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1、第五章第五章 基因的体外重组和转化基因的体外重组和转化第一节第一节 DNA片段的体外连接片段的体外连接 第二节第二节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞基因的体外重组和转化课件磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶第一节、DNA片段的体外连接基因的体外重组和转化课件连接方式： 黏性末端的连接黏性末端的连接 平头末端的连接平头末端的连接 修饰黏性末端的连接修饰黏性末端的连接 PCR PCR产物的连接产物的连接 Gateway Gateway载体构建体系载体构建体系基因的体外重组和转化课件一、黏性末端的连接一、黏性末端的连接黏性末端连接黏性末端连接(Cohesive end lig
2、ation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。基因的体外重组和转化课件1.同种酶产生的黏末端的连接基因的体外重组和转化课件优优 点点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；基因的体外重组和转化课件问问 题题n载体自身环化载体自身环化 n插入片段可双向插入插入片段可双向插入 基因的体外重组和转化课件基因的体外重组和转化课件2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点基因的体外重组和转化课件载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点基因的体外重组和转化课件无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 SalSalSalSal片段（
3、片段（片段（片段（CAGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCTG） XhoXhoXhoXho 片段片段片段片段( ( ( (GAGCTCGAGCTCGAGCTCGAGCTC) ) ) ) G3 G3 G3 G3 CAGCT5CAGCT5CAGCT5CAGCT5C3 C3 GAGCT5GAGCT5DNA连接酶讨论：连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？基因的体外重组和转化课件n n若均不是以上情况呢？基因的体外重组和转化课件二、平末端的连接二、平末端的连接 平末端连接平末端连接(blunt end ligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种D
4、NA分子。基因的体外重组和转化课件平端连接 AGCTAGCTTCGATCGAAluAluT4T4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶AGCTAGCTAGCTAGCTTCGATCGATCGATCGA基因的体外重组和转化课件优优 点点可以用可以用T4连接酶连接任何连接酶连接任何DNA平端平端基因的体外重组和转化课件l5-突出粘性末端的补齐突出粘性末端的补齐可用Klenow聚合酶补齐l3-突出粘性末端的削平突出粘性末端的削平可用T4DNA聚合酶削平基因的体外重组和转化课件基因的体外重组和转化课件主主 要要 问问 题题连接效率低连接效率低高浓度的底物和T4DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源
5、不易回收外源DNA片断片断双向插入双向插入基因的体外重组和转化课件三、修饰黏末端连接三、修饰黏末端连接n同聚物加尾法：同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。基因的体外重组和转化课件基因的体外重组和转化课件优优 点点不会发生自身环化作用；连接效率较高；基因的体外重组和转化课件存在问题存在问题n操作繁琐n外源片段难回收n可能会影响基因表达基因的体外重组和转化课件n衔接物连接法衔接物连接法 衔接物（衔接物（linker）是指用
6、化学方法合成的一段由812个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。基因的体外重组和转化课件基因的体外重组和转化课件nDNA接头法：接头法： DNA接头（接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。基因的体外重组和转化课件人工接头连接BamHIBamHIBamHBamHIBamHI基因的体外重组和转化课件n n讨论 如何将一平末端的DNA片段与BamH形成的粘性末端连接？（P156.4）基因的体外重组和转化课件四、四、PCRPCR产物的连接产物的连接1.1.限制性内切酶酶切位点引入法限制性内切酶酶切位点引
7、入法在引物上添加或引入限制酶识别位点，在引物上添加或引入限制酶识别位点，使使PCRPCR产物两端带有相应的限制酶识别产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。位点，进一步与相应载体进行连接。基因的体外重组和转化课件（1）在引物上添加酶切位点基因的体外重组和转化课件基因的体外重组和转化课件！注意添加保护序列n nPrimer1: 5GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAn nPrimer2: 5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC引入的酶切位点是单一的基因的体外重组和转化课件（2）利用突变在引物5端引入酶切位点 通过在PCR
8、引物序列的5端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。基因的体外重组和转化课件2.T-A克隆 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在7075活性高)，使PCR产物的3末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.35T载体载体35载体载体T3535AAPCR产物产物基因的体外重组和转化课件Taq酶PCR扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白筛选蓝白筛选 目的片段目的片段基因的体外重组和转化课件T载体的构建：载体的构建： n n用限制性内切酶如用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与与MobII 酶切酶
9、切产生产生3末端未配对的末端未配对的T； n n应用末端转移酶与双脱氧应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出加入一个突出的的T残基到线形化载体的残基到线形化载体的3末端。末端。 n n应用不依赖末端的应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的移酶活性在线形化载体的3末端出的羟基基末端出的羟基基团上催化连接上一个团上催化连接上一个T碱基。碱基。 基因的体外重组和转化课件五、Gateway载体构建系统GatewayGateway技术：技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定
10、重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。基因的体外重组和转化课件GatewayGateway技术的灵活性：技术的灵活性：基因的体外重组和转化课件n n整合后的附着位点为整合后的附着位点为整合后的附着位点为整合后的附着位点为 attL attL（BOPBOP） attR attR（POBPOB）n n整合位点整合位点整合位点整合位点-attB attP-attB attP 切除位点切除位点切除位点切除位点-attL attR-attL attRn n整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋白
11、和重组位点。白和重组位点。白和重组位点。白和重组位点。基因的体外重组和转化课件第二节、重组体导入细菌细胞第二节、重组体导入细菌细胞n n转化转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程；n n转染转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程；n n转导转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。基因的体外重组和转化课件重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化基因的体外重组和转化课件受体细胞的选择（1）具有接受外源DNA的能力；（2）限制酶缺陷型；（3）DNA重组缺陷型；（4）不适于在人体内
12、或非培养条件下生存；（5）它的DNA不易转移。基因的体外重组和转化课件一、大肠杆菌感受态的制备一、大肠杆菌感受态的制备 感受态：感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。基因的体外重组和转化课件1970年Mandel和Higa发现用CaCl2 2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2 2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：基因的体外重组和转化课件将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42热
13、脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。基因的体外重组和转化课件CaCl2处理受体细菌受体细菌CaCl2感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌基因的体外重组和转化课件二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌基因的体外重组和转化课件 重组重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程转移到大肠杆菌细胞内的过程1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面2.转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状；4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。基
14、因的体外重组和转化课件JM109感受态含氨苄平板含氨苄平板AmAm重组质粒感受态基因的体外重组和转化课件转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNA100ul1b阴性对照10ul2ul连接液100ul2c阴性对照10ul100ul3d连接液转化组60ul6ul连接液600ul4具体操作：具体操作：冰浴30；422；冰浴2；加37预热LB培养45；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37倒置培养过夜；检查细菌生长情况。基因的体外重组和转化课件转化率：转化细胞转化率：转化细胞/ /细胞总数细胞总数
15、影响因素：影响因素： 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量试剂的质量 杂菌和杂杂菌和杂DNA的污染的污染 基因的体外重组和转化课件思考题：思考题：试述DNA片段的体外连接方式？基因的体外重组和转化课件练习题：打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在Ecoli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamH的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5磷酸；接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，
16、将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。基因的体外重组和转化课件实验中同时设置了4个对照：n n对照1：将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；n n对照2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；n n对照3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；n n对照4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。基因的体外重组
17、和转化课件在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。基因的体外重组和转化课件n ncDNAcDNA克隆的结果克隆的结果实验结果实验结果制备的样品制备的样品123123对照对照11只有细胞只有细胞TMTC00TMTC00对照对照22未切的载体未切的载体TMTC01000TMTC01000对照对照33省去磷酸酶处理，无省去磷酸酶处理，无cDNATMTC0435cDNATMTC0435对照对照44无无cDNATMTC025cDNATMTC025实验样品实验样品TMTC034TMTC034n n注：注：TMTC=toomanytocountTMTC=toomanytocount，多到无法计数。，多到无法计数。基因的体外重组和转化课件n n(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?n n(2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?n n(3)对照3和4各有什么作用?n n(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?基因的体外重组和转化课件
