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1、 分子生物学实验 任 课 教 师: 张淑平(62773628) 李 英姿 (62781668) 助 教 博 士 生 : 李 颖 华 (62773628) 黄 波 (62783845) 唐 颖 (62772214) 课程基本情况简介课程基本情况简介/质粒质粒DNA提取提取基本技术基本技术核核酸酸 的的分分离离纯纯化化(Isolation and Purification of DNA and RNA)；电泳技术电泳技术(Gel Electrophoresis)；基基因因重重组组、亚亚克克隆隆及及表表达达（Gene Recombination, Subcloning and Expression)
2、；PCR技术技术 ( Polymerase Chain Reaction)；分子杂交及互作分子杂交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)；DNA测序技术测序技术(DNA Sequencing)；基因功能的研究技术基因功能的研究技术(Gene Function)；基因的染色体定位（基因的染色体定位（Localization of Gene to Chromosomes）生物芯片技术（生物芯片技术（Bio-Chips or Bioarray). 以完整、常用、重要为原则，经典与先进以完整、常用、重要为原则，经典与先进技术相结合，同时介绍相关知识，尽
3、量让学生技术相结合，同时介绍相关知识，尽量让学生在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以及相关的知识。及相关的知识。 我们的分子生物学实验课程的设计从整体我们的分子生物学实验课程的设计从整体上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终，上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验既各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更深入得到本次实验的结果，同时也为下一次更深入的实验做准备（提供实验材料）。的实验做准备（提供实验材料）。课程基本情况课程基本情况：次次 序序实实 验验 名名 称称周次周次
4、学学 时时备注备注1课程基本情况简介课程基本情况简介/质粒质粒DNA提取提取36.02质质粒粒DNA酶酶切切鉴鉴定定及及琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳45.03聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)扩增扩增DNA56.04DNA回收纯化及重组体的构建回收纯化及重组体的构建66.55大大肠肠杆杆菌菌感感受受态态细细胞胞的的制制备备、重重组组DNA的转化及克隆筛选的转化及克隆筛选76.56重组克隆的鉴定重组克隆的鉴定87.07植物总植物总RNA的提取与电泳的提取与电泳95.08核酸转膜、探针标记核酸转膜、探针标记105.09核酸杂交核酸杂交124.510综合测验、实验讨论与总结综合测验、实验讨论与总
5、结134.0实验安排与实验实验安排与实验报告报告注：实验报告分为注：实验报告分为12、3、4 (实验实验6的设计的设计) 、45 、 6、7、89、10(6)(6)重组克隆的鉴定实验重组克隆的鉴定实验的几点说明的几点说明手工提取质粒方法手工提取质粒方法将在将在“实验一实验一”中讲到，中讲到，“实实验六验六”上课时间将提前到下午上课时间将提前到下午1:00；接种培养将在接种培养将在“重组克隆的鉴定重组克隆的鉴定”实验课的实验课的前一前一天的晚上进行（天的晚上进行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）；助博将准备好试管助博将准备好试管LB培养基，用前别忘了加你需培养基，用前别忘了加你
6、需要的要的抗生素抗生素;提供的提供的酶包括包括EcoRI,XhoI,BamHI,HindIII,XbaI。自己自己选择正确的正确的酶使用。使用。实验方案由学生自己设计！要提前进行。实验方案由学生自己设计！要提前进行。(目的意义、材料和方法、目的意义、材料和方法、结果及讨论结果及讨论)以下几点请注意：以下几点请注意：实验操作基本要求实验操作基本要求1.认真预习认真预习实验指导；实验指导；2.按照操作规程使用仪器设备按照操作规程使用仪器设备, 注意个人以及注意个人以及公共设施安全公共设施安全；3.节约节约实验试剂及材料；实验试剂及材料；4.实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验完毕后，将实验器
7、皿清洗干净，并清理实验台面；实验台面；5.按时按时、按质、按量、按质、按量完成完成实验工作，不迟到，实验工作，不迟到，不早退；不早退；6.实事求是、认真而及时地写出实验报告。实事求是、认真而及时地写出实验报告。评分考虑评分考虑1.平时实验课成绩平时实验课成绩 70%；2.综合技术测验综合技术测验 30%。实验一实验一 质粒质粒DNA的提取及浓度检测的提取及浓度检测1.目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2. 相关知识及原理质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且
8、稳定遗传的独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链遗传因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。胞中，在细菌细胞中最多。DNA超螺旋结构超螺旋结构细菌质粒细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从群，其大小从1Kb-200Kb，它们复它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。的同一组酶系。 严谨型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主
9、细胞的复制偶联同步。所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。才能达到更高拷贝数。质粒类型：质粒类型：
10、载体载体(Vector)(Vector)：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且能够使外源并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒( (运载工具运载工具) )。具备的条件：具备的条件：易于鉴定；易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于筛选；易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as gene,such as AmpicillinAmpicillin resistance gene, resista
11、nce gene, KanamycineKanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or site or polylinkerpolylinker) )；4.4.标记基因标记基因(Marker gene, such as (Marker gene, such as LacZLacZ g
12、ene) gene)。载体的结构：载体的结构：InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致境会导致DNADNA的的变性，如加热、极端变性，如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性。复性。原理：原理：SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDSSDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的处理细菌细胞
13、后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞从细胞中同时释放出来。释放出来的中同时释放出来。释放出来的DNADNA遇到强碱遇到强碱性（性（NaOHNaOH）环境，就会变性。然后，用酸性环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA，由于分子巨由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒大，难以复性。离心后，质粒DNADNA将在上清将在上清中，而基因组中，而基因组DNADNA则与细胞碎片一起沉淀到则与细胞碎片一起沉淀到离心管
14、的底部。通过这种方法即可将质粒离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。测定测定DNADNA浓度的方法主要有两种，即利用分浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定光光度计法测定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测粗略检测DNADNA浓度的方法
15、是通过凝胶电泳，浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。与标准分子量相比较。DNADNA浓度的测定：浓度的测定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基因为组成核酸的碱基(G,A,T,C(G,A,T,C）在）在260nm260nm处处具有强吸收峰，所以通过测定具有强吸收峰，所以通过测定260nm260nm的吸收的吸收峰即可对峰即可对DNADNA进行定量。但有时也会因为所进行定量。但有时也会因为所处溶液的处溶液的pHpH值不同而导致吸光系数的不同。值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性pHpH值左右的环境中进行值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样
16、品。测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。3. 材料与试剂材料与试剂材材 料料 :含含 有有 质质 粒粒 pCMV-Myc-T10的的 大大 肠肠 杆杆 菌菌DH5。pCMVpCMV- -MycMyc是是一一种种哺哺乳乳细细胞胞表表达达载载体体，它它含含有有一一个个N N端端c-c-MycMyc 尾尾，常常用用于于免免疫疫反反应应的的检检测测和和蛋蛋白白纯纯化化以以及及作作为为诱诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。饵蛋白检测酵母双杂交结果。Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.Selectable m
17、arker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.E. coli replication origin: pUCCopy number: 500 InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T104. 步骤A.质粒DNA的提取B. 碱裂解法碱裂解法溶液溶液1GET缓冲液：缓冲液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4
18、.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液或水（缓冲液或水（+ 20 g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇注意：注意： 用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！1.培培养养细细菌菌：将将带带有有质质粒
19、粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种到到1.5-3ml含含有有相相应应抗抗生生素素的的液液体体培培养养基基，37培养培养1216小时小时;2.取取液液体体培培养养液液1.5-3ml于于Eppendorf管管中中，10000r/min离离心心1min，去去掉掉上上清清液液，加加入入100 l溶液溶液1(GET) ，充分混匀放置充分混匀放置3-5分钟分钟;3.加加 入入 200 l新新 配配 制制 的的 0.2mol/L NaOH+1SDS（变变性性液液），加加盖盖颠颠倒倒6-7次次使使之之混混匀匀，冰上放置冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：质粒小量提取的方法（手工提取）：4.加入加入1
20、50 l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液II)，加盖后颠倒加盖后颠倒6-7次混匀，次混匀，冰上放置5min;5.用台式高速离心机，用台式高速离心机，10000r/min离心离心7min，上上清移入另一干净离心管，并加清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混匀，匀，12000r/min离心离心5min，弃去上清液弃去上清液;6.沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min离心离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入加入30-50 l含有含有20 g/ml RNa
21、se的灭菌蒸馏水的灭菌蒸馏水或或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有时需要酚有时需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8.将分离出的质粒将分离出的质粒DNA置于置于-20保存备用。保存备用。BiodevBiodev（博大泰克）质粒快速博大泰克）质粒快速提取试剂盒（提取试剂盒（plasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation kit） 碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。使用前按说明再溶液使用前按说明再溶液I中加入中加入RNase；向洗
22、脱液向洗脱液中按中按1:3的比例加入无水乙醇。的比例加入无水乙醇。操作步骤操作步骤1.1.收集收集1.51.53 3mlml菌液沉淀于菌液沉淀于1.51.5mlml离心管中。离心管中。加入加入100100 l溶液溶液1 1，振荡至彻底悬浮。，振荡至彻底悬浮。为了获得高质量的质粒为了获得高质量的质粒DNADNA，培养细菌的时培养细菌的时间不宜过长，一般为间不宜过长，一般为1212小时；小时；细菌沉淀中加入溶液细菌沉淀中加入溶液1 1后，一定要彻底悬浮，后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒否则抽提质粒DNADNA的纯度及得率会大大降低的纯度及得率会大大降低2.2.加入加入150150 l溶液溶液2 2
23、，立即轻柔颠倒离心管数，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管清亮。随后将离心管冰上冰上放置放置1 12 2分钟分钟（时间勿超）。（时间勿超）。3.3.加入加入150150 l溶液溶液3 3，立即温和颠倒离心管数次，立即温和颠倒离心管数次，室温放置室温放置5 5分钟。分钟。1200012000rpmrpm离心离心1212分钟。分钟。要要获获得得更更好好得得质质粒粒提提取取效效果果，请请于于步步骤骤2 2和和步步骤骤3 3后，冰上放置。后，冰上放置。4.4.将将420420 l结合缓冲液结合缓冲液加入加入离心柱离心柱中。然后
24、将中。然后将步步骤骤3 3的上清的上清加入离心加入离心吸附柱中吸附柱中（尽量去除杂质），（尽量去除杂质），混匀。混匀。1200012000rpmrpm离心离心3030秒钟。倒掉废液收集管秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。中得溶液。5.5.加入加入750750 l洗涤缓冲液洗涤缓冲液于离心吸附柱中，于离心吸附柱中，1200012000rpmrpm离心离心1 1分钟。分钟。浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNADNA可能可能被洗脱下来，影响回收效率。被洗脱下来，影响回收效率。6.6.A.
25、A.重复步骤重复步骤5 5一次；一次；B.B.随后，再次于随后，再次于1200012000rpmrpm空空管离心管离心2 2分钟，尽量除去漂洗液。分钟，尽量除去漂洗液。洗涕时（即步骤洗涕时（即步骤5和和6）一定要尽量除去漂洗液，）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。头吸净。如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。涤几次。7.小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净
26、的1.5ml离心管中。加入离心管中。加入50 l洗脱缓冲液洗脱缓冲液，室温，室温放置放置5分钟后，分钟后，12000rpm离心离心1分钟。分钟。洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。为了充分除尽为了充分除尽RNARNA的污染，可在提取的质粒中的污染，可在提取的质粒中加入加入0.50.5 l lRNaseARNaseA（10mg/ml10mg/ml
27、）。）。这并不影响这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。作为测序模板和其他酶促反应。若提取的质粒大于若提取的质粒大于1010KbKb，在加入洗脱缓冲液后，在加入洗脱缓冲液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分钟，以确保质粒分钟，以确保质粒DNADNA的完全洗脱。的完全洗脱。B. 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1.取取2 l提提取取的的质质粒粒DNA，加加入入98 l蒸蒸馏馏水水对对待待测测DNA样样品品做做1:50(或或更更高高倍数的稀释倍数的稀释);2.蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白,在
28、在波波长长260nm、280nm处处调调节节紫紫外外分分光光光光度度计计读读数数至零。至零。3.加加入入DNA稀稀释释液液，测测定定260nm 及及280nm的的吸吸收收值值。260nm 读读数数用用于于计计算算样样品品中中核核酸酸的的浓浓度度，OD260值值为为1相相当当于于约约50 g /ml双双链链DNA，33 g /ml单单链链。可可根根据据在在260nm以以 及及 在在 280nm的的 读读 数数 的的 比比 值值（OD260/OD280）估估计计核核酸酸的的纯纯度度。一一般般DNA的的纯纯品品，其其比比值值为为1.8，低低于于此此值值说说明有蛋白质或其它杂质的污染。明有蛋白质或其它
29、杂质的污染。4.记录记录OD值，通过计算确定值，通过计算确定DNA浓浓度或纯度，公式如下度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为 g /mlC. C. 凝胶电泳检测凝胶电泳检测DNADNA的浓度的浓度0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，100V,40100V,40分钟。分钟。NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1(1kb DNA Ladder)kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能虽然不能对对DNADNA质量进行精确定量分质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的
30、析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量的数据。每条带大概的量如下（按如下（按0.5g0.5g上样量计。上样量计。应按应按1313条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍）：倍）： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由的条带由500bp和和517bp组组成，这样即使在低分子量区域条成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。带的强度也比较均一。 5. 实验报告实验报告1)目的与要求目的与要求2)实验原理实验原理3)材料与方法材料与方法4)结果与讨论结果与讨论
