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1、ELISA实验基础知识培训2016.1.211. 酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念2. 酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测应用3. ELISA实验主要设备移液器基本使用主要内容2第一部分 酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理及概念3免疫技术酶促反应抗原抗体酶底物酶标抗原或酶标抗体酶联免疫吸附试验4什么是抗原？ 能刺激机体免疫系统并启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，引起一系列生物学效应的物质。抗原特异性抗体5抗原的特点免疫原性和抗原性 免疫原性免疫原性 指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答( (产生特异性抗
2、体及免产生特异性抗体及免疫效应细胞疫效应细胞) )的性质。的性质。 抗原抗原入侵入侵记忆细胞（对抗原有记忆功能）浆细胞特异性抗体效应B细胞6 抗原性抗原性 指抗原分子与免疫应答产物指抗原分子与免疫应答产物( (抗体或免疫效应细胞抗体或免疫效应细胞) )发生特异性结发生特异性结合的性质。合的性质。抗原失去致病能力7抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，决定簇的数目越多。抗原决定簇：抗体识别相应抗原并与之结合的位点抗原决定簇抗原决定簇具有两个以及两个以上抗原决定簇的抗原叫多价抗原8哪些物质
3、可以称之为抗原呢？大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是抗原。可以引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染金黄色葡萄球菌常引起严重腹泻和败血症9病毒呈球形，衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽（蛋白质）即VP1、VP2、VP3和VP4所组成甲肝病毒1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中拍摄的甲型肝炎病毒(HapatitisAvirus,HAV)10甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白，能刺激免疫系统产生特异性的抗体甲肝病毒11什么是抗体？抗体是在机体对抗原刺激的免疫应
4、答中，效应B细胞产生的一类糖蛋白，能够与相应抗原特异结合、产生各种具有免疫效应的球蛋白。免疫球蛋白在甲型肝炎的感染过程中，机体都可产生抗HAV的lgM和lgG抗体。前者在急性期和恢复期出现，后者在恢复后期出现，并可维持多年，IgG抗体使得机体对同型病毒的再感染有免疫力。12什么是抗原抗体反应抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应抗原抗体反应的特点1.特异性抗原与抗体结合反应的专一性，是指抗原分子表面的抗原决定簇与抗体的分子结合的特异性，这两个分子的空间结构是完全互补的。132.可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体3.阶段性第一第一阶段段特异
5、性结合阶段：反应快，不可见第二第二阶段段反应可见阶段：反应慢，但会出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象我可找到你了14抗原抗体反应的特点4.比例性抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比例关系只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体可见沉淀反应。沉淀物形成量沉淀反沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系中沉淀量与抗原抗体的比例关系15如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢？如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢？如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢？如何更加灵敏的检测抗原或抗体呢？你们都看不见我16放射性免疫标记技术1
6、7放射性免疫标记技术 用放射性核素等标记物，标记抗体或抗原，进行的抗原抗体检测技术，既有抗原抗体反应的特异性，又有标记物的灵敏度。通过放射强度的改变，测定未标记抗原或抗体的含量。（放射性标记物对抗原抗体反应起到了放大的作用）缺点：放射性物质对人体会产生危害1959年由Yalow和Berson开创了放射免疫技术(radioimmunoassay，RIA）。这项技术开辟了医学检验史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量。18酶具有可与抗原、抗体共价结合的基团高活性一个酶蛋白分子每分钟可以催化103-104个底物分子转化为有色产物用酶标记抗体（或
7、抗原）建立免疫测定法，可以使免疫结果得以放大，保证了测定方法的灵敏度。酶可以取代放射性核素，作为一种更安全的信号，检测抗原抗体酶可以取代放射性核素，作为一种更安全的信号，检测抗原抗体酶可以取代放射性核素，作为一种更安全的信号，检测抗原抗体酶可以取代放射性核素，作为一种更安全的信号，检测抗原抗体19Nakene和Pierce共同研究发现的酶标抗原或抗体的方法，他们共同发表了酶标抗体：制备和抗原定位中的应用，首先提出了免疫酶技术的基本原理酶标记抗原或抗体酶标抗原或抗体的原理及方法戊二醛交联法过碘酸钠法目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-
8、半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。20采用辣根过氧化物酶的原因分子量小：这使得它很容易结合到抗体分子上，且结合量大大增加，有助于信号的产生。辣根过氧化物酶的底物比较宽泛，且比碱性磷酸酶敏感。酶标抗体或抗原的原理辣根过氧化物酶中与酶活性无关的糖蛋白组分，在过碘酸钠作用下，其中的多糖羟基被氧化成活泼的醛基，后者即可与抗体蛋白中的氨基形成的Schiffs碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物辣根过氧化物酶糖蛋白过碘酸钠抗体蛋白氨基氨基羟基醛基Schiffs碱酶标抗体或抗原技术基本要求是将酶分子与抗体或抗原分子共价结合此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性2
9、1在实验中，为了分离游离和结合的酶标记物，洗板的过程是必不可少的，所以，将抗原（抗体）固定在固相载体上就是必须的了将抗原（抗体）固定在什么固相载体上？呀！我没结合上固相载体22塑料制品 抗体或蛋白质抗原可以通过非共价键或物理吸附机制结合到固相载体表面。迄今用的聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板仍是最常用的固相载体Wide和JerkerPorath研究并公开发表了抗原或抗体和固相载体结合的技术不足测定过程中固相抗体（抗原）脱吸附率较高且不均一，从而影响测定的灵敏度和精确性由于制作时配料及生产工艺的差别，各种聚苯乙烯ELISA板的质量差异大，会影响检测结果优点材料经济方法简便操作及测定易于自动
10、化23RosalynSussmanYalow和SolomonBerson建立了放射性免疫技术，可以定量检测体液中的生物活性物质1960年StratisAvrameas和G.B.Pierce发现了酶和抗体结合技术Wide和JerkerPorath研究并公开发表了抗原或抗体和固相载体结合的技术1961-1965年1971年Engral和Perlmann综合了前人技术，第一次提出酶联免疫吸附试验，并发表酶联免疫吸附试验测定IgG含量一文，使免疫酶技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法ELISA HistoryELISA History24 捕捕捕捕获获法法法法01 间间接法接法接法接法02
11、竞竞争法争法争法争法03双抗体双抗体双抗体双抗体夹夹心法心法心法心法04ELISA的分类25ELISA方法的适用范围间接法捕获法主要用于血清中某种抗体亚型成分，如：IgM的测定。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。竞争法可用于小分子的抗原和半抗原的定量测定，以及抗体测定。小分子激素、药物等的测定多用此法双抗体夹心法最常用于抗原检测，且为多价抗原检测。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心此法是检测抗体最常用的方法26用途广泛1敏感度高2特异性强3可定性和定量4ELISA方法的特点27双抗体夹心法原理：利用连接于固相载体上的和
12、可分别于样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合，形成免疫复合物。由于反应系统和相对于待检测抗原是过量的，因此复合物形成的量和待检抗原的含量成正比。测定复合物酶中加入的底物后生成的有色物质（OD值），即可确定待测抗原的含量。（成正比）ELISA原理原理抗体酶标抗体过量过量固相抗体-抗原-酶标抗体固相抗体-抗原-酶标抗体固相抗体酶标抗体的量28将抗体包被在固相载体上将抗体固定在固相载体上抗体作为一种蛋白质可以与聚苯乙烯制成的固相载体以非共价键和物理吸附的机制相结合洗去未结合的抗原洗去未与抗原结合的酶标抗体TMB底物终止液止液2mol/LH2SO4酶和底物作用后生成的物质在终止剂作用下呈现黄色
13、，黄色的深浅和抗原含量成正比双抗体夹心法操作29甲肝疫苗抗原检测的方法双抗体夹心法采用ELISA双抗体夹心法定量/定性检验甲肝抗原。将特异性甲肝抗体（包被物）包被到酶标板上形成固相抗体；加入参比品和供试品，与固相抗体形成抗原抗体复合物随后加入酶标抗体，参比品和供试品中的甲肝抗原与酶标抗体发生特异性结合当加入酶底物时，出现呈色反应，酶标仪在适当波长测定参比品以及供试品的OD值应用量反应平行线法计算抗原含量。甲肝疫苗抗原检测方法原理30第二部分 酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测应用31目录国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍ELISA分析模型的选择32Gu
14、idanceforIndustryBioanalyticalMethodValidation U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministration(FDA)CenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)CenterforVeterinaryMedicine(CVM)May2001FDA对生物分析方法验证的要求Typicalmethoddevelopmentandestablishmentforabioanalyticalmethodincludedeterminationof(1)sel
15、ectivity,(2)accuracy,precision,recovery,(3)calibrationcurve,and(4)stabilityofanalyteinspikedsamples生物学分析方法的验证项目包括：（1）专属性；（2）准确度、精密度、回收率；（3）标准曲线；（4）稳定性33精密度的概念Theprecisionofananalyticalmethoddescribestheclosenessofindividualmeasuresofananalytewhentheprocedureisappliedrepeatedlytomultiplealiquotsofasi
16、nglehomogeneousvolumeofbiologicalmatrix.精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或变异系数（或称相对标准偏差）来表示。 偏差、标准偏差（SD）或变异系数越小，说明测定结果越集中，精密度越好。精密度的验证结果表明了这个检验系统检验供试品结果的波动幅度。34Precisionshouldbemeasuredusingaminimumoffivedeterminationsperconcentration.Aminimumofthreeconcentrationsintherange
17、ofexpectedconcentrationsisrecommended.Theprecisiondeterminedateachconcentrationlevelshouldnotexceed15%ofthecoefficientofvariation(CV)exceptfortheLLOQ,whereitshouldnotexceed20%oftheCVwhichmeasuresprecisionwithtime,andmayinvolvedifferentanalysts,equipment,reagents,andlaboratories.生物分析方法精密度评价的规定：对生物分析方
18、法进行精密度检测实验时，检测范围内最少设置3个不同浓度，每个浓度最少进行5次重复试验。考察因素：时间、人员、设备、试剂和实验室导致结果的因素验证结果：在相同浓度下，试验结果变异系数CV应小于15%（最低检出限的要求是CV小于20%）。FDA对生物分析方法验证的要求35Oncetheanalyticalmethodhasbeenvalidatedforroutineuse,itsaccuracyandprecisionshouldbemonitoredregularlytoensurethatthemethodcontinuestoperformsatisfactorily.Toachievet
19、hisobjective,anumberofQCsamplespreparedseparatelyshouldbeanalyzedwithprocessedtestsamplesatintervalbasedonthetotalnumberofsamples.TheresultsoftheQCsamplesprovidethebasisofacceptingorrejectingtherun.AtleastfourofeverysixQCsamplesshouldbewithin15%oftheirrespectivenominalvalue.TwoofthesixQCsamplesmaybe
20、outsidethe15%oftheirrespectivenominalvalue,butnotbothatthesameconcentration.Applicationofvalidatedmethodtoroutinedruganalysis已验证方法在常规检验中的应用-FDA当生物分析方法建立并开始用于常规检定后，需要定期监控该生物分析方法的精密度和准确性，以确保分析方法的运行是可靠的。采取的方法是，在检验过程中，定期设置质控品；根据质控品的结果来判定实验是否成立。要求：要求：至少4/6的质控品的测定结果在真实结果的15%范围内；2/6的质控品测定结果超出真实结果真实结果的15%间接
21、证明：生物分析方法的波动还是很大的36质控品甲型肝炎灭活疫苗内控参比品（内参）内参设置频次每块酶标板设置1个内参内参成立要求体外效力检验值在1.04-1.28之间，试验成立内参均值1.16，其15%范围为0.99-1.33内参实际应用情况2013年6-7月间，内参共检验124次，其中10次不符合要求，合格率92%（4/6）北京科兴甲肝体外相对效力检验FDA所列的生物分析方法之一举例说明表明：表明：甲肝体外内参设立标准严格于FDA法规要求目前的甲肝体外效力检验系统是稳定、可靠37目录国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实例和验证介绍ELISA分析模型的选择38双抗夹心ELI
22、SA抗原定量检测应用举例厂家检验项目最低检出限北京科兴质控部目前使用HBV核心抗原1ng/mlHCV核心抗原1ng/mlHIVp241ng/ml前列腺特异性抗原肺结核抗原幽门螺旋杆菌抗原卵清蛋白0.312ng/mlVero宿主细胞蛋白2ng/ml非限制性核酸内切酶0.2ng/ml39不同ELISA试剂盒验证的变异系数SampleMeanconcentrationng/mLStandarddeviationCV(%)15.070.234.6024.090.317.5533.280.267.8942.180.062.8351.590.0684.5960.780.0283.54Intra-assay
23、板内SampleMeanconcentrationng/mLStandarddeviationCV(%)18.830.738.2324.550.296.3533.040.217.0240.820.056.57Inter-assay板间卵清蛋白的ELISA定量试剂盒幽门螺旋杆菌抗原40不同ELISA试剂盒验证的变异系数POOlIntraassayCVInterassayCVLow6.9%4.4%Medium5.5%3.7%High3.5%3.6%Vero宿主细胞蛋白不同的定量检测试剂盒的变异系数可接受范围有所不同前列腺特异性抗原41目录国际法规对生物分析方法验证的要求双抗夹心ELISA检验方法实
24、例和验证介绍ELISA分析模型的选择42分析模型的选择根据不同ELISA检验方法的属性与要求，适用模型不同单点代入法多点比较法43为什么选择量反应平行线法进行有效抗原含量定量检验？在生物分析方法中，目标物的定量不能像化学和物理分析方法一样直接测量获得（质量、长度、温度、发光强度等）绝大部分的定量生物分析方法，需要依靠标准品。将待检样品的生物反应值与标准品的反应值进行比较，所得结果为相对值，所以含量单位人为命名unit(u)但是，有时候待检样品和标准品的组分或性质有区别，导致待检样品中有效组分不能通过与标准品的比较而得出真实值44为什么选择量反应平行线法进行有效抗原含量定量检验？单点点带入法的入法的风险供供试品不同稀品不同稀释度得到不度得到不同同结果果待检样品中组分干扰检测结果，例如糖、盐离子、杂蛋白等供试品剂量反应的线性无法考察待检样品中的有效组分与标准品中的有效组分与抗体的结合能力不同，剂量反应曲线斜率不同不具有同质性量反量反应平行平行线法法检验待待检样品和品和标准品多准品多稀稀释度度考察标准品和供试品剂量反应是否呈线性供试品和标准品剂量反应曲线相平行（斜率相同），表明两者具有同质性有效抗原含量决定疫苗对人体的保护效果，是疫苗最重要的产品质量评价标准甲肝抗原、EV71抗原、乙肝表面抗原定量采用量反应平行线法检验45
