学衍生化l衍衍生生化化目目的的：使使在在没没有有紫紫外外可可见见吸吸收收或或吸吸收收系系数数较较小小的的药药物物生生成成有有强强吸吸收收的的衍衍生生物物，从而提高药物的检测灵敏度。从而提高药物的检测灵敏度。lHPLCHPLC常常用用衍衍生生化化试试剂剂：邻邻苯苯二二醛醛、丹丹酰酰氯氯、荧胺等。荧胺等。l采采用用不不对对称称试试剂剂使使光光学学异异构构体体生

68、生成成非非对对映映异构体衍生物，然后用异构体衍生物，然后用HPLCHPLC测定。测定。l常常用用不不对对称称试试剂剂( (S S）- -N N- -三三氟氟乙乙酰酰脯脯氨氨酰酰氯氯、 ( (S S）- -N N- -五氟乙酰脯氨酰氯等。五氟乙酰脯氨酰氯等。三、定量分析方法的验证三、定量分析方法的验证生生物物样样品品取取样样量量少少、药药物物浓浓度度低低、内内源源性性物物质质干干扰扰及及个个体体差差异异等等多多种种因因素素影影响响生生物物样样品品测测定定，必必须建立生物样品分析方法，并对其进行验证。须建立生物样品分析方法，并对其进行验证。1.特异性特异性2.必必须须证证明明所所测测定定的的物物质

69、质是是原原型型药药物物或或特特定定的的活活性性代代谢谢物物，内内源源性性物物质质和和相相应应代代谢谢物物不不得得干干扰测定。扰测定。3.3.对对于于色色谱谱法法，至至少少提提供供6 6个个不不同同来来源源的的空空白白生生物物样样品品色色谱谱图图、空空白白生生物物样样品品外外加加标标准准物物质质色色谱图及用药后的生物样品色谱图。谱图及用药后的生物样品色谱图。2.标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围l必必须须用用至至少少6 6个个浓浓度度建建立立标标准准曲曲线线，应应使使用用与与待待测样品相同的生物介质。测样品相同的生物介质。l建建立立标标准准曲曲线线时时应应随随行行空空白白生生物物样样品品，但但

70、标标准准曲曲线不包括零点。线不包括零点。l线线性性范范围围要要能能覆覆盖盖全全部部待待测测浓浓度度，不不允允许许外外推推未未知样品的浓度。知样品的浓度。l标标准准曲曲线线上上各各浓浓度度点点的的偏偏差差的的可可接接受受范范围围一一般般规规定定为为：最最低低浓浓度度点点的的偏偏差差在在20%20%以以内内，其其余余各各浓度偏差在浓度偏差在15%15%以内以内. .l只有合格的标准曲线才能对临床样品进行计算。只有合格的标准曲线才能对临床样品进行计算。3.精密度与准确度精密度与准确度l选选择择高高、中中、低低3 3个个浓浓度度的的质质控控样样品品同同时时进进行行方方法的精密度和准确度验证。法的精密度

71、和准确度验证。l低低浓浓度度在在定定量量下下限限的的3 3倍倍以以内内，高高浓浓度度接接近近定定量量上限，中间选一浓度，每一浓度至少上限，中间选一浓度，每一浓度至少5 5个样品。个样品。l精精密密度度用用样样品品批批内内和和批批间间RSDRSD表表示示， RSDRSD一一般般应应小于小于15%15%，在定量下限，在定量下限RSD RSD 附近应小于附近应小于20%20%。l测测定定批批内内RSDRSD，每每一一浓浓度度至至少少5 5个个样样品品；测测定定批批间间RSDRSD应在不同天连续测定应在不同天连续测定3 3批，至少批，至少4545个样品。个样品。l准准确确度度一一般般应应在在85%85

72、%115%115%范范围围内内，在在定定量量下下限限附近应在附近应在8080120%120%范围内。范围内。4.定量下限定量下限l定定量量下下限限至至少少能能满满足足测测定定3 35 5个个半半衰衰期期时时样样品品中中的的药药物物浓浓度度，或或C Cmaxmax的的1/101/101/201/20时时的的药药物浓度，且准确度应在真实值的物浓度，且准确度应在真实值的80%80%120%120%内。内。lRSD RSD 应小于应小于20%20%，S/N S/N 应大于应大于5.5.l应由至少应由至少5151个标准样品测试结果证明。个标准样品测试结果证明。5.样品稳定性样品稳定性对对含含药药生生物物

73、样样品品在在室室温温、冰冰冻冻、冻冻融融条条件件下下以以及及不不同同存存放放时时间间进进行行稳稳定定性性考考察察，以以确确定定生生物物样样品品存存放放时时间间和和条条件件。注注意意考考察察储储备备液液的的稳稳定定性性以以及及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。样品处理后的溶液中分析物的稳定性。6.提取回收率提取回收率应应考考察察高高、中中、低低3 3个个浓浓度度的的提提取取回回收收率率。其其结结果应一致、精密和可重现。果应一致、精密和可重现。7.7.质控样品质控样品8.8.系系将将已已知知量量的的待待测测药药物物加加入入到到生生物物介介质质中中配制的样品，用于质量控制。配制的样品，用于质量控制。

74、8.8.质量控制质量控制9.9.在在分分析析方方法法确确证证后后开开始始测测试试未未知知生生物物样样品品，每个样品一般测定一次，必要时进行重复。每个样品一般测定一次，必要时进行重复。10.10.每每个个分分析析批批应应建建立立相相应应的的标标准准曲曲线线，并并随随行行测测定定高高、中中、低低3 3个个浓浓度度的的QCQC样样品品，每每浓浓度度至至少少2 2样本。样本。若若一一个个分分析析批批中中未未知知样样品品较较多多，应应增增加加各各浓浓度度的的QCQC样品数，使样品数，使QCQC样品数大于未知样品总数的样品数大于未知样品总数的5%5%。QCQC样样品品测测定定结结果果的的可可接接受受标标准

75、准为为：偏偏差差应应小小于于15%15%，低低浓浓度度点点偏偏差差小小于于20%20%，最最多多允允许许1/31/3不不在在同一浓度的同一浓度的QCQC样品结果超限。样品结果超限。如如QCQC样样品品测测定定结结果果不不符符合合要要求求，该该分分析析批批未未知知样样品测试结果作废。品测试结果作废。浓浓度度高高于于定定量量上上限限的的未未知知生生物物样样品品，应应采采用用相相应应的空白介质稀释后重新测定。的空白介质稀释后重新测定。9.测定结果测定结果应详细描述所用的分析方法；应详细描述所用的分析方法；引用已有的参考文献；引用已有的参考文献；提提供供每每个个分分析析批批的的标标准准曲曲线线，质质控控样样品品及及未未知知样样品的测试结果及计算过程；品的测试结果及计算过程；提提供供全全部部未未知知样样品品分分析析的的色色谱谱图图，包包括括全全部部相相关关的标准曲线、质控样品色色谱图。的标准曲线、质控样品色色谱图。