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1、蛋白质样品制备技术蛋白质样品制备技术Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研样品制备都是关键步骤。从蛋白质组
2、大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。具有难度的。具有难度的。具有难度的。Bioinformatics, 2010-2011, Shanx
3、i Agricultural University 样品制备的原则样品制备的原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细细细细胞胞胞胞和和和和组组组组织织织织样样样样品品品品的的的的制制制制备备备备应应应应尽尽尽尽可可可可能能能能减减减减少少少少蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的降降降降解解解解，低低低低温温温温和和和和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样样样样品品品
4、品裂裂裂裂解解解解液液液液应应应应该该该该新新新新鲜鲜鲜鲜配配配配置置置置，并并并并且且且且分分分分装装装装冻冻冻冻存存存存于于于于-80 -80 -80 -80 。勿勿勿勿反反反反复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过37 37 37 37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。B
5、ioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 一、样品的类型一、样品的类型1.1.整体样品整体样品整体样品整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。取样。取样。取样。2.2.组织样品组织样品组织样品组织样品有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官官官官中抽取一定量具有代表性的样
6、品中抽取一定量具有代表性的样品中抽取一定量具有代表性的样品中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。进行实验。进行实验。进行实验。3.3.细胞样品细胞样品细胞样品细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长长长长的细胞、周期性细胞样品（如红细的细胞、周期性细胞样品（如红细的细胞、周期性细胞样品（如红细的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞、淋巴细胞、淋巴细胞、淋巴细胞）和从组织中分离同类的细胞样胞）和从组织中分离同类的细胞样胞）和从组织中分离同类的细胞样胞）和从组织中分
7、离同类的细胞样品。品。品。品。 4. 4.可溶性样品可溶性样品可溶性样品可溶性样品是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性脊液以及细胞和组织的水溶性脊液以及细胞和组织的水溶性脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。提取物。提取物。提取物。第一节第一节 样品破碎与分离蛋白质样品破碎与分离蛋白质Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎为了完全分析所有
8、的细胞内蛋白，组织与细胞为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进必须进必须进必须进行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种种种种分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器
9、组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些致某些致某些致某些蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质质质质样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品
10、应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University （一）（一）温和的裂解方法温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如通常应用于组分比较简单的样品，例如通常应用于组分比较简单的样品，例如通常应用于组分比较简单的样品，例如组织组织组织组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细
11、胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合合合合起来应用。起来应用。起来应用。起来应用。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 1. 渗透裂解渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级
12、非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象： 血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2. 2. 冻融裂解冻融裂解 许多类型的细胞可
13、以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。求为止。求为止。求为止。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural U
14、niversity 3. 3. 裂解液裂解裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：组织培养细胞组织培养细胞组织培养细胞组织培养细胞 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬
15、浮处理。悬浮处理。悬浮处理。悬浮处理。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 4.4.酶裂解酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。和裂解。和裂解。和裂解。 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮于专一性
16、酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 二、剧烈的蛋白裂解二、剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种
17、方方方方法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 1. 1. 超声裂解法超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：应用对象：应
18、用对象：应用对象：悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2.2.压力杯法压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂
19、解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。力，然后收集挤出液。力，然后收集挤
20、出液。力，然后收集挤出液。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 3.3.研磨法研磨法用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后组织或细胞通常冻存于液氮中，随后组织或细胞通常冻存于液氮中，随后组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研研研研磨成粉状，加氧化铝或砂磨成粉状，加氧化
21、铝或砂磨成粉状，加氧化铝或砂磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。有助于研磨。有助于研磨。有助于研磨。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 4. 4. 机械匀浆法机械匀浆法使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬 液。液。液。液。 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作
22、步骤：先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。过滤或离心收集。过滤或离心收集。过滤或离心收集。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 5.5.玻璃珠匀浆法玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡
23、的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置 于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入加入加入加入1-31-31-31-3克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡1min1min1min1min， 冰浴冰浴冰
24、浴冰浴1min1min1min1min。重复上述步骤。重复上述步骤。重复上述步骤。重复上述步骤。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话
25、，直接加入强变性剂。蛋白酶略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在制备。另外，许多组织蛋白酶在制备。另外，许多组织蛋白酶在制备。另外，许多组织蛋白酶在PHPHPHPH超过超过超过超过9.09.09.09.0的时候的时候的时候的时候会失活，因此在样品裂解液中出现会失活，因此在样品裂解液中出现会失活，因此在样品裂解液中出
26、现会失活，因此在样品裂解液中出现TrisTrisTrisTris、碳酸钠、碳酸钠、碳酸钠、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要
27、应用蛋白酶抑制剂。应用蛋白酶抑制剂。应用蛋白酶抑制剂。应用蛋白酶抑制剂。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University PMSF( (苯甲基磺酰氟）苯甲基磺酰氟）是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,1mmol/L,1mmol/L,1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，酶，但
28、是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTTDTTDTTDTT）或者或者或者或者 - -巯基乙醇溶液中巯基乙醇溶液中巯基乙醇溶液中巯基乙醇溶液中PMSFPMSF的抑制效果可能会的抑制效果可能会的抑制效果可能会的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。减小
29、，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 AEBSF为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L4mmol/L4mmol/L4mmol/L，作用与，作用与，作用与，作用与PMSFPMSFPMSFPMSF相似，但溶解性较好，且毒相似，但溶解性较好，且毒相似，但溶解性较好，且毒相似，但溶解性较好，且毒性低。但性低。但性低。但性低。但 是是是是AEBSFAEBSFAEBSFAEBSF可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。Bioinformatics, 2
30、010-2011, Shanxi Agricultural University 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTAEDTA） 乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（EGTAEGTA） 通常应用通常应用通常应用通常应用1mmol/L1mmol/L1mmol/L1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋
31、白酶活性。 肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（亮抑酶肽（亮抑酶肽（亮抑酶肽（leupetinleupetinleupetinleupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTTDTTDTTDTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；
32、胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A A A A（pepstatin Apepstatin Apepstatin Apepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（aprotininaprotininaprotininaprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素苯丁抑制素苯丁抑制素苯丁抑制素(bestatin)(bestatin)(bestatin)(bestatin)
33、, , , ,抑制氨基抑制氨基抑制氨基抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制剂剂剂剂A A A A在在在在PH=9PH=9PH=9PH=9的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能
34、抑制蛋白酶。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 甲苯磺酰赖氨酸甲酮（甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCKTLCK），甲苯磺酰），甲苯磺酰 苯丙氨酰氯甲酮（苯丙氨酰氯甲酮（TPCKTPCK） 通常浓度在通常浓度在通常浓度在通常浓度在0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不，这些相同的成分不，这些相同的成分不，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱
35、氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine 通常浓度为通常浓度为通常浓度为通常浓度为1-2mmol/L1-2mmol/L1-2mmol/L1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。变性剂变性剂 在低温条件下处理。在低温条件下处理。在低温条件下处理。在低温条件下处理。直接加入强变直接加入强变直接加入强变直接加入强变性剂性剂性剂性剂8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L脲、脲、脲、脲、 10101010TCATCATCATCA或或或或2 2 2 2SDSSDSSDSSDS。强碱下抑强碱下抑强碱下抑
36、强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在制酶活，许多组织蛋白酶在制酶活，许多组织蛋白酶在制酶活，许多组织蛋白酶在pHpHpHpH超过超过超过超过9.09.09.09.0的时候失活。的时候失活。的时候失活。的时候失活。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 四、蛋白质沉淀步骤四、蛋白质沉淀步骤这是一种可选择的方法。通常用于选择性这是一种可选择的方法。通常用于选择性这是一种可选择的方法。通常用于选择性这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂清除杂清除杂清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干
37、扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的的的的样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后后后后并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用并不容易重悬。因此在样品的
38、制备过程中，应用沉沉沉沉淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 （盐析）（盐析）（盐析）（盐析） 原理原理原理原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在
39、溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。 步骤：步骤：步骤：步骤：蛋白浓度大于蛋白浓度大于蛋白浓度大于蛋白浓度大于lmg/mllmg/ml，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于50mmol/L,50mmol/L,并并并并含有含有含有含有EDTA,EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min10-30min，通过，通过，通过，通过离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋
40、白。 然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰扰扰扰IEF,IEF,必须被清除。必须被清除。必须被清除。必须被清除。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University TCATCA
41、沉淀（三氯醋酸沉淀）沉淀（三氯醋酸沉淀） 这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCATCA加到提加到提加到提加到提取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达1010-20 -20 。蛋白质可于。蛋白质可于。蛋白质可于。蛋白质可于 冰上沉淀冰上沉淀冰上沉淀冰上沉淀30min30min。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用1010 -20 -20 的的的的TCATCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降进行匀浆。这种方
42、法可限制蛋白降进行匀浆。这种方法可限制蛋白降进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去淀，以除去淀，以除去淀，以除去TCATCA。 然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的全再溶。残留的全再溶。残留的全再溶。残留的TCATCA必须通过乙醇或丙酮彻底清必须通过乙醇或丙酮彻底清必须通过乙醇或丙酮彻底
43、清必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低PHPH溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。降解或修饰。降解或修饰。降解或修饰。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 丙酮沉淀丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。杂质，如去污剂、脂类。杂质，如去污剂、脂类
44、。杂质，如去污剂、脂类。 于提取物中加入至少于提取物中加入至少于提取物中加入至少于提取物中加入至少3 3倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20-20沉淀至少沉淀至少沉淀至少沉淀至少2h2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 在丙酮中用在丙酮中用TC
45、ATCA沉淀沉淀 两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用1010TCATCA在在在在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.010.01 - -巯巯巯巯基乙醇溶液或基乙醇溶液或基乙醇溶液或基乙醇溶液或20mmol/L DTT20mmol/L DTT）。至少在）。至少在）。至少在）。至少在-20-20沉淀沉淀沉淀沉淀45min45min，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含0
46、.010.01 - -巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT20mmol/L DTT 的冰丙酮清的冰丙酮清的冰丙酮清的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
47、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。 蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次
48、，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。较多。较多。较多。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋
49、白质之间的共价与非共价相互作用；使非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。剂及离液剂。第二节第二节 蛋白质裂解技术蛋白质裂解技术Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 一、裂解液一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。
50、在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。电泳分离效果的一个有力措施。电泳分离效果的一个有力措施。电泳
51、分离效果的一个有力措施。 离液剂离液剂离液剂离液剂 尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解
52、液中的浓度为8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L。尿素。尿素。尿素。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶
53、解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用度时，一般用度时，一般用度时，一般用2mol/L2mol/L2mol/L2mol/L硫脲和硫脲和硫脲和硫脲和5-8mol/L5-8mol/L5-8mol/L5-8mol/L的尿素联合使用。的尿素联合使用。的尿素联合使用。的尿素联合使用。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 还原剂还原剂还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分
54、子中CysCysCysCys残基之残基之残基之残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有还原剂有还原剂有还原剂有- - - -巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTTDTTDTT）或二）或二）或二）或二硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（DTE)DTE)DTE)DTE)和三丁基膦（和三丁基膦（和三丁基膦（和三丁基膦（TBPTBPTBPTBP）, , , ,目前常用目前常用目前常用目前常
55、用的是的是的是的是DTTDTTDTTDTT。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 去污剂去污剂去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。
56、去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDSSDSSDSSDS，非离子去污剂，非离子去污剂，非离子去污剂，非离子去污剂NP-40NP-40NP-40NP-40和和和和TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100，两性离，两性离，两性离，两性离子去污剂子去污剂子去污剂子去污剂CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或。原则上去污剂
57、应该是非离子型或。原则上去污剂应该是非离子型或。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40NP-40NP-40NP-40和和和和TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离被广泛应用。随后研究表明：兼性离被广泛应用。随后研究
58、表明：兼性离被广泛应用。随后研究表明：兼性离子去污剂子去污剂子去污剂子去污剂CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS的效果更好。的效果更好。的效果更好。的效果更好。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用
59、各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、胞器定位进行分级，如专门分
60、离出细胞核、核糖体、胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。测，
61、还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。第三节第三节 样品预分级样品预分级Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 一、亚细胞器的分离一、亚细胞器的分离 主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度 不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密 度下进行密度梯度离心，从而获得不
62、同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组 分。分。分。分。 细胞匀浆细胞匀浆细胞匀浆细胞匀浆 取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以0.9 0.9 0.9 0.9 NaClNaClNaClNaCl溶液反复溶液反复溶液反复溶液反复 清洗，加入清洗，加入清洗，加入清洗，加入SESESESE缓冲液（缓冲液（缓冲液（缓冲液（0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L蔗糖、蔗糖、蔗糖、蔗糖、1mmol/L 1mmo
63、l/L 1mmol/L 1mmol/L EDTA) EDTA) EDTA) EDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离1.1.差速离心差速离心差速离心差速离心指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小
64、的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。2.2.密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心 指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细
65、胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。 速度沉降速度沉降速度沉降速度沉降 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。不同的速度沉降。不同的速度沉降。不同的速度沉降。 等密度沉降平衡等密度沉降平衡等密度沉降平衡等
66、密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不
67、同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 二、分步裂解提取二、分步裂解提取1.1.1.1.目的与原理目的与原理目的与原理目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果
68、，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。 分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以
69、水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度
70、抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相pHpHpHpH梯度的梯度的梯度的梯度的等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2.2.2.2.方法方法方法方法 MolleyMolleyMolleyMoll
71、ey等等等等(1998)(1998)(1998)(1998)首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下： 水溶液的提取水溶液的提取水溶液的提取水溶液的提取 约约约约5-15mg5-15mg5-15mg5-15mg细胞中加入细胞中加入细胞中加入细胞中加入2ml2ml2ml2ml裂解液裂解液裂解液裂解液（40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmo
72、l/L Tris40mmol/L Tris）。）。）。）。反复冻融反复冻融反复冻融反复冻融3-43-43-43-4个循环，加入适量的个循环，加入适量的个循环，加入适量的个循环，加入适量的DNase DNase DNase DNase 和和和和RNaseARNaseARNaseARNaseA，震荡，震荡，震荡，震荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。取物。取物。取物。 含含含含Urea/CHAPS/DTTUrea/CHA
73、PS/DTTUrea/CHAPS/DTTUrea/CHAPS/DTT溶液的提取溶液的提取溶液的提取溶液的提取 向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入500ul500ul500ul500ul的裂解液的裂解液的裂解液的裂解液（8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L的的的的UreaUreaUreaUrea，4 4 4 4CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS，100mmol/L DTT,40mmol/ LTris100mmol/L DTT,40mmol/ LTris100mmol/L DTT,40mmol/ LTris100mmol/L DTT,
74、40mmol/ LTris，0.5 0.5 0.5 0.5 Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10，20ug/ml 20ug/ml 20ug/ml 20ug/ml DNase DNase 和和和和5ug/ml RNaseA5ug/ml RNaseA5ug/ml RNaseA5ug/ml RNaseA）剧）剧）剧）剧烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。烈震荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。Bioinformatics, 2
75、010-2011, Shanxi Agricultural University 含硫脲含硫脲含硫脲含硫脲/SB3-10/TBP/SB3-10/TBP/SB3-10/TBP/SB3-10/TBP溶液的提取溶液的提取溶液的提取溶液的提取 将上一步所余的沉淀用将上一步所余的沉淀用将上一步所余的沉淀用将上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris清洗后，加清洗后，加清洗后，加清洗后，加入入入入200ul200ul200ul200ul裂解液裂解液裂解液裂解液（5 mol/L Urea5 mol/L Urea5 mol/L U
76、rea5 mol/L Urea，2mol/Lthiourea2mol/Lthiourea2mol/Lthiourea2mol/Lthiourea，2 2 2 2CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS， 2 2 2 2SB3-10SB3-10SB3-10SB3-10，2mmol/L TBP, 40mmol/L 2mmol/L TBP, 40mmol/L 2mmol/L TBP, 40mmol/L 2mmol/L TBP, 40mmol/L Tris,0.5Tris,0.5Tris,0.5Tris,0.5 Pharmalyte 3-10, 20ug/ml DNase Pharmalyte 3-1
77、0, 20ug/ml DNase Pharmalyte 3-10, 20ug/ml DNase Pharmalyte 3-10, 20ug/ml DNase 和和和和5ug/ml RNase A)5ug/ml RNase A)5ug/ml RNase A)5ug/ml RNase A)剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保剧烈震荡混匀，离心后收集上清，保存于存于存于存于-70-70-70-70Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 分步提取法所采用的裂解液的溶解
78、性能是逐分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液只含有渐增加的。第一步裂解液只含有渐增加的。第一步裂解液只含有渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂步裂解液属传
79、统的裂解方法，含有表面活性剂步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS、还原剂、还原剂、还原剂、还原剂DTTDTTDTTDTT、解聚剂、解聚剂、解聚剂、解聚剂UreaUreaUreaUrea等成分，由于具等成分，由于具等成分，由于具等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能够促进疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能够促进疏水性的蛋白、第三步裂解液中添加了能够促进疏水性的蛋白、第三步裂
80、解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂SB3-10SB3-10SB3-10SB3-10、还原剂还原剂还原剂还原剂DTTDTTDTTDTT、解聚剂、解聚剂、解聚剂、解聚剂thioureathioureathioureathiourea，主要溶解偏疏水性，主要溶解偏疏水性，主要溶解偏疏水性，主要溶解偏疏水性的蛋白。的蛋白。的蛋白。的蛋白。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 细胞器蛋白质的提取细胞器蛋白质
81、的提取细胞器蛋白质的提取细胞器蛋白质的提取膜蛋白的提取与分离膜蛋白的提取与分离膜蛋白的提取与分离膜蛋白的提取与分离核蛋白的提取与分离核蛋白的提取与分离核蛋白的提取与分离核蛋白的提取与分离三、特殊蛋白质的提取三、特殊蛋白质的提取Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 第四节第四节 样品蛋白质含量测定样品蛋白质含量测定1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University n n被
82、测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)(mol)相当于被测样品相当于被测样品中氨的量中氨的量(mol)(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。含氮量。 n n因为蛋白质含氮量通常在因为
83、蛋白质含氮量通常在16%16%左右，所以将凯氏定左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数氮法测得的含氮量乘上系数6.256.25，便得到该样品的，便得到该样品的蛋白质含量。蛋白质含量。 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University n n蛋白质含有两个以上的肽键蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)(CONH)，因此有，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与双缩脲反应，在碱性溶液中，能与CuCu2+2+形成络合物。形成络合物。FolinFolin酚反应是在双缩脲反应的
84、基础上，引进酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进FolinFolin试试剂剂( (磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂) )，蛋白质，蛋白质铜络合物能还铜络合物能还原磷钼酸原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10102020倍，较双缩脲法灵敏倍，较双缩脲法灵敏100100倍。其不足之处是此反应倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。受多种因素干扰。 Folin酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)测定
85、蛋白质浓测定蛋白质浓度度 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University n n由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在收高峰在280nm280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值溶液的光吸收值(OD(OD280280) )与其含量呈正比关系，可用与其含量呈正比关系，可用作定量测定。作定量测定。n n利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简
86、利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小
87、于考马斯亮蓝总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉），二辛可宁酸、二羧基二喹啉）Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 基本原理：基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University BCA蛋白质检测流程：蛋白质检测流程：Bioinforma
88、tics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University n n考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University Coomassie Dye-Based 蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCo
89、omassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 三、三、 操作方法操作方法 1.1.标准曲线制作标准曲线制作取取1414支试管，分两组按下表平行操作。支试管，分两组按下表平行操作。试管编号试管编号01234560123456标准蛋白含量标准蛋白含量( ( g)0102030405060g)0102030405060标准蛋白溶液标准蛋白溶液(mL)00.010.020.0
90、30.040.050.06(mL)00.010.020.030.040.050.06待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液(mL)(mL)蒸馏水蒸馏水(mL)0.10.090.080.070.060.050.04(mL)0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂(mL)2.5mL(mL)2.5mL摇匀，摇匀，1h1h内以内以0 0号试管为空白对照，在号试管为空白对照，在595nm595nm处比色处比色 ODOD595nm595nm以以ODOD595nm595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。上绘制标
91、准曲线。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2.未知样品蛋白质浓度的测定测测定定方方法法同同上上，取取合合适适的的未未知知样样品品体体积积，使使其其测测定定值值在在标标准准曲曲线线的的直直线线范范围围内内，根根据据所所测测定定的的ODOD595nm595nm值值，在在标标准准曲曲线线上上查查出出其其相相当当于于标标准准蛋蛋白白的的量量，从从而而计计算出未知样品的蛋白质浓度算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)(mg/mL)。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultura
92、l University 四四. .注意事项注意事项（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离分离分离分离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备及
93、二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需中需中需中需考虑清除这些杂质。考虑清除这些杂质。考虑清除这些杂质。考虑清除这些杂质。 盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子 盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或 加以清除。加以清除。加以清除。加以清除。 通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和
94、沉淀通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀通常用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/ / / /悬浮悬浮悬浮悬浮 的方法进行脱盐处理。的方法进行脱盐处理。的方法进行脱盐处理。的方法进行脱盐处理。第五节第五节 清除影响电泳的图谱的杂质清除影响电泳的图谱的杂质Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂） 这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧
95、的聚焦不这些物质通常带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不 全。通常用全。通常用全。通常用全。通常用TCA/TCA/TCA/TCA/丙酮沉淀除去这些物质丙酮沉淀除去这些物质丙酮沉淀除去这些物质丙酮沉淀除去这些物质。 离子去污剂离子去污剂 离子去污剂，如离子去污剂，如离子去污剂，如离子去污剂，如SDSSDSSDSSDS，通常用于蛋白的提取和溶解，通常用于蛋白的提取和溶解，通常用于蛋白的提取和溶解，通常用于蛋白的提取和溶解， 但却强烈干扰但却强烈干扰但却强烈干扰但却强烈干扰IEFIEFIEFIEF。SDSSDSSDSSDS与多肽形成复合物。如果与多肽形成复合物。如果与多肽形成复合物。如果与多肽形成复合物
96、。如果SDSSDSSDSSDS 不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子不被除去，则不能正确聚焦。通常用含有兼性离子 去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含SDSSDSSDSSDS的样的样的样的样 品。通过丙酮沉淀也可以去除部分品。通过丙酮沉淀也可以去除部分品。通过丙酮沉淀也可以去除部分品。通过丙酮沉淀也可以去除部分SDSSDSSDSSDS。Bioinformatics, 2010-2011
97、, Shanxi Agricultural University 核酸（核酸（RNARNA、DNADNA）核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散；高分子质量的核酸能够阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用量的核酸能够阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用量的核酸能够阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用量的核酸能够阻滞凝胶孔径；核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，与蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，与
98、蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，与蛋白结合，从而阻碍聚焦；如果分离的蛋白通过银染检测，凝胶的核酸也将染色，导致高背景。凝胶的核酸也将染色，导致高背景。凝胶的核酸也将染色，导致高背景。凝胶的核酸也将染色，导致高背景。通常可用通常可用通常可用通常可用DNase/RNaseADNase/RNaseA混合物处理样品中的核混合物处理样品中的核混合物处理样品中的核混合物处理样品中的核酸，将其变为单或寡核苷酸。常用酸，将其变为单或寡核苷酸。常用酸，将其变为单或寡核苷酸。常用酸，将其变为单或寡核苷酸。常用0.10.1倍体积的含有倍体积的含有倍体积的含有倍体积的含有1mg/ml 1mg/ml
99、 DNaseDNase、0.25mg/ml RNaseA0.25mg/ml RNaseA的溶液和的溶液和的溶液和的溶液和50mmol/L MgCl50mmol/L MgCl2 2溶溶溶溶液在冰上孵育。液在冰上孵育。液在冰上孵育。液在冰上孵育。然而然而然而然而DNase/RNaseADNase/RNaseA也可能出现在电泳图中。也可能出现在电泳图中。也可能出现在电泳图中。也可能出现在电泳图中。超离可以除去大分子核酸，然而，也会除去高分子超离可以除去大分子核酸，然而，也会除去高分子超离可以除去大分子核酸，然而，也会除去高分子超离可以除去大分子核酸，然而，也会除去高分子量蛋白。但应用低离子强度的提取
100、液时，带负电的核酸很可量蛋白。但应用低离子强度的提取液时，带负电的核酸很可量蛋白。但应用低离子强度的提取液时，带负电的核酸很可量蛋白。但应用低离子强度的提取液时，带负电的核酸很可能与能与能与能与带正电的蛋白形成复合物。高离子强度或高带正电的蛋白形成复合物。高离子强度或高带正电的蛋白形成复合物。高离子强度或高带正电的蛋白形成复合物。高离子强度或高PHPH提取可最提取可最提取可最提取可最大大大大减少这些相互作用（注意：提取时所加的盐离子必须在后减少这些相互作用（注意：提取时所加的盐离子必须在后减少这些相互作用（注意：提取时所加的盐离子必须在后减少这些相互作用（注意：提取时所加的盐离子必须在后续续续
101、续的步骤中除去）。的步骤中除去）。的步骤中除去）。的步骤中除去）。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 多糖多糖 多糖能阻碍凝胶孔径，或导致沉淀，或延多糖能阻碍凝胶孔径，或导致沉淀，或延多糖能阻碍凝胶孔径，或导致沉淀，或延多糖能阻碍凝胶孔径，或导致沉淀，或延长聚焦时间，或出现水平条文。某些多糖含有负长聚焦时间，或出现水平条文。某些多糖含有负长聚焦时间，或出现水平条文。某些多糖含有负长聚焦时间，或出现水平条文。某些多糖含有负电荷，能与蛋白形成复合物。电荷，能与蛋白形成复合物。电荷，能与蛋白形成复合物。电荷，能与蛋白形成
102、复合物。通常用硫酸铵或苯酚通常用硫酸铵或苯酚通常用硫酸铵或苯酚通常用硫酸铵或苯酚/ /醋酸铵沉淀的方法，醋酸铵沉淀的方法，醋酸铵沉淀的方法，醋酸铵沉淀的方法，随后离心。超速离心也可除去高分子多糖。随后离心。超速离心也可除去高分子多糖。随后离心。超速离心也可除去高分子多糖。随后离心。超速离心也可除去高分子多糖。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 脂类脂类许多蛋白质，尤其是膜蛋白，可以与脂许多蛋白质，尤其是膜蛋白，可以与脂许多蛋白质，尤其是膜蛋白，可以与脂许多蛋白质，尤其是膜蛋白，可以与脂类形成复合物，这会降低其溶解性
103、，影响其等电类形成复合物，这会降低其溶解性，影响其等电类形成复合物，这会降低其溶解性，影响其等电类形成复合物，这会降低其溶解性，影响其等电点和分子量。脂类也能与去污剂形成复合物，减点和分子量。脂类也能与去污剂形成复合物，减点和分子量。脂类也能与去污剂形成复合物，减点和分子量。脂类也能与去污剂形成复合物，减低其效率。低其效率。低其效率。低其效率。通常用强变性剂和去污剂最大程度减少通常用强变性剂和去污剂最大程度减少通常用强变性剂和去污剂最大程度减少通常用强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相互作用，但可能需大量的去污剂。蛋白与脂类的相互作用，但可能需大量的去污剂。蛋白与脂类的相互作用，但可能需
104、大量的去污剂。蛋白与脂类的相互作用，但可能需大量的去污剂。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 酚类组分酚类组分苯酚通常在许多植物组织中出现，通过酶催化苯酚通常在许多植物组织中出现，通过酶催化苯酚通常在许多植物组织中出现，通过酶催化苯酚通常在许多植物组织中出现，通过酶催化 的氧化反应来修饰蛋白。的氧化反应来修饰蛋白。的氧化反应来修饰蛋白。的氧化反应来修饰蛋白。 通常在组织提取过程中应用还原剂防止苯酚的氧化。通常在组织提取过程中应用还原剂防止苯酚的氧化。通常在组织提取过程中应用还原剂防止苯酚的氧化。通常在组织提取过程中
105、应用还原剂防止苯酚的氧化。 不溶物质不溶物质在样品中的不溶物质会阻碍凝胶孔径，并且导在样品中的不溶物质会阻碍凝胶孔径，并且导在样品中的不溶物质会阻碍凝胶孔径，并且导在样品中的不溶物质会阻碍凝胶孔径，并且导致聚焦不良。通常在致聚焦不良。通常在致聚焦不良。通常在致聚焦不良。通常在IEFIEFIEFIEF前，应除去所有的不溶物质前，应除去所有的不溶物质前，应除去所有的不溶物质前，应除去所有的不溶物质Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 与本章内容出现过的部分考题与本章内容出现过的部分考题1.下列哪种方法是由于细胞内冰晶的形成导致细胞破碎的（）A.真空干燥B.酶解法C.冻融法D.渗透压法2.当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（）A增大B.减小C.先增大，后减小D.先减小，后增大3.盐析法与有机溶剂沉淀法比较，其优点是（）A.分辨率高B.变性作用小C.杂质易除D.沉淀易分离4.蛋白质的翻译后修饰主要包括。A乙酰化B糖基化C磷酸化D上述各种修饰5.TritonX-100是一种：()ACa螯合剂B蛋白酶抑制剂C去垢剂D脱氢酶抑制剂
