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1、综合化学实验综合化学实验配位化学和生物无机化学部分配位化学和生物无机化学部分切割切割DNA的金属配合物的金属配合物 指导教师：指导教师：毛宗万毛宗万 黄华珍黄华珍中山大学化学与化学工程学院中山大学化学与化学工程学院2009年年10月月实验3 功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征模板合成IR光谱表征自由基的UV光谱检测实验4 功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割琼脂糖凝胶电泳凝胶成像总学时：15 学时地点：丰盛堂218室实验内容实验内容 超螺旋超螺旋DNA 缺刻型缺刻型DNA 线型线型DNA自由基机理自由基机理自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏酯水解机理酯水解机理亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反
2、应酯水解机理优于自由基机理DNADNA结构及其断裂方式结构及其断裂方式l配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂l进一步在新的断裂处结合l断裂反应l互补链的断裂DNA的自由基断裂的自由基断裂实验背景实验背景模拟博莱霉素模拟博莱霉素 在天然物质中，由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。 导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。CuP-3A的配位结构示意图博莱霉素的活性中心博莱霉素的活性中心Pamatong, F. V.; Detm
3、er. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339.Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292.博莱霉素的模型化合物博莱霉素的模型化合物Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH氨基酸铜化合物的合成路线氨基酸铜化合物的合成路线模板反应的化学机理模板反应的化学机理化合物化合物1的红外光谱的红外光谱(COO-)(COO-)(NO2)(NO2)化合物化
4、合物2的红外光谱的红外光谱(COO-)(COO-)(NH2)氢氧自由基的形成和氢氧自由基的形成和UV光谱检测光谱检测由于罗丹明由于罗丹明B可与可与HO迅速反应，并在迅速反应，并在553nm有强有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验验HO的生成。的生成。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼根据琼溶解温度，把琼
5、脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在，溶解后在37下维持液下维持液体状态约数小时，主要用于体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外片段的回收，质粒与外源性源性DNA的快速连接等的快速连接等凝胶浓度选择凝胶浓度选择琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNADNA分离范围分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)线型线型DNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12电泳缓冲液电泳缓冲液常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸硼酸(TBE)、Tri
6、s-乙酸乙酸(TAE)、Tris-磷酸磷酸(TPE)TBE与与TPE：缓冲容量高，缓冲容量高，DNA分离效果好，但分离效果好，但TPE在在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止PCR扩增产物降解扩增产物降解核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰、二甲苯青指示剂：溴酚兰、二甲苯青溴酚兰溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移在
7、碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性率与双链线性DNA片段片段二甲苯青：二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性性DNA大致相当大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭溴化乙锭一种荧光染料，一种荧光染料，EB分子可嵌入核分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度
8、为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015min琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核染色，肉眼可见核酸电泳带，其酸电泳带，其DNA量一般量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡放入蒸馏水浸泡30min后再观察后再观察ethidium bromide，EB电泳实验装置电泳实验装置电泳仪（普通）电泳仪（普通）电泳槽（水平平板）电泳槽（水平平板）灌胶模具等灌胶模具等电泳实验方法电泳实验方
9、法洗净电泳槽，架好梳子洗净电泳槽，架好梳子配制琼脂糖凝胶及倒胶配制琼脂糖凝胶及倒胶上样与通电上样与通电结果观察结果观察配制琼脂糖凝胶及倒胶配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5TBE电泳缓冲液电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至化，冷却至60(需要时可加入需要时可加入EB)，倒入电泳槽，倒入电泳槽中，待凝固。中，待凝固。向电泳槽中倒入向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶面，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）去）
10、上样与通电上样与通电在在DNA样品中加入样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内样品孔内接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般 电泳条电泳条件为：电压件为：电压 90V，时间，时间 40min。结果观察和记录结果观察和记录紫外仪上观察电泳
11、带及其位置紫外仪上观察电泳带及其位置拍照拍照进一步使用软件对光密度进行分析进一步使用软件对光密度进行分析DNA断裂的凝胶电泳图断裂的凝胶电泳图 超螺旋超螺旋DNA 缺刻型缺刻型DNA 线型线型DNA合成实验要点合成实验要点检查回流装置是否保持干燥检查回流装置是否保持干燥硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，亮蓝色或紫蓝色为反应正常亮蓝色或紫蓝色为反应正常实验中化合物合成实验中化合物合成与与DNA断裂实验需交叉进行，断裂实验需交叉进行， DNA断断裂所
12、需的配合物由准备室提供裂所需的配合物由准备室提供若硝基还原使用了较多溶剂若硝基还原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多余，需使用旋转蒸发器除去多余溶剂溶剂凝胶电泳照相需戴手套凝胶电泳照相需戴手套l模板合成模板合成大环化合物的合成方法（大环化合物的合成方法（218室）室）l旋转蒸发器旋转蒸发器除去多余溶剂（除去多余溶剂（218室）室）l红外光谱红外光谱化合物结构表征化合物结构表征 （201室）室）l紫外可见光谱紫外可见光谱跟踪跟踪罗丹明罗丹明B与氢氧自由基的反与氢氧自由基的反应（应（204室）室）l凝胶电泳凝胶电泳切割切割DNA （210室）室）l凝胶成像分析凝胶成像分析检测检测DNA断裂断裂
13、状况（状况（210室）室）实验技术和方法实验技术和方法实验要求实验要求写好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的写好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等）特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等）实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重量、产率等）量、产率等）做好每一次测试，并打印结果做好每一次测试，并打印结果实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查对实验结果作简要讨论对实验结果作简要讨论下一次实验提交本次实验报告下一次实验提交本次实验报告遵守实验规
14、则，严禁违规操作，做好清洁值日遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日（配位化学、生物无机化学、生物技术）（配位化学、生物无机化学、生物技术）lV. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999.l计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，生物无机化学生物无机化学（第二版），中（第二版），中山大学出版社，山大学出版社，2001。l杨频，高飞编著，杨频，高飞编著，生物无机化学生物无机化学，科学出版社，科学出版社，2002。lF.奥斯伯，奥斯伯， R.布伦特，布伦特， R.E.金斯顿金斯顿 等，等， 精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南，1998年年6月第月第1版。版。参考书参考书
