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1、第一章第一章 工具酶工具酶限制性核酸内切酶的命名主要内容主要内容n n一限制性核酸一限制性核酸内切酶内切酶n n二二其它工具酶其它工具酶n n1 1 DNADNA连接酶连接酶n n2 2聚合酶聚合酶n n3 3DNADNA修饰酶修饰酶n n4. 4. 细胞裂解酶细胞裂解酶限制性核酸内切酶的命名一限制性核酸一限制性核酸一限制性核酸一限制性核酸内切酶内切酶内切酶内切酶n n1. 1.限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的定义定义与与特点特点n n2. 2.限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的发现发现发现发现 n n3. 3. 限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制n n4. 4.限制性内切
2、酶的分类限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类n n5. 5.限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名n n6. 6. II II型限制性核酸内切酶的基本识别特性型限制性核酸内切酶的基本识别特性n n7. 7.限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式n n8. 8. II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作n n9. 9.影响限制性核酸内切酶活性的影响限制性核酸内切酶活性的因素及解决方法因素及解决方法n n10.10.限制性内切酶的限制性内切酶的starstar活性活性n n11.11.其他特异性的限制酶其
3、他特异性的限制酶n n12.12.DNADNA分子的片段化分子的片段化限制性核酸内切酶的命名n n定义定义定义定义： 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中特殊核苷酸序列，中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核苷酸酶。核苷酸酶。限制性核酸内切酶的命名n n特点：特点：n n 存在存在存在存在于任何一种于任何一种原核细菌原核细菌原核细菌原核细菌中中. .n n 在在特异位点特异位点特异位点特异位点上催化双链上催化双链DNADNA分子的分子的断裂断裂断裂断裂, ,产产n n 生相应限制性片段生相应限制性片段. .n n 各种生物
4、呈现特征性的限制性内切酶酶切图各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图n n 谱谱. .n n 在生物分类在生物分类, ,基因定位基因定位, ,基因重组基因重组, ,疾病诊断疾病诊断, ,刑刑n n 事侦察领域极为重要事侦察领域极为重要. .限制性核酸内切酶的命名限制性内切酶的发现： 宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用n n1. 1. 两种不同来源的两种不同来源的 - -噬菌体噬菌体, , KK； B B . .n n2. 2. 能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ KKKK株株, , B B B B 株）
5、株）n n3. 3. 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。降数千倍。n n4. 4. 一但一但 K K 噬菌体在噬菌体在B B 株成功，由株成功，由B B 株繁殖出株繁殖出 K K 后代，后代，能感染能感染B B 株株, , K K B B 株株. .不能感染原来不能感染原来 KK株株. . n n K K K K株株限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制n n1 1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 KK株株B B 株株, , 有各自的限制和修饰系有各自的限制和修饰系统统。n n
6、2. 2. 噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞KK株，株，B B株株 中中. .n n3 3细菌利用限制和修饰系统来区分自身细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNADNA与外与外DNADNA。n n4. C 4. C 株株 不能产生限制性内切酶，其它来源不能产生限制性内切酶，其它来源- - 噬菌体噬菌体可以感可以感 染染C C 株，而在株，而在 C C 株繁殖株繁殖 - - 噬菌体则在噬菌体则在 K K株株和和B B 株株, ,受到严格的限制作用。受到严格的限制作用。限制性核酸内切酶的命名问题问题n n 1. 1. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（
7、）不太关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。恰当。n nA A。由作用于同一。由作用于同一DNADNA序列的两种酶构成序列的两种酶构成n nB. B. 这一系统中的核酸酶都是这一系统中的核酸酶都是II II类限制性内切酶类限制性内切酶n nC. C. 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNADNA进行修饰进行修饰n nD. D. 不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统n n2.2.判断下面一句话是否正确判断下面一句话是否正确n n限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源限制与修饰现象
8、是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNADNA的修饰和的修饰和对自身对自身DNADNA的限制实现的。的限制实现的。限制性核酸内切酶的命名n n1 1）它们均有三个连续的基因位点控制，）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdRhsdR; ; hsdMhsdM; ; hsdS.hsdS.n n2 2）hsdRhsdR 编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别DNA DNA 分子特定位分子特定位 点，点，将双链将双链将双链将双链DNA DNA 切断切断切断切断。n n（注意：（注意：DNADNA分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR hsdR 基因位基因位点）点）n
9、 n3 3）hsdMhsdM 编码产物是编码产物是DNADNA甲基化酶甲基化酶-催化催化DNA DNA 分子特定分子特定位点的位点的碱基甲基化碱基甲基化碱基甲基化碱基甲基化反应。反应。n n4 4） hsdShsdS 表达产物的功能是表达产物的功能是-协助协助协助协助限制性核酸内切酶和甲限制性核酸内切酶和甲基化酶，基化酶，识别特殊的作用位点识别特殊的作用位点识别特殊的作用位点识别特殊的作用位点。限制性核酸内切酶的命名限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制n n1 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA DNA 和噬菌体和噬菌体DNADNA特异特异性保护性保护
10、, ,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰修饰修饰修饰）n n2) 2) 当外来当外来DNA DNA 入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解。解。 （限制限制限制限制）限制性核酸内切酶的命名限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制n n3) 3) 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNA DNA 分子在宿主细胞中繁分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。降解。n n4) 4) 外来少数外来少数DNA DNA
11、 分子分子, ,虽然是外来却不被降解。但丧虽然是外来却不被降解。但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记, , 一但一但 -K -K 噬菌体在噬菌体在 B B 株成功，由株成功，由B B 株繁殖出株繁殖出 -K -K 后代后代 能感能感染染B B 株株, , 不能感染原来不能感染原来KK株株. .限制性核酸内切酶的命名限制性内切酶的分类：（三大类）限制性内切酶的分类：（三大类）n nI I I I 类，类，类，类，II II 类类类类, III , III 类
12、类类类. .n n2 2 I I 类，类，III III 类为限制类为限制-修饰酶。修饰酶。n n 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在单位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。n n3 3 IIII类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，n n 切割位点专切割位点专 一，适合于一，适合于DNADNA重组。重组。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n n限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类 n n主要类型主要类型 I I型型 II II型型 IIIIII型型n n限制修饰限制修饰
13、多功能多功能 单功能单功能 双功能双功能n n蛋白结构蛋白结构 异源三聚体异源三聚体 同源二聚体同源二聚体 异源二聚体异源二聚体n n辅助因子辅助因子 ATP Mg2ATP Mg2SAM Mg2SAM Mg2 ATP Mg2ATP Mg2 SAM SAM n n识别序列识别序列 无规律，如无规律，如E EcocoK K： 旋转对称旋转对称 无规律，如无规律，如EcoEcoP15P15：n n AACN6GTGC CAGCAGAACN6GTGC CAGCAGn n切割位点切割位点 距识别序列距识别序列1kb 1kb 识别序列内或附近识别序列内或附近 距识别序列下游距识别序列下游n n 处随机性切
14、割处随机性切割 特异性切割特异性切割 242426bp26bp处处限制性核酸内切酶的命名n n问题：问题：n n1. 1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）n nA.A.限制酶是外切酶而不是内切酶限制酶是外切酶而不是内切酶n nB.B.限制酶在特异序列（识别位点）对限制酶在特异序列（识别位点）对DNADNA进行切割进行切割n nC.C.同一种限制酶切割同一种限制酶切割DNADNA时留下的末端序列总是相同时留下的末端序列总是相同n nD.D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末
15、端n nE.E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,DNA,产生平末端产生平末端n n2.II2.II类限制性内切酶（）类限制性内切酶（） A. A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 B. B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 C. C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列限制性识别非甲基化的核苷酸序列 D. D.有外切核酸酶和甲基化酶活性有外切核酸酶和甲基化酶活性 E. E.仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供仅有外
16、切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名名称名称 属属名名（大大写、斜体）写、斜体） 种种名名（小小写、斜体）写、斜体） 株株名名 序数序数来源菌株来源菌株 EcoEcoR IR IE EcocoR RI IE.coliE.coli R R株株HinHind IIId IIIH Hinind dIIIIIIHaemophilus Haemophilus influenzaeinfluenzae d d株株HinHind IId IIH Hinind dII IIHaemophilus Haemophilus influenza
17、einfluenzae d d株株HpaHpa I IH HpapaI IHaemophilus Haemophilus parainfluenzaeparainfluenzae限制性核酸内切酶的命名问题：下列关于限制性内切酶的表示方法中，正确的一项是（）A.Sau 3A I B. E. co R I C. hind III D. Sau 3A I限制性核酸内切酶的命名 II型限制性核酸内切酶的基本识别特性型限制性核酸内切酶的基本识别特性n n1 1）大多数酶的识别顺序是严格的，少数有变动。如）大多数酶的识别顺序是严格的，少数有变动。如HinHind IId II的识别位点是的识别位点是GTP
18、yPuAC.GTPyPuAC.其中其中PyPy代表代表C C或或T T，而而PuPu代表代表A A或或G G。n n2 2）识别顺序的碱基数一般为）识别顺序的碱基数一般为4 46 6个碱基对，一般富个碱基对，一般富含含GCGC限制性核酸内切酶的命名 II型限制性核酸内切酶的基本识别特性型限制性核酸内切酶的基本识别特性n n3 3）大多数识别位点具有）大多数识别位点具有180180旋转对称，少数酶的切割位旋转对称，少数酶的切割位点在识别位点外，具有旋转对称性。点在识别位点外，具有旋转对称性。n n如如 EcoEcoR I R I 的切割位点的切割位点 EcoEcoR I R I 的识别位点的识别
19、位点n n 5 5GCTGCTGAATTCGAATTCGAGGAG3 3 n n 3 3CGACGACTTAAGCTTAAGCTCCTC5 5 n n4 4）II II型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用酶的切割作用n n5) 5) 同一种同一种DNADNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。列长的出现概率小。1/41/4n n限制性核酸内切酶的命名问题：1.在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是
20、什么？2.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG 、AAATTT、 GATATC、ACGGCA？ 为什么？3. 如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4个碱基序列的限制性内切酶大概隔（）碱基对可进行一次切割 A. 125 B. 256 C. 425 D. 625 E. 10564. 如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4碱基序列的限制内切酶大约可将1Mb的DNA切割成多少段？（） A.125 B.320 C.625 D.1050 E.1600限制性核酸内切酶的命名 限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式n n切割位点，用切割位点，用 或或
21、表示。表示。n nA A以切出以切出片段末端性质片段末端性质片段末端性质片段末端性质不同不同n n 平末端平末端n n 5 突出的黏性末端黏性末端n n 3突出的黏性末端黏性末端限制性核酸内切酶的命名 限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式n nB以酶切特点酶切特点来分n n同位酶同位酶：识别相同序列切点不同。n n同裂酶同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。n n同尾酶同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式 EcoEcoR IR I等产生的等产生的5 5 粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5 5G-C-T-
22、G-C-T-G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C-G-A-G -G-A-G 3 3 3 3C-G-A-C-G-A-C-T-T-A-A-GC-T-T-A-A-G-C-T-C -C-T-C 5 5 5 5G-C-T-G-C-T-G-OHG-OH P-A-A-T-T-CP-A-A-T-T-C-G-A-G -G-A-G 3 3 3 3C-G-A-C-G-A-C-T-T-A-A-PC-T-T-A-A-P OH-G OH-G-C-T-C -C-T-C 5 5 OH P OH P 5 5G-C-T-G-C-T-G G A-A-T-T-CA-A-T-T-C-G-A-G -G-A-G 3 3 3 3C-
23、G-A-C-G-A-C-T-T-A-A GC-T-T-A-A G-C-T-C -C-T-C 5 5 P OH P OHEco RI 37 退火4-7 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式n nPst Pst I I等产生的等产生的3 3 粘性末端粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I 37 退火4-7 OHP5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A
24、-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 POH限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式Pvu II等产生的平头末端平头末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5Pvu II 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式n n内切酶的识别位点与切割方式之间的关系内切酶的识别位点与切割方式之间的关系n n1 1）识别序列
25、不同，切割方式不同）识别序列不同，切割方式不同n n 如：如：EcoEcoR I 5R I 5 -GAATTC-3-GAATTC-3 n n 3 3 -CTTAAG-5-CTTAAG-5 n n Pst Pst I 5 I 5 -CTCGAG-3-CTCGAG-3 n n 3 3 -GAGCTC-5-GAGCTC-5 n n2) 2) 识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同同尾酶同尾酶同尾酶同尾酶n n 如：如：BamBamH I 5H I 5 -GGATCC-3-GGATCC-3 n n 3 3 -CCTAGG-5-CCTAGG-5 n n BglBgl I
26、I 5 II 5 -AGATCT-3-AGATCT-3 n n 3 3 -TCTAGA-5-TCTAGA-5 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式n n内切酶的识别位点与切割方式之间的关系内切酶的识别位点与切割方式之间的关系n n3)3)识别序列相同，但切割方式不同识别序列相同，但切割方式不同同位酶同位酶同位酶同位酶n n 如：如：SmaSma I 5 I 5 -CCCGGG-3-CCCGGG-3 n n 3 3 -GGGCCC-5-GGGCCC-5 n n XmaXma I 5 I 5 -CCCGGG-3-CCCGGG-3 n n 3 3 -GGGCCC
27、-5-GGGCCC-5 n n 4) 4)相同的识别序列，切割方式也相同相同的识别序列，切割方式也相同同裂酶同裂酶同裂酶同裂酶n n 如：如：HpaHpa II 5 II 5 -CCGG-3-CCGG-3 n n 3 3 -GGCC-5-GGCC-5 n n MspMsp I 5 I 5 -CCGG-3-CCGG-3 n n 3 3 -GGCC-5-GGCC-5 n n 但但MspMsp I I可以切甲基化的胞嘧啶可以切甲基化的胞嘧啶限制性核酸内切酶的命名问题问题n n1. . BamBamH IH I、XbaXba I I、BglBgl II II的识别位点分别是：的识别位点分别是：GGGG
28、ATCCATCC、 TCTCTAGATAGA、AGAGATCTATCT，哪些酶切结果可产生互补的末端？（），哪些酶切结果可产生互补的末端？（）n nA.A.以上几种酶切结果产生的末端都可互补以上几种酶切结果产生的末端都可互补 n n B. B. 产生的末端都不能互补产生的末端都不能互补n nC. C. 仅仅BamBam H I H I和和BglBgl II II的酶切末端互补的酶切末端互补 n n D. D. 仅仅BamBam H I H I和和XbaXba I I的酶切末端互补的酶切末端互补n nE. E. 仅仅XbaXba I I和和BglBgl II II的酶切末端互补的酶切末端互补n
29、n2. . 2. . Bst Bst B I(B I(TT TT CGAACGAA）消化可产生怎样的末端（）消化可产生怎样的末端（） A. A.含含5CGAA 35CGAA 3序列的黏性末端序列的黏性末端 B.B.含含5CG 35CG 3序列的黏性末端序列的黏性末端 C. C. 含含5AAGC 35AAGC 3序列的黏性末端序列的黏性末端 D. D. 平末端平末端 n nE. E. 含含5GC 35GC 3序列的黏性末端序列的黏性末端 限制性核酸内切酶的命名 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解
30、1 g 标准DNA所需的酶量大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件反应条件： 待酶切的DNA样品 内切酶 反应缓冲液 温度37，12hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量决定限制性核酸内切酶的命名影响限制性核酸内切酶活性的影响限制性核酸内切酶活性的因素n n 1 1）底物底物底物底物DNADNAn n 2 2）内切酶的用量内切酶的用量内切酶的用量内切酶的用量n n 3 3）反应缓冲液反应缓冲液( (浓度（浓度（1010 ）mmol/L)mmol/L)n n 4 4）反应温度反应温度限制性核酸内切酶的命名底物底物DNAn n DNA DNA纯度纯度n n 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯
31、酚、氯仿、乙醇、EDTAEDTA、 SDSSDS、NaClNaCl等等n n DNADNA分子构型分子构型n n 切割效率：线性切割效率：线性 超螺旋质粒超螺旋质粒 环状病毒环状病毒DNADNAn n 识别序列的侧面序列识别序列的侧面序列n n 大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有效切割。效切割。n n 位点偏爱位点偏爱n n 侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如pBR322 DNApBR322 DN
32、A上的上的4 4个个NaeNae I I的识别位点切割效率不同。的识别位点切割效率不同。限制性核酸内切酶的命名底物底物DNAn n DNA DNA甲基化甲基化n n dcmdcm和和damdam甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶 大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在5 5 GATC3GATC3 序列中的序列中的腺嘌呤腺嘌呤N N6 6位引入甲基，受其影响的酶有位引入甲基，受其影响的酶有BclBcl I I、MboMboI I等，等，但但Bam Bam H IH I、BglBgl II II、Sau Sau 3A I3A I不受影响不受影响n n 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcm
33、dcm甲基化酶在甲基化酶在5 5 CCAGG3CCAGG3 或或5 5 CCTGG3CCTGG3 序列中的胞嘧啶序列中的胞嘧啶C C5 5位上引入甲基，受其影位上引入甲基，受其影响的酶有响的酶有Eco Eco R IIR II等等n n哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在5 5 CG3CG3 序列中的序列中的C C5 5位上引入位上引入甲基甲基 限制性核酸内切酶的命名n n解决方法：解决方法：n n 对对DNADNA进行有针对性的纯化；进行有针对性的纯化；n n 加大酶的用量，加大酶的用量，1 g DNA 1 g DNA 用用10U 10U 酶；酶；n n 加大反应总体积；加大反应总体
34、积；n n 延长反应时间；延长反应时间；限制性核酸内切酶的命名n n2 2）内切酶的用量内切酶的用量内切酶的用量内切酶的用量n n 反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物催化活性和底物DNADNA样品样品n n 当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活性高的用量少，反之则高。性高的用量少，反之则高。n n 限制性核酸内切酶的命名n n容积活性容积活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性单位，即U/ul。n n 等量的两种DNA样品，由于含同种限制性核酸内切酶识别序列的密度不同
35、，则酶量也不同。密度大的用酶多。限制性核酸内切酶的命名n n3 3）反应缓冲液）反应缓冲液( (浓度（浓度（1010 ）mmol/L)mmol/L)n n 缓冲液成分缓冲液成分 A B C D EA B C D En n Tris-Ac 330 Tris-Ac 330 n n Tris-HCl 100 500 100 100 Tris-HCl 100 500 100 100n n Mg-Ac 100 Mg-Ac 100 n n MgCl2 50 100 100 100 MgCl2 50 100 100 100n n K-Ac 650 K-Ac 650n n NaCl 1000 1000 500
36、 NaCl 1000 1000 500n n DTT 5 10 10 10 DTT 5 10 10 10n n - -巯基乙醇巯基乙醇 1010n n pH pH值（值（3737） 7.9 8.0 7.5 7.5 7.57.9 8.0 7.5 7.5 7.5限制性核酸内切酶的命名n n4 4）反应温度）反应温度n n 大多数内切酶的大多数内切酶的最适温度为最适温度为最适温度为最适温度为3737，少数高于或低于，少数高于或低于37.37.各种酶的最适温度见各产品说明书。各种酶的最适温度见各产品说明书。限制性核酸内切酶的命名 限制性内切酶的限制性内切酶的star活性n n定义：某些限制性内切酶在定
37、义：某些限制性内切酶在特定条件特定条件特定条件特定条件下（高浓度的酶、下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值等），可以值等），可以在在在在不是原来的识别序列处切割不是原来的识别序列处切割不是原来的识别序列处切割不是原来的识别序列处切割DNADNA，这种现象称为，这种现象称为starstar活性。活性。n n如：如：Eco Eco R IR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割5 5 GAATTC3GAATTC3 序序列，但在甘油浓度超过列，但在甘油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割）时，也可切割5 5 PuPuATPyPy3P
38、uPuATPyPy3 或者或者5 5 AATT3AATT3n n另，不同的酶产生另，不同的酶产生starstar活性的条件不同，见书活性的条件不同，见书p73.p73.限制性核酸内切酶的命名问题问题n n1. 1.从细菌中分离基因组从细菌中分离基因组DNADNA，经过识别，经过识别GAATTCGAATTC序列的序列的6 6碱基酶长时间消化后，发现碱基酶长时间消化后，发现DNADNA分子未被切动，基因组大分子未被切动，基因组大小为小为4Mb4Mb，造成该结果的原因是（），造成该结果的原因是（）n nA.A.基因组中没有基因组中没有G Gn nB.B.基因组中没有基因组中没有A An nC.C.该
39、细菌的该细菌的DNADNA已经过甲基化修饰已经过甲基化修饰n nD.D.所有酶切位点都位于基因内，而该限制性内切酶不作用所有酶切位点都位于基因内，而该限制性内切酶不作用于基因内于基因内n nE.E.所有酶切位点都位于启动子及调控区内，而该限制性内所有酶切位点都位于启动子及调控区内，而该限制性内切核酸酶只作用于基因内切核酸酶只作用于基因内限制性核酸内切酶的命名n n2. 2. 限制性内切酶的星号活性是指（）限制性内切酶的星号活性是指（）A.A.在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性B.B.活性大大提高活性大大提高 C.C. 切割速度大大加快切割速
40、度大大加快D.D.识别序列与原来的完全不同识别序列与原来的完全不同n n3. 3. 下面哪种不是产生星号活性的主要原因（）下面哪种不是产生星号活性的主要原因（）A.A.甘油含量过高甘油含量过高 B.B. 反应体系中含有有机溶剂反应体系中含有有机溶剂C.C.含有非含有非MgMg2 2的二价阳离子的二价阳离子 D.D. 酶切反应时酶浓度过低酶切反应时酶浓度过低限制性核酸内切酶的命名其它特异性的限制酶 n nOmega核酸酶（核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子编码，用于rRNA的剪切 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 限制性核酸内切酶的命名其它特异性
41、的限制酶n nI-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子 5- CTCTCTTAAGGTAGC -3 AATT 限制性核酸内切酶的命名 DNA的片段化的片段化n n定义：无论是生物材料制备的天然定义：无论是生物材料制备的天然DNADNA，还是化，还是化学合成的学合成的DNADNA，往往需要用限制性核酸内切酶进，往往需要用限制性核酸内切酶进行切割，使其可用于连接重组的行切割，使其可用于连接重组的DNADNA片段，即片段，即DNADNA分子的片段化分子的片段化n n切割方法：切割方法：n n 单酶切单酶切n n 双酶切双酶切n n 部分酶切部分酶切限制性核
42、酸内切酶的命名单酶切单酶切n n用一种限制性核酸内切酶切割用一种限制性核酸内切酶切割DNADNA样品样品n n完全酶切后产生的片段由完全酶切后产生的片段由DNADNA的形状和酶切位点的形状和酶切位点数决定数决定; ;n n 如：线性如：线性DNADNA分子，酶切后的片段分子，酶切后的片段N N1 1n n 环状分子，酶切后的片段环状分子，酶切后的片段N N限制性核酸内切酶的命名双酶切双酶切n n用两种不同的酶切割同一种用两种不同的酶切割同一种DNADNA分子分子n n1 1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。反应。n n2 2）两种酶切
43、同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低高盐，不可高盐，不可 同时反应。同时反应。n n a) a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。n n b) b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液n n c c）两种酶不能同时反应，有先有后。）两种酶不能同时反应，有先有后。 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名部分酶切部分酶切n n用限制性内切酶对用限制性内切酶对DNADNA分子上的全部识别序列进分子上的全部识别序列进行不完全的切割行不完全的切割n n导致不完全切割的导致不完全切
44、割的原因原因原因原因：n n 底物底物DNADNA的纯度、识别序列的甲基化、酶的用的纯度、识别序列的甲基化、酶的用量不足、反应缓冲液或温度不适以及酶切时间不量不足、反应缓冲液或温度不适以及酶切时间不足等足等限制性核酸内切酶的命名用用 途途n n确定DNA分子的限制性图谱限制性核酸内切酶的命名限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb Eco RI待检的待检的DNABam HI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 限制性核酸内切酶的命名4.9kb1.53.40.71.01.22.0
45、0.20.51.21.02.0Eco RIBam HIEco RI+ Bam HI结论12.01.20.7B E BB结论21.2 2.00.7B E BB限制性核酸内切酶的命名如何确定哪种结论正确？答：部分限制性酶切0.71.01.22.04.9Bam HI1.72.73.73.94.9限制性核酸内切酶的命名酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名问题问题n n1. 1.为了绘制长为为了绘制长为3.0kb3.0kb的的DNADNA的的BamH IBamH I限制性片段的限制限制
46、性片段的限制性图谱，分别用性图谱，分别用EcoEcoR IR I、HpaHpa II II、 EcoEcoR I+R I+HpaHpa II II消化这一消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNADNA片段，溴乙片段，溴乙锭染色后观察锭染色后观察DNADNA带型（见图）。请根据这些结果绘制一带型（见图）。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明个限制性图谱，要标明EcoEcoR IR I和和HpaHpa II II识别位点间的相对识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（位置，以及它们之间的距离（kbkb）限制性核酸内切酶的命名DNA连接酶连接酶n
47、n特性：n n DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是： 将DNA双链上的相邻碱基的5-PO4和和3-OH共价结合形成 3-5磷酸二酯键磷酸二酯键 限制性核酸内切酶的命名DNA连接酶连接酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名 DNA连接酶不能够连接两条单链连接酶不能够连接两条单链DNA分子或环分子或环化单链化单链DNA。实际上，。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口（骨架上的切口（nick） 限制性核酸内切酶的命名n n分类：分类：n n DNADNA连接酶连接酶n n T T4 4DNADNA连接酶连接酶n n T
48、scTsc DNA DNA连接酶连接酶n n区别区别 ：n n 催化反应中能量来源不同催化反应中能量来源不同n n 连接能力不同连接能力不同n n 分子量大小分子量大小限制性核酸内切酶的命名n n连接反应是一个吸能的反应，连接反应是一个吸能的反应，连接反应是一个吸能的反应，连接反应是一个吸能的反应，E.coliE.coli 及其它细及其它细及其它细及其它细菌以菌以菌以菌以NADNAD为能源，动物及噬菌体以为能源，动物及噬菌体以为能源，动物及噬菌体以为能源，动物及噬菌体以ATPATP为能源为能源为能源为能源n n基因工程中常用的基因工程中常用的基因工程中常用的基因工程中常用的DNADNA连接酶是
49、连接酶是连接酶是连接酶是T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶n n连接酶的最佳反应温度是连接酶的最佳反应温度是连接酶的最佳反应温度是连接酶的最佳反应温度是3737，但在这个温度，但在这个温度，但在这个温度，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在此连接反应的温度一般在此连接反应的温度一般在此连接反应的温度一般在415415，TscTsc DNA DNA连连连连接酶在接酶在接酶在接酶在90 90 以上高温仍保持活性。以上高温仍保持活性。以上高温仍保持活性。以上高温仍保持活性。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名
