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1、 4.4 核酸和核苷酸的性核酸和核苷酸的性质 (Section 4 Properties of Nucleic acid and Nucleotide) 一、溶解性一、溶解性Solubility RNA、Nt、Ns和和Base纯品品为白色粉末或白色粉末或结晶体。晶体。 DNA为纤维状固体。状固体。 核酸核酸为极性物极性物质，核苷酸和核苷可溶于水。，核苷酸和核苷可溶于水。 核核酸酸大大多多与与蛋蛋白白质结合合成成和和蛋蛋白白。在在不不同同的的盐浓度度下，下，DNA蛋白蛋白DNP和和RNA蛋白蛋白RNP溶解度不同。溶解度不同。 核蛋白核蛋白核蛋白核蛋白 + 1mol/L NaCI DNP + 1m
2、ol/L NaCI DNP溶解溶解溶解溶解 + RNP + RNP 核蛋白核蛋白核蛋白核蛋白 + 0.14 1mol/L NaCI DNP + RNP + 0.14 1mol/L NaCI DNP + RNP溶解溶解溶解溶解 ( (低低低低盐盐DNPDNP不溶，高不溶，高不溶，高不溶，高盐盐RNPRNP不溶不溶不溶不溶) ) 核蛋白核蛋白核蛋白核蛋白 在在在在pH4.2pH4.2pH = pIpH = pI时时，DNP DNP ，RNPRNP溶解溶解溶解溶解 核蛋白核蛋白核蛋白核蛋白 在在在在pH2pH22.5 2.5 pH = pIpH = pI时时， RNP RNP ，DNPDNP溶解溶解
3、溶解溶解 二、核酸及其二、核酸及其二、核酸及其二、核酸及其组组分的两性性分的两性性分的两性性分的两性性质质 1. 1. 碱基解离，第一位都在碱基解离，第一位都在碱基解离，第一位都在碱基解离，第一位都在N N上上上上, , 解离位点：解离位点：解离位点：解离位点： A A：在：在：在：在N1N1解离，解离，解离，解离， G G：在：在：在：在N7N7解离，解离，解离，解离， U U：在：在：在：在N3N3解离，解离，解离，解离， T T：在：在：在：在N3N3解离，解离，解离，解离， C C：在：在：在：在N3N3解离，解离，解离，解离，2. 2. 核苷核苷核苷核苷 NsNs 解离解离解离解离糖
4、糖糖糖的的的的存存存存在在在在使使使使N N解解解解离离离离pKpK值值值值降降降降低低低低，而而而而糖糖糖糖上上上上OHOH的的的的解解解解离离离离无无无无足足足足轻轻轻轻重重重重 pK pK 在在在在12 12 以上以上以上以上 3. 3. 核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 NtNt 解离解离解离解离PiPi有两次解离，有两次解离，有两次解离，有两次解离，pKpK0.70.71.6 pK1.6 pK6.16.16.56.5 NtNt含含含含碱碱碱碱基基基基和和和和PiPi，为为为为两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质，当当当当正正正正、负负负负解解解解离离离离速速速速度度度度相等相等相等相等时
5、时时时，该该该该pHpH即即即即为为为为pIpI， U U、T T除外除外除外除外, ,不不不不带电带电带电带电荷荷荷荷 pI = (pK+ pK) / 2pI = (pK+ pK) / 2，pKpK为为为为PiPi第一解离，第一解离，第一解离，第一解离，pKpK为为为为 N N解离解离解离解离eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35了解了解了解了解NtNt的解离及的解离及的解离及的解离及pI pI ，在制，在制，在制，在制备备备备及分析中极有及分析中极有及分析中极有及分析中极有协协协协助。助。助。助。
6、IP2IPIP2IIP2. 2. 核苷核苷核苷核苷 NsNs 解离解离解离解离糖糖糖糖的的的的存存存存在在在在使使使使N N解解解解离离离离pKpK值值值值降降降降低低低低，而而而而糖糖糖糖上上上上OHOH的的的的解解解解离离离离无无无无足足足足轻轻轻轻重重重重 pK pK 在在在在12 12 以上以上以上以上 3. 3. 核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 NtNt 解离解离解离解离PiPi有两次解离，有两次解离，有两次解离，有两次解离，pKpK0.70.71.6 pK1.6 pK6.16.16.56.5 NtNt含含含含碱碱碱碱基基基基和和和和PiPi，为为为为两两两两性性性性电电电电解解解解质质质
7、质，当当当当正正正正、负负负负解解解解离离离离速速速速度度度度相等相等相等相等时时时时，该该该该pHpH即即即即为为为为pIpI， U U、T T除外除外除外除外, ,不不不不带电带电带电带电荷荷荷荷 pI = (pK+ pK) / 2pI = (pK+ pK) / 2，pKpK为为为为PiPi第一解离，第一解离，第一解离，第一解离，pKpK为为为为 N N解离解离解离解离eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35了解了解了解了解NtNt的解离及的解离及的解离及的解离及pI pI ，在制，在制，在制，在制
8、备备备备及分析中极有及分析中极有及分析中极有及分析中极有协协协协助。助。助。助。IP2IPIP2IIP 4、核酸分子的解离、核酸分子的解离Dissociation 核酸和多核苷酸核酸和多核苷酸链除了末端磷酸残基外，磷酸二除了末端磷酸残基外，磷酸二酯键中磷酸残基只需一个解离常数，中磷酸残基只需一个解离常数， pK1 =1.5 三、紫外吸收三、紫外吸收(260nm，定性和定量分析，定性和定量分析) 但分子量差但分子量差别大，大，纯质不一，不一，难以用以用NA分量分量浓度来表示其消光系数，故常用摩度来表示其消光系数，故常用摩尔磷消光系数磷消光系数. (p)每升溶液中含每升溶液中含1mol 磷的核酸溶
9、液磷的核酸溶液pH=7的消光系数。的消光系数。260nm: DNA=7,00010,000 RNA=6,0008,000四四 、 核核 酸酸 的的 变 性性 与与 复复 性性 Denaturation and renaturation of NA 一一 Denaturation of NA 定定义: NA受受热、酸酸碱碱、有有机机溶溶剂、辐射射、及及尿尿素素等等变性性剂作作用用，皆皆引引起起变性性，所所谓变性性：氢键断断裂裂，双双螺螺旋旋构构造造解解开开，从从而而引引起起紫紫外外(p) 添添加加hyperchromie effect ，增增色色效效应、失失去去生生物物活活性性、粘粘度度下下降降
10、双双股股无无规线团与与pr反反、比比旋旋下下降降 等等性性质改改动的的过程程叫叫变性。性。(与降解不同，无共与降解不同，无共键的断裂的断裂) DNA的变性的变性(denaturation)方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性量变化：变性后其它理化性量变化：OD260OD260增高；粘度增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改动；生物活性改动曲线改动；生物活性改动DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本
11、质是双链间氢键的断裂增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液OD260OD260增高的景象。增高的景象。 用途： a. 作为判别变性，复性的目的 变性hyperchromic effect增色效应， (p) 复性hypochromic effect减色效应，(p) b. 测NA浓度 常用 热变性及变性温度 热引起 变性温度(Tm)紫外吸收值达最高值的一半时溶液所处的温度(突发过程，相当窄的温度)。 或双螺旋构造失去一半时的温度melting temperature，溶解温度，解链温度。DNA， Tm = 7085oC 。DNA变性Tm与以下要素有关： 样样品均一性品均一性品均一
12、性品均一性 越均一，温度越窄。是均一性的越均一，温度越窄。是均一性的越均一，温度越窄。是均一性的越均一，温度越窄。是均一性的检验规检验规范范范范 溶液离子溶液离子溶液离子溶液离子强强度增高，度增高，度增高，度增高，TmTm值值添加添加添加添加 G GC C含量含量含量含量 pH 7.0 pH 7.0，0.165M NaCl0.165M NaCl中中中中DNADNA的的的的TmTm值值与与与与GGC C含量成正比。其它条件亦含量成正比。其它条件亦含量成正比。其它条件亦含量成正比。其它条件亦类类似。可似。可似。可似。可用下面公式用下面公式用下面公式用下面公式计计算算算算G-CG-C百分含量：百分含
13、量：百分含量：百分含量： G GC C TmTm69.369.3 2.44 2.44 如某如某如某如某DNA TmDNA Tm值值值值在在在在pH 7.0pH 7.0、 0.165M NaCl0.165M NaCl中中中中为为为为80C80C G GC C 10.72.44 = 26.1 10.72.44 = 26.1 当当DNADNA的稀的稀盐溶液加溶液加热到到80-10080-100时，双螺旋构造，双螺旋构造即即发生解体，两条生解体，两条链彼此分开，构成无彼此分开，构成无规线团。 80 90 100 100%50%OD260254 Tm 变性温度范围变性温度范围融融解解温温度度meltin
14、g melting temperature,Tmtemperature,Tm：DNADNA热热变变性性过过程程中中，紫紫外外吸吸收收到到达达最最大大值值的的一一半半时时溶溶液液的的温温度称为融解温度度称为融解温度TmTm或解链温度、变性温度。或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法室常用的方法热变性性 1变性后理化性质改动变性后理化性质改动DNA溶液的粘度降低溶液的粘度降低浮力密度添加浮力密度添加旋光偏振光改动旋光偏振光改动紫外吸收添加高色效应紫外吸收添加高色效应高色效应高色效应hyperochromic effect：DNA变性变性后，在后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或处的紫
15、外吸收增高，称为高色效应或增色效应。增色效应。 2变性后的变性后的DNA一级构造没有改动。一级构造没有改动。总结：总结：3融融解解温温度度melting temperature,Tm：DNA热热变变性性过过程程中中，紫紫外外吸吸收收到到达达最最大大值值的的一一半半时时溶液的温度称为融解温度溶液的温度称为融解温度TmGC含量越高，含量越高，Tm越大越大DNA越长，越长，Tm越大越大溶液离子强度增高，溶液离子强度增高，Tm值添加值添加DNA越纯，相变范围越小越纯，相变范围越小 二复性Renaturation 指变性DNA分子在适当的条件下，解开的互补双链可重新恢复天然的双链螺旋构造。 热变性的DN
16、A在缓慢冷却后复性的过程称为退火。 复性条件： 1缓慢冷却 2片段小，易复性 3均质易复性 4浓度大易复性 5高度反复序列，易复性 减色效应减色效应hypochromic effect :DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。 复性速度常用复性速度常用复性速度常用复性速度常用Cot1/2Cot1/2表示表示表示表示 Co Co：变变性性性性DNADNA浓浓度度度度( (以以以以Nt molNt mol数表示数表示数表示数表示) )； t t： 复性复性复性复性时间时间 秒。秒。秒。秒。 Cot1/2 Cot1/2表示表示表示表示DNADNA复性复性复性复性5050 所需所需所
17、需所需时间时间与与与与DNADNA浓浓度的乘度的乘度的乘度的乘积积。在在DNA变变性性后后的的复复性性过过程程中中，假假设设将将不不同同种种类类的的DNA单单链链分分子子或或RNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，只只需需两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系，在在适适宜宜的的条条件件温温度度及及离离子子强强度度下下，就就可可以以在在不不同的分子间构成杂化双链同的分子间构成杂化双链(heteroduplex)。这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNA与与DNA之之间间构构成成，也也可可以以在在DNA和和RNA分分子子间间或或者
18、者RNA与与RNA分子间构成。这种景象称为核酸分子杂交。分子间构成。这种景象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) 核核酸酸的的杂杂交交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸分子杂交的运用核酸分子杂交的运用: :研讨基因的位置研讨基因的位置确定两种核酸序列的类似性确定两种核酸序列的类似性检测样品中的特异序列检测样品中的特异序列基因芯片技术的根底基因芯片技术的根底 核酸探针核酸探针nucleic acid probe:能特异性的探测带某一能特异性的探测带某一特定序列的特定序列的DNA或或RNA分子的标志核
19、酸分子。分子的标志核酸分子。 核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) n由不同来源的核酸单链构成杂化双链的过程由不同来源的核酸单链构成杂化双链的过程n分子杂交技术的运用：基因克隆挑选、酶切图分子杂交技术的运用：基因克隆挑选、酶切图谱制造、特定基因序列的定量和定性、突变分谱制造、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等析、疾病诊断等 4.5 Nt类物物质的制的制备及运用及运用 一、一、 核酸核酸组分分Nt、Ns和和Base的制的制备 一一 降解方法降解方法 酸解酸解NA，直接得碱基或无，直接得碱基或无嘌呤酸，糖苷呤酸，糖苷键断。断。PuPy purinepyrimidine
20、；deoxyoxy 碱解碱解RNA0.31M NaOH，得，得2, 3 环式式Nt，进一步生成一步生成 2或或 3 Nt、Ns ( Nt 代表核代表核苷酸，苷酸， Ns代表核苷的代表核苷的缩写写 DNA无无2-OH，不能生成，不能生成2, 3 环式式Nt，相，相对抗碱。抗碱。 酶解 限制性内切酶类，以后再讲。 外切酶类1.牛脾磷酸二酯酶 作用方式:5-3外切 底物:RNA，DNA，5 -OH专注，3断裂 产物: 3 Nt2. 蛇毒磷酸二酯酶 作用方式: 3 -5外切 底物: RNA，DNA，3 -OH专注，5断裂 产物: 5 Nt。与桔青酶磷酸二酯酶同 二分别水解产物经以下方法和技术分别：纸层
21、析纸电泳薄层层析离子交换层析，大量消费 三运用 1. 研讨用试剂 肌苷用于血液保管， 2. 强力味精鸟苷酸，肌苷酸与味精混合，鲜味添加几十倍 3. ATP， GTP改善代谢功能； 5FU抗癌作用；聚肌胞=聚肌苷、聚胞苷，抗病毒，是干扰素诱导剂肝炎 二、二、二、二、Prperation of NAPrperation of NADNA and RNADNA and RNA 一制一制一制一制备备NANA时时留意的几个留意的几个留意的几个留意的几个问题问题 防止核酸防止核酸防止核酸防止核酸酶酶的水解的水解的水解的水解 加核酸加核酸加核酸加核酸酶酶抑制抑制抑制抑制剂剂或去核酸或去核酸或去核酸或去核酸酶
22、酶激活激活激活激活剂剂。 防止化学要素的降解防止化学要素的降解防止化学要素的降解防止化学要素的降解 提取提取提取提取NANA常用酸碱法，但要防止常用酸碱法，但要防止常用酸碱法，但要防止常用酸碱法，但要防止过过酸酸酸酸过过碱。碱。碱。碱。 防止物理要素的降解防止物理要素的降解防止物理要素的降解防止物理要素的降解 高温、机械等作用力破坏高温、机械等作用力破坏高温、机械等作用力破坏高温、机械等作用力破坏NANA构造，构造，构造，构造，应该应该在低温暖温暖条件下在低温暖温暖条件下在低温暖温暖条件下在低温暖温暖条件下进进展。展。展。展。二二DNA的制的制备 辛醇辛醇氯仿法仿法 Et-OH DNA水相水相
23、 DNA 核蛋白溶液辛醇核蛋白溶液辛醇氯仿仿 Pro 水与水与氯仿相仿相之之间 SDS法法 SDS将将Pro变性，与性，与DNA分分别 苯酚法苯酚法 苯酚将苯酚将Pro变性，抑制性，抑制Nuclease活性。活性活性。活性DNA在水相在水相 三RNA的制备 粗提方法：苯酚法；稀碱或盐溶液与pI结合运用。 提取不同RNA时，先用离心法分别细胞器，再提取相应的RNA。 如rRNA从核糖体中提取，tRNA从细胞质中提取，mRNA从多聚核糖体中提取。 精制方法：分子筛层析，密度梯度离心，DEAE-Sephadex，Poly dT 亲和柱(精制mRNA，与mRNA尾巴Poly A特异结合)等。 4.6
24、NA 4.6 NA的分析的分析的分析的分析测测定和研定和研定和研定和研讨讨方法方法方法方法一、一、一、一、NANA及其及其及其及其组组分含量的分含量的分含量的分含量的测测定定定定 一紫外吸收法朗白比一紫外吸收法朗白比一紫外吸收法朗白比一紫外吸收法朗白比尔尔定律定律定律定律 纯纯NANA，DNA(1g/ml) = 0.020A260nmDNA(1g/ml) = 0.020A260nm RNA(1g/ml) = 0.022 RNA(1g/ml) = 0.0220.024A260nm0.024A260nm 即一个即一个即一个即一个A A值值50g/ml 50g/ml 双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋DNAD
25、NA 一个一个一个一个A A值值40g/ml RNA40g/ml RNA或或或或单链单链DNADNA 二定糖法二定糖法二定糖法二定糖法 RNA RNAH+ H+ 3 3，5 5二二二二羟羟基甲苯苔黑酚，地衣酚基甲苯苔黑酚，地衣酚基甲苯苔黑酚，地衣酚基甲苯苔黑酚，地衣酚 绿绿色色色色产产物物物物A670nmA670nm DNA+ H+ DNA+ H+ 二苯胺二苯胺二苯胺二苯胺 蓝蓝色色色色产产物物物物A600nmA600nm 三定磷法三定磷法三定磷法三定磷法RNARNA和和和和DNADNA总总量量量量 消化 定磷试剂NA(DNA和RNA) + H+ 有机磷转化为无机磷 蓝色产物总磷， A650n
26、m660nm 核酸磷真实含量总磷无机磷 纯核酸含磷量约9.5%，1g磷10.5g核酸100/9.5 四琼脂糖凝胶电泳法尤其用于DNA测定和分析 DNA样品进展琼脂糖凝胶电泳加溴乙锭，插入DNA中使荧光加强,荧光强度与DNA含量正比。与规范品对照可测定样品中DNA的量。 二、二、NA纯度分析度分析 方法：方法：测定双定双链和和单链DNA的吸收光的吸收光谱；双；双链向向单链转化化过程中的光吸收添加增色效程中的光吸收添加增色效应三、三、DNA的的PAGE 测定定DNA、片断和基因的相、片断和基因的相对分子量大小。分子量大小。 常用常用规范分子量的范分子量的DNA 作作对照，照，计算算样品品DNA的分
27、子大小。的分子大小。 鉴别分子量一分子量一样，但构象不同的，但构象不同的DNA 在在 PAGE中的迁移率大小：中的迁移率大小： 超螺旋型超螺旋型SC) 线形分子形分子L 开开环状分状分子子OC 四、核酸分子四、核酸分子杂交交 Hybridization 热变性性的的DNA单链，在在复复性性时并并不不一一定定与与同同源源DNA互互补链构构成成双双螺螺旋旋构构造造，它它也也可可以以与与在在某某些些区区域域有有互互补序序列列的的异异源源DNA单链构构成成双螺旋构造。双螺旋构造。 这样构构成成的的新新分分子子称称为杂交交DNA分分子子。DNA单链与与互互补的的RNA链之之间也可以也可以发生生杂交。交。
28、 经典方法：如今少用典方法：如今少用 1RNA用同位素用同位素标志志 2与与变性性DNA在在0.9M NaCl，0.09M乙乙酸酸钠中中66，保保温温24hr。 3RNase除去未除去未结合合RNA 4微孔膜微孔膜过滤去除多余去除多余DNA 5测膜之放射性膜之放射性强度，度，计算算杂交量交量核核酸酸的的杂杂交交 常用方法： 1. Southern blotting： DNA + 限制性内切酶 大小不同的DNA片断 琼脂糖凝胶电泳 NaOH变性处置 转DNA至硝酸纤维素膜 80 46h烘烤固定，与标志的知序列的DNA探针在高盐浓度，68，10h杂交 冲洗未杂交DNA 放射自显影见下页图示。 用于
29、分析RNA那么为: Northern blotting。 用于分析pr为: Western blotting免疫印迹。 用途： 1研讨DNA构造与探针杂交 2研讨DNA功能 六、PCRDNA聚合酶链反响，Polymrase Chain Reaction体外扩增DNA的一种重要技术。 一根本步骤为： 设计一对引物，以便有效扩增所需求的DNA序列，并尽量减少能够产生的非特异性产物。 优化反响体系，以便获得最正确的扩增效果。 体系组成：模板、引物、4种dTTP、Tag DNA polymerase、Mg2+. 选择3个温度下进展热循环。 a. 变性, 94oC，4560s； b.退火根据引物与模板的
30、Tm值定1min； c. 延伸，72oC，1min。开场时热变性510min，热循环2530个周期，最后延伸10min。 扩增完成后，取出一定量反响产物，检查扩增结果。通常扩增106倍。 PAGE，溴乙锭，紫外灯下察看。见下页图示 二PCR的主要用途 遗传病和某些疑问疾病的诊断以及孕妇的产前检查。 法医和刑侦鉴定。 癌基因的检查。 基因探针的制备。 基因组测序。 基因突变分析和定位诱变。 DNA重组。 基因的分别和克隆 欲扩增的目的欲扩增的目的DNA片断片断的两条链分别作为模板的两条链分别作为模板第一次循环获得的第一次循环获得的4条条链分别作为模板链分别作为模板第二次循环获得的第二次循环获得的8条链分别作为模板条链分别作为模板28h 2005.10.21
