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1、第四章 蛋白质的稳定性和稳定化第一节 蛋白质的稳定性一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。二、蛋白质稳定性的分子原因 1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结合作用。金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。 1精选课件2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水
2、区域，从而显著增加蛋白质稳定性 2精选课件3、盐桥和氢键蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20。用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质稳定性无关。3精选课件4 二硫键大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性。稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低4精选课件物质的熵是它所处状态的分子混乱度 物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对应比较有序
3、的状态,熵值大的状态对应比较无序的状态。一种物质从固态到液态到气态,分子热运动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增大。 5精选课件5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低。6精选课件6、氨基酸残基的坚实装配蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。分子量为23万的蛋白质中约
4、有个515水分子 。由布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法。7精选课件7、疏水相互作用带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序地排列。水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白球体内部。从而蛋白质稳定性增加。8精选课件第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理失活机理变性条件聚合
5、（有时伴随形成分子间二硫键）加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS,振动 一级结构改变1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和自溶作用极端pH值，加热，蛋白水解酶2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环）氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射3、二硫键还原，分子间二硫交换加热，高pH，巯基化合物,二硫化物4、必需巯基的化学修饰金属离子，二硫化物5、蛋白质磷酸化蛋白激酶6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自由基）引起的“自杀”失活底物7、氨基酸的外消旋化加热，极端pH8、二硫键剪切后形成新氨基酸（赖氨丙氨酸、）加热，高pH9、天冬酰胺脱氨加热，高PH辅酶分子从活性部位上解离螯合剂、透析、加热，金属
6、离子寡聚蛋白解离成亚基化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低温吸附到容器表面蛋白质浓度低, 加热“不可逆”构象改变加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍流体中的剪切失活流体形变9精选课件一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。二、聚合聚合分三步进行：N U A As其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。10精选课件1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大限度地减少疏
7、水氨基酸残基的不利的裸露。3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫交换反应。与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。11精选课件三、极端pH 图4-6 碱催化的-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨酸）。硫代半胱氨酸残基12精选课件肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下发生。在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110）蛋白质可完全水解成氨基酸。在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰
8、胺的脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导致酶失活。13精选课件四、氧化作用 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+存在下），于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸。 H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋氨酸氧化成它的亚砜。14精选课件五、表面活性剂和去污剂表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的 去污剂在很低浓
9、度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导致蛋白质不可逆变性。去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界面形成单层。15精选课件图4-7去污剂分子的单体、单层和胶团形成示意图表面活性剂分子的两亲性质使之在水溶液中能自发形成结构有序的多分子聚集体,通常称为胶团16精选课件阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），与蛋白质的结合比例是溶液中游离SDS浓度的函数。当单体SDS浓度使某一生物结合位点饱和时，则以协同方式结合其它位点，导致蛋白质伸展。伸展使先前埋藏的疏水性氨基酸残基暴露，有利于SDS的进一步结合，直至达到饱合为止。对于几乎所有的蛋白质
10、来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。SDS-多肽复合物本质上是胶团，SDS分子聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。六、 变性剂1、脲和盐酸胍 高浓度脲（8-10 mol/L）和盐酸胍（6 mol/L）常用于蛋白质变性，然而，尽管它们作用很有效，却没有普遍接受的作用机理。17精选课件有两个特点已经明确，第一，这些试剂消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作用的疏水相互作用。第二，它们直接与蛋白质分子作用。尽管准确的作用机理不清楚，但脲及盐酸胍广泛用于检测蛋白质可逆伸展的构象稳定性。应当特别注意的是，由脲可自发形成氰酸盐。8 mol/L脲溶液平衡时大约含有0.02 mol/L氰酸盐。
11、氰酸盐可与蛋白质中的氨基和巯基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲溶液应在用前用优质固体脲新鲜配制18精选课件12、高浓度盐 高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要看盐的性质和浓度.与Hofmeister离子促变序列有关：（CH3）4N+ NH4+ K+ , Na+ Mg2+ Ca2+ Ba2+ SO42- CI- Br- NO3- CIO4- SCN-1）越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强，2）愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。（NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用它。相反，NaSCN(硫氰酸钠)是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。19精选课件13、螯合1
12、）结合金属离子的试剂,如EDTA能使金属酶失活，这是由于EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅因子造成的。这类失活常常是不可逆的，但失去金属辅因子也能引起大的构象变化，从而导致活力不可逆丧失。2）螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质，因为螯合剂可稳定有害的金属离子。EDTA：乙二胺四乙酸20精选课件14、有机溶剂 酶既可在水溶液中发挥作用，也可在无水有机溶剂中发挥作用。1）当与水混溶的有机溶剂加入蛋白质水溶液中时，则可看到酶失活。这是因为有机溶剂通过疏水相互作用直接结合于蛋白质，并改变溶液的介电常数。有机溶剂通过增加疏水核的溶解度，降低带电表面的溶解度而具有使蛋白质“从里往外
13、翻”的倾向。2）蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。21精选课件电容器的极板间充满电介质时的电容与极板间为真空时的电容之比值称为（相对）介电常数。物料介电常数物料介电常数水80水泥1.5-2.5甲醇33.7干砂2.5煤油2.8洗衣粉1.2-1.5矿物油2.1纯白糖3油4.6食盐7.5丙酮20碳酸钙8.3-8.8苯2.3聚本乙烯2.4-2.6油漆3.5橡胶2-322精选课件七、重金属和巯基试剂 1、已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇
14、盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。银或汞能催化水解二硫键2、巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是可逆的。3、低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质巯基作用，形成混合二硫键，或者在两个半胱氨酸残基之间形成蛋白分子内的二硫键。双硫试剂与氧化型谷胱甘肽和含有催化作用必需的巯基的酶之间也会发生同样的二硫交换反应。DTNB：5, 5-二硫代二硫代-双（双（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）23精选课件八、热 热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。有两种构象过程能引起不可逆热失活。第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生蛋白质聚
15、合。第二，单分子构象扰动能引起酶失活。高温（90-100）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。 1、Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶失活。2、系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的-氨基作用，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。24精选课件机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。从道理上说，变性是可逆的，但这很难验证，因为常伴随引起不可逆失活的聚合或共价反应。1振动 振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏
16、水残基最大限度地暴露于空气。然后，蛋白质由于疏水区域的暴露而聚合。2剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。九、机械力25精选课件3、超声波 超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。4、压力 0.1-6108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外两个失活机理：第
17、一，已经证明，多亚基酶在高压下可解离成单体，取消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失活是不可逆的。第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有关。26精选课件十、 冷冻和脱水 酶溶液通常可在低温下贮存时间较长时间，也有不少例外，冷冻可使蛋白质发生可逆和不可逆失活。1、在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。如磷酸盐缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，这个pH很容易引起蛋白质的酸变性。2、盐的浓缩可提高离子强度，引起寡聚蛋白质的解离。27精选课件3、 二硫交换或巯基氧化。 随着冷冻
18、进行，酶浓度增加，半胱氨酸浓度也增加。当这种浓缩效应与构象变化同时发生时，分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在-3部分冻结系统内的氧浓度要比0溶液中的高1150倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。28精选课件十一、辐射作用1、不同的电离辐射（如-射线，X-射线，电子，-粒子）对蛋白质分子及其周围水分子产生的化学变化类型是相似的。1）直接作用（辐射对蛋白质分子的影响）引起，电离辐射的直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。2）间接作用（水辐射分解副产物对蛋白质分子的影响）引起，是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是OH(羟自
19、由基)，溶解的电子和H2O2等。29精选课件2、非电离辐射，如可见光或UV辐射也能使蛋白质失活。可见光的光化学氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基团（半胱氨基，色氨酸，组氨酸）。UV辐射能直接破坏蛋白质的氨基酸而使蛋白质失活；胱氨酸和色氨酸残基特别不稳定。30精选课件第三节第三节 蛋白质的稳定化蛋白质的稳定化31精选课件酶稳定化方法概述32精选课件表4-4 酶稳定化方法概述方 法说 明固定化1、酶多点连接于载体上酶构象坚固化；立体障碍防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效应和扩散限制载体的化学和物理性质影响酶分子周围的微环境非共价修饰1、添加剂专一性添加剂使N U平衡向N移
20、动；竞争性添加剂除掉破坏性催化剂；有的中性盐和多羟基化合物的保护作用2、反相胶团反相胶团中酶抵抗有机溶剂变性3、蛋白质间相互作用酶的抗体保护酶化学修饰1、共价交联使酶构象坚固化2、改变离子状态或引入立体障碍的试剂修饰增加、中和或改变酶分子上的带电残基；可溶性大分子的连结抑制与其它溶质（蛋白酶）的相互作用蛋白质工程定点突变取代不稳定的氨基酸残基，引入稳定酶的因素33精选课件一、 固定化1、酶酶固固定定到到载载体体上上后后可可产产生生空空间间障障碍碍，结果，其它大分子难于与酶作用。因此，固定到载体上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋白水解酶自溶的原因。固定化也能抑制化学失活，因为载体
21、阻挡酶不能与失活剂接触。2、底物，配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液之间的分布不均一。视底物和载体的性质（带电、疏水性等），其在载体周围的局部浓度与整体溶液不同，也就是说，酶的微环境有了改变。因此，与游离酶相比常可看到固定化酶的最适pH，底物专一性和动力学常数发生改变。例如，用阳离子交换剂和阴离子交换剂作载体固定的酶，其最适pH分别向高pH和低pH值移动。34精选课件3、当当酶酶包包埋埋在在多多孔孔颗颗粒粒内内，底底物物必必须须先先扩扩散散到到颗颗粒粒表表面面（外外部部质质量量传传递递），然然后后进进入入颗颗粒粒内内部部（内内部部质质量量传传递递），酶酶才才能能与与其其作用。这些扩散限制可明
22、显使固定化酶作用。这些扩散限制可明显使固定化酶“稳定化稳定化”。外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化酶颗粒外表面，外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化酶颗粒外表面，这一过程叫外扩散这一过程叫外扩散内扩散：底物进一步传递到固定化酶颗粒内部，这一过程叫内扩内扩散：底物进一步传递到固定化酶颗粒内部，这一过程叫内扩散散35精选课件4将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡图4-8多点固定酶结构示意图：（A）用双功能试剂交联；（B）共价或非共价连于载体上；（C）包埋到载体的紧密孔中。36精选课件二、
23、二、 非共价修饰非共价修饰1反相胶团反相胶团是由两性化合物在占优势的有机相中形成的。反相胶团不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。在保证酶有效作用所必需的水量的前提下，酶在有机溶剂中的稳定性比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相当稳定，100时的半衰期大于12 h,而水含量大于1%时，酶立即失活。图4-12反相胶团示意图37精选课件38精选课件2 添加剂添加剂许多化合物可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性。这类物质分为三类：1）专一性的底物和配体酶反应的底物或产物、变构效应剂、辅酶或辅酶衍生物能与酶紧密结合（单点或多点结合），因而使天然酶伸展酶之间的平衡向天然酶方向移动，
24、从而对酶的总活力产生有益的影响。如果酶与底物结合，则得到低内能构象，产生的复合物能更好地抵抗变性作用。39精选课件2）非专一性的中性盐和多羟基化合物甘油、糖和聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，并有助于形成“溶剂层”，这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同。它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白水解作用而起稳定酶的作用。 40精选课件3）与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质，如加入的蛋白质，螯合剂和还原剂。螯合剂能络合金属离子，因而可防止活化氧的自氧化作用，也能防止金属离子诱导的聚合作用。然而螯合剂也能除去活性部位必需的金属离子，使酶失活。还原
25、剂可防止必需功能基团的氧化，但它也有缺点。如常用的巯基乙醇能还原蛋白质的二硫键、催化导致聚合的二硫交换反应。添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶抗蛋白水解、抗化学试剂、抗pH变化、抗变性剂、抗稀释作用等的稳定性。41精选课件3 蛋白质间非共价相连蛋白质间非共价相连蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定性。酶的多聚体或酶的聚合体的活力和稳定性也常比其单体高。例如，-淀粉酶与其抗体的复合物在70时的半寿期为16 h，而天然酶的半寿期仅为5 min。 42精选课件三、 化学修饰 1 可溶性大分子修饰酶如：PEG修饰的人血红蛋白可作为血浆代用品，
26、而且具有输血与血型无关，冻干后可永久保存，避免输血时可能发生的肝炎和艾滋病毒感染等优点。用戊二醛将白蛋白偶联到棕色固氮菌超氧化物岐化酶上，所得缀合物的热稳定性明显提高，修饰酶的半寿期约为天然酶的1.5倍（80时保温）；同时，修饰酶抗蛋白水解及酸水解的效能以及抗抑制剂作用都有显著提高。43精选课件2 小分子修饰酶 共价修饰蛋白质达到稳定化的原因：A) 修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定构象; 将酶构象转变成更稳定构象，较难实现，因为由化学修饰引起的构象变化特征一般是很难预测的。B) 由于修饰“关键功能基团”也会达到稳定化; 化学修饰蛋白质时常不能导致稳定性随修饰功能基数目的增加而显著变化
27、。当修饰的功能基数达到临界值时，稳定性突然增加。44精选课件图4-13修饰-胰凝乳蛋白酶NH2-基的数目与抗热失活稳定化效应之间的关系。45精选课件C) 由化学修饰引入到蛋白质中的新功能基可以形成附加氢键或盐键; D) 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中的疏水相互作用; 蛋白质被非极性分子（如硬脂酸、十二烷酸）修饰后，稳定性增加也证明这种稳定化机理的有效性。46精选课件就疏水稳定化而言，最有效的机理应当是在蛋白质的疏水核内引入非极性分子 图4-14 蛋白球体内部修饰法图示。蛋白质分子先伸展，然后在三种不同条件下重新折叠成具有催化活力的稳定的酶。47精选课件第一，在非天然条件下让蛋白质重新折叠，即在
28、浓盐溶液中，有机溶剂中或高温下使蛋白质重折叠。在这样条件下，蛋白质可能采纳不同于天然酶的另一种构象，这种构象仍保持催化活力，但稳定性提高。已经发现，固定化的胰蛋白酶伸展后，在50甚至更高温度下重折叠所形成的活性酶，其稳定性要比在正常温度（20-35）下折叠的酶更好。 48精选课件第二，蛋白质也可以在底物存在下重折叠，因为底物可与蛋白质多点，非共价相互作用。非极性和两性化合物最有希望达到此目的。1）底物在重折叠过程中可包埋在蛋白质的疏水核内，2）非极性和两性化合物可以加入到蛋白质中，加入的方式是，其非极性部分与蛋白质的疏水区域接触，极性或带电部分暴露于溶剂。 49精选课件第三，可用化学试剂修饰伸
29、展蛋白质，因为肽链伸展后提供了化学修饰分子内部疏水基团的可能性。然后让修饰后的伸展肽链重新在适当条件下折叠成具有某种催化活力的构象。目前这种方法仍在积极开发中。50精选课件E) 蛋白质表面基团的亲水化 蛋白质的疏水表面与水的接触在热力学上是不利的，使酶不稳定，因此，用化学修饰法降低蛋白质表面的疏水性，即实现蛋白质表面的亲水化应是稳定蛋白质的有效方法。 图4-15 苯四酸酐修饰-胰凝乳蛋白酶氨基示意图。在60时，稳定化效应提高103倍51精选课件F） 交联酶晶体用戊二醛交联酶的微晶体（1-100 m）即得到交联酶晶体（CLEC）。交联的作用是防止晶体溶解，维持晶体结构，阻止蛋白质伸展，进一步稳定蛋白质；同时加强了晶体的机械强度，使其在溶液中剧烈搅拌震动也不损坏。52精选课件
