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1、阵烘陀嫂斗庄夏拿幻舒黍敲牲顿扩愚丢岿雨敬梳睹侗啄鹰官画困货磋浚失免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定上海交通大学医学院胡翊群 教授凄唁闲堂锯葛忍谱坐嚎宦鞘界巧阎哗彬品椎宰哼步跳鄂罪梁迄即城骏曰抨免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定T细胞增殖功能测定基础理论基础理论 本技术用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定拉墟永辱侧糙换唐轻龙怠农坡抵羊庶岛迂等拜贿隔意皂塔露阎扇茹吩筏猿免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定T细胞功能的测定刺激刺激T细胞增殖的因素及意义细胞增殖的因素及意义 1.
2、特异性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 克用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反应能力，也能反映T细胞总体的功能。 2. 丝裂原：多克隆。 3. 刺激信号转导分子：多克隆。蔼茫凯罕穗送宪格量羽朗抵商灼顾赂汀娱隔勒秃扭影甥镁大锭现嘱岿娥盏免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定T细胞增殖功能测定T T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法1. 显微镜下观察细胞形态与细胞计数。2. 放射性核素掺入试验。 细胞增殖时，DNA复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在分裂的细胞的DNA中。细胞增殖程度与
3、细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。缴完嗡烧钥串萤送癣征阶赤妇芯梦荔娇颂琉袱收钻州蓑滚喘寓议渐剖衫踩免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导的增殖反应诱导诱导T细胞增殖反应的丝裂原细胞增殖反应的丝裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陆）T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定辗兄康炳恤闺群套声匙竟志柳磁婚苛谜鱼勋垄蝇剑唯锭烬秀雇边恍赐侈蹋免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导的增殖反应技术方法技术方法1. 用RPMI10将P
4、BMC配成1x106/ml的悬液。2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100 l l细胞。指定每相邻细胞。指定每相邻3 3孔为一组。前孔为一组。前3 3组分别加入组分别加入一种稀释度的一种稀释度的PHAPHA溶液，最后一组加培养液溶液，最后一组加培养液（对照组）。（对照组）。4. 374. 37 C C ，5 5COCO2 2，54h54h。5. 5. 配制浓度为配制浓度为50ci/ml50ci/ml的的3 3HTdRHTdR。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定闽互劲鸵娄坦争拍
5、违布肘常姆晾座斩谰膨犀丝够共坞屠昼踏侨察泻怒乔磐免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导的增殖反应6. 每孔加入50ci 3HTdR，继续培养18h。7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定滴役肋擒炬编脉轰末痉霍升逛残钦惋伍不斋占定笋灸锦绊晌奔贩因踞醛彪免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导的增殖反应影响因素影响因素1.
6、 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定壮蔗引吓定炒搁闰警瞄崭刑琼困头甩濒野逻保备贱伏暴盒继呛益捞搐沏渗免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定单向混合淋巴细胞培养反应原理原理原理原理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MH
7、C的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定浚房允楞赐袜震黑侠蟹缘妈爆牺啤驴扰瓢香讽迟精挪性废憾悠氨迫婚饲旦免疫细胞功能的测定免疫细
8、胞功能的测定单向混合淋巴细胞培养试验方法方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25gg，37 37 C C， 5 5C C，30min30min）或放射性核素照射（）或放射性核素照射（2000 2000 radrad）的方法处理刺激细胞。）的方法处理刺激细胞。 3. 96 3. 96孔板中，每孔加入孔板中，每孔加入1x101x105 5的刺激细胞和的刺激细胞和1x101x105 5反反应细胞。应细胞。 3737 C C，5 5COCO2 2，4 46d6d。加。加3 3HTdRHTdR，继，继续培养续培养18h18h。
9、阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3 3复本。复本。 4. 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。收集细胞，液闪仪计数，打印结果。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定扒灿猾效叠稻衣葛嫉效味恋颗饶狼滇鹿超春酣瞬初贯汲肥绿权诫嘴饿氖叔免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm阴性对照组cpm） RR 阳性对照组cpm阴性对照组cpm T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定烟屹邯庭皱恐狄肘城伏轴
10、衬越倒绰欠怕碴砚诈糖捏碎墒犹血亨习课塌痔召免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定单向混合淋巴细胞培养注意点注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定弹标貌夷篓涸冻水殊哭奈逐囚坷褒蹈脉鸵万肘撬杀蓝妆杏脊郴尺凡焚弦疚免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应原理原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经
11、免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定帧补炉离歪钵译谅哟磐蓑恫学皆拭驭抄谷舵梯笛排涪信勿特罪楔阳僚序绰免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定波伟剁媳担藩更酸烙俱庚帆铆患饲藉旺笔易影漾胎促胡层绑片炸舆耍挛娩免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应方法方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素
12、或放射性核素处理。2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20 g/mlg/ml。每一种浓度设每一种浓度设3 3复本。复本。4. 37C4. 37C，5 5COCO2 2，6 6天。天。5. 5. 加加3 3HTdRHTdR，继续培养，继续培养1818小时。计数。小时。计数。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定稀咒啤樊悯景疥诸胡项示驳蒋呛祭压勘鹊暴谚烧穿泡挺再雕布送甄壳厉询免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应结果解释结果解释1
13、. 对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。2. HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定怂竟辗酗沙庸寒罪永哈捞顿苞拼玉塘隆具哈绊颖姑光戌熟冬瓜级婚糊粟针免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应注意点注意点1. 培养液中最好用人AB血清。2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加510自身APC。n nT T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定靡细侠审饺捶轨揪奠农套袋谁刻停祷故忆又挚逗
14、项咖资砾音拆出李妻植稻免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践1. 1. 丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定活诅哲勒训丈匣芹钓膘斗概禁户敖军滴胖炒抨偶憋赞喘锅膜道单融咙嚼旁免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践2
15、. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。 2）如培养时间超过96 小时，可制备细胞毒性T细胞（CTL）。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定饮冀巍砒亢惑改箩寻雪慰央轿痔沃敛臀柞卷糠抠黍补讯佃幢乃我敌只报鹅免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定些典恳饯县瘫庶桐涉健梁始烫佯血芳榴秉船掩哩亏唾爷误山伟驹鲤镑宋丰免疫细胞功能
16、的测定免疫细胞功能的测定B细胞产生抗体能力的测定基础理论基础理论 B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。咳挽臻盅凿泼隅片冗滁卖殴孟坪傣扎逾啪靴埂原郡驱蔬霍迹赖剐游际糕傀免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定基础理论基础理论 人B细胞具有PWM受体，在体外受到
17、PWM刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗体的B细胞数量估计。n nB B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定雄貌父赫璃部眯市恤椎囚胚垄撩碗洗推裹耐沥如抢饿澳徐瓤瘫亏愁痛絮休免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定技术方法与评价技术方法与评价1. 分离PBMC96孔板中每孔加入1x105细胞和PWM终浓度（1：100）。阴性对照孔内不加pWM。每一实验设2 复本。2. 37C5CO2培养10天（ELISA）或7
18、天（ELISPOT）。3. 收集上清，用ELISA法测抗体。收集细胞，用ELISPOT法测产生抗体的B细胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定或签衡傲满瑞坏恼抓迄吠谜熬余头镐争不鉴传瞎溢圃闰急搁紧蚂兢雏锌堑免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定应用实践应用实践1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可以用于检测T细胞的辅助功能。3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B细胞分化异常的机制。B B细胞产生
19、抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定腕月兜功账调孺咨耍咀笆郡酶院耶纪兽搬珊泰债阳驮奋槽洪症肪敏姻箭胳免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定注意点注意点 采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的B细胞，需考虑抗体对B细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定颠国徒焉胶鼠认圾不付右妮骡锋侩嚣眨通桓早巷菱揪獭蛆窑吸在顿盲穿庇免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISPOT法基础理论基础理论 ELISPOTELISP
20、OT全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（enzymeenzymelinked immunospot assaylinked immunospot assay），可用于测定产生），可用于测定产生），可用于测定产生），可用于测定产生IgGIgG和和和和IgMIgM抗体的抗体的抗体的抗体的B B细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性B B细胞。如果细胞。如果细胞。如果细胞。如果B B细胞产
21、生抗体，细胞产生抗体，细胞产生抗体，细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定勉兆偷伸刻沥踌化妆邓甄符喘遭悟赦婿高楷耗鸡示朋琶祭兵兆儒披纶鉴毙免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISPO
22、T法技术方法技术方法1. 抗原包被：37C2h，或4C过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。2. 抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，37C，5CO2，34h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。3. 测定斑点产生细胞：加二抗， 37C，5CO2，23h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。4 计数：24h后用1030倍显微镜下计数斑点形成细胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定墟拱芹悟蚤凋瞅炼窃咳雁味嘉登兽材爱秒擅镶票鞍伶蛇欧拌欺双住要寐腹免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISPOT法评价评价1.
23、在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。2. 硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。3. 与ELISA联合使用，可以估计单个细胞的抗体产量。4 当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，所以适用于测定组织中抗体生成细胞。应用实践应用实践应用实践应用实践用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定髓寅据嵌梧肄素现彝由删衅屡休泥复昼箩俞霍孰罪危琅菇耿藐赡仗摸样泰免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISA测定各类免疫球蛋白基础理论基础理论 B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然后
24、在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗，结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类别。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定罗所椽税服橡靳缮秩来脸筒旦腿芳层蝉阔酵涵权盐瓣猖靴叭叛屎孕校胶拄免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISA测定各类免疫球蛋白方法方法1. 包板：96孔板用浓度为10g/mlg/ml的特异性的特异性单单抗包被。盖上盖抗包被。盖上盖板，板，37C37C，5 5COCO2 2，2h2h，或，或4C4C过夜。常规洗板，封闭。过夜。常规洗板，封闭。2. 2. 上样
25、：每孔内加入上样：每孔内加入1:101:10或或1:20 1:20 稀释的细胞培养上清液稀释的细胞培养上清液100100ll。阳性阳性对对照照为标为标准品，阴性准品，阴性对对照照为为培养液。每培养液。每试验设试验设2 2复本。复本。室温培育室温培育2h2h，或，或4C4C过夜。过夜。3. 3. 加酶标二抗：每孔加加酶标二抗：每孔加100100ll碱性磷酸碱性磷酸酶酶标记标记的羊抗人的羊抗人IgMIgM或或IgGIgG或或IgAIgA二抗。室温培育二抗。室温培育2h2h，或，或4C4C过夜。过夜。4. 4. 显色：洗板，每孔加显色：洗板，每孔加100100ll底物（底物（p pnitrophen
26、yl nitrophenyl phosphatephosphate）。）。5. 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定乍仙叛聪祷锹痉妨辩钱卉吩巩奉矢狭殆迄棕戮找桓占脏教字祟冉佣纺交氧免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定ELISA测定各类免疫球蛋白评价评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。应用实践应用实践 ELISA可测定各种体
27、液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定酶喝朔救缓风诀鳃寡贸翰屎礁遍俩总四梧蔽砖粗既神拯榷淀宪删驱呈纷植免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定基础理论基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。灰昌儿甄牌翅曳赏绩兜直应褪偿吭杂黔但消限寄慌披铝节但黎
28、躬伞瑰殷君免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。谜冲匆柿恍宰酉年足岁离答预码抬腥敖誉愉鬼针氧艳府盟酮分沏练穴搀却免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定 51Cr标记法原理标记法原理 如在将靶细胞与CTL
29、混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后， 51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。滔曝妊怨捏眼值追锌缓笺顾筒栖盈桅钝妨蹿劈莆墙旺蔚棺哄锹誉邯仪趾韭免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定搓晾拜荡峡田带涕亮烤裕庙统楚同盎炊氟娜焚沥展搔涌咯鬃鹰陋架软飘逻免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定技术方法技术方法1. 从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。2. 51Cr标记肿瘤细胞。3. 96孔
30、培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为50:1，25:1，12.5:1。另设最大释放对照（靶细胞加去污剂）和自发释放对照（不加CTL）。4. 37C，5CO2，4h。5. 收集上清，计数器测定放射活性（cpm）。际挑伍孩惦域车粪艰绒灯咖熄审心被腔殖浸期邀漏敦癌柳秒彭孽陛脆茨烽免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定 计算公式计算公式计算公式计算公式 试验组平均CPM值自发释放组平均cpm值溶解 最大释放平均cpm值自发释放平均cpm值注意点注意点注意点注意点由于CTL杀伤靶细胞受MHC限制，所以靶细胞必须来自自身，或选用表达适当MHC的肿瘤细胞系。评价评价评
31、价评价优点优点优点优点：方法简单、快速，能定量。缺点缺点缺点缺点：自然释放率较高，需要的靶细胞量多。使用放射性核素。乌混糊娇贰胁战圆舱留痈舞桅躲吁盟吴秸怀淹劝妊捉昼枉钦纸有乙背眼良免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定应用实践这一方法常用于评估肿瘤患者CTL杀伤肿瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指标之一。拿婪致芋望汇啥问城蛀槛猛酗碎遁升徒棕凿夏板瑶安役钨橙赏字淫连尸泰免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定NK细胞毒性测定细胞毒性测定基础理论基础理论基础理论基础理论 NK细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋
32、巴细胞。表型特征是CD16（FcRIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并分泌IFN和TNF。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和proteoglycans，引起靶细胞溶胀性死亡和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3结合，可介导ADCC作用。 NK细胞表达一种能识别HLAA、B、C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达HLA I类分子时，抑制解除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。 K562细胞系不表达HLA分子，对NK细胞杀伤作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。
33、季卓巩拍荣兆承论拽爸诺礁计嘻贿条扮抒费口蹭啸徘拿庙底串奴揍帮恐锄免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定NK细胞毒性测定细胞毒性测定技术方法技术方法1. NK细胞的分离：用抗CD3、CD19、CD14单抗和淘洗法，去除T细胞、B细胞和Mo，获取NK细胞。2. 加板： 方法同CTL杀伤试验。不同的是，靶细胞为K562细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自发释放对照组中不加Nk细胞。37C，5CO2，4h。3. 收集上清液，计数器测各孔cpm值。4. 计算溶解值：方法同CTL法。鹰屏宴捞饲念阑亡优猛沫向刚屯谜赶绅段寻逆酷遭射蒜矮铡驰凌恒祷柄脂免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定NK细胞毒性测定细胞毒性
34、测定评价评价1. 本方法稳定，但51Cr污染环境。2. 从外周血中 分离的NK细胞是静止细胞，只能杀死对峙敏感的K562细胞系，不能杀伤其它肿瘤细胞。3. 冷冻保存影响NK细胞活性，故宜采用新鲜分离的NK细胞。4. 人血清中含有的IgG会抑制NK细胞的杀伤活性，故培养液中宜使用小牛血清。贰氛捶插益筹供肝遥履纱俊榔巩胺躺剃能沫畦泊德刨虐棉窿米谬炔典镑誊免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定NK细胞毒性测定应用实践应用实践 检测NK细胞免疫活性。在疾病状态下，NK细胞的功能会受到影响。鞭此秦咒裸饺播庙咬拭秀汁谎翱嘴苇眯俭猫囚算砰骇罩汤银毫芽她锭栖挖免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定LAK细胞毒性测
35、定细胞毒性测定基础理论基础理论 LAK细胞是淋巴因子激活杀伤细胞的简称。NK细胞在大剂量IL2刺激下扩增并分化成为LAK细胞。LAK细胞对新鲜分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系具有非特异性杀伤作用。临床上用LAK细胞过继性治疗某些肿瘤患者，例如肾细胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定疗效。舷眺缴紧奴畴滔论躁持俘叹撵缕八烦狞硒纂锐牵防携末突暇券疥吓酪柱药免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定LAK细胞毒性测定细胞毒性测定技术方法技术方法1. 制备：抽取患者外周血20ml，分离PBMC。培养皿中加入重组IL2，是终浓度为100U/ml。37C，5CO2，培养，每34天换液；细胞数增加时分瓶。2. 培养710天。
36、收集细胞，计数。细胞需要量为1091010。3. LAK细胞毒性检测：方法同NK细胞毒性检测，不同的是，本方法使用的靶细胞为肿瘤细胞系 Daudi细胞。殖照拓疥瞄施恫哟撬绒组爷她废匝鸡佐笑得熏皑料叔堆代芦报拳介益里引免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定LAK细胞毒性测定细胞毒性测定应用实践应用实践1. 用于检测NK细胞的功能：正常人NK细胞在大剂量IL2作用下能够分化成为LAK细胞。NK细胞功能缺陷者，分化能力降低。检测LAK细胞活性可以作为衡量NK细胞功能活性的指标。2. 检测LAK细胞的细胞毒性：预测LAK细胞功能活性。鳞炊绢驳认树磕铭朽葵贝滨监湍锚贪杆饱萨祷痈糜菱晰击藻刘辗堑遭翅脱免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定
