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1、4.3 代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性(遗传学方法）；遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；改变细胞膜透性；工业发酵的目的工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物
2、代谢产物。大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。 在正常生理条件下在正常生理条件下 微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物能量，也不积累中间代谢产物 代谢的人工控制代谢的人工控制 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行着人们希望的方向进行 （1）对于直线式代谢途径：选育营养缺）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物陷性突变
3、株只能积累中间代谢产物 A a B b C c D d E 营养缺陷型菌株的应用营养缺陷型菌株的应用 末端产物末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物，这样才能有利于菌株积累中间产物C 。4.3.1.遗传学方法遗传学方法(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发
4、酵积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物生产中间产物A B CDEFG各图成立的条件：各图成立的条件：1. 1. 限量添加限量添加E E；2.2.限量添加限量添加E E；3.3.限量添加限量添加E E和和G G；4.4.限量添加限量添加E E和和G G；5.5.限量添加限量添加I I“”“”表示营养缺陷突变位置；表示营养缺陷突变位置；“”“”表示反馈调节解除表示反馈调节解除要根据其不同反馈控制机制 谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E E：表示反馈抑制；：表示反馈抑制；R R：表示反馈阻遏：表示反馈阻遏 高丝氨酸脱氢酶（HSDH） 天冬氨酸激酶（AK
5、) 赖氨酸生产菌赖氨酸生产菌: :高丝氨酸缺陷型 分支途径分支途径赖氨酸发酵赖氨酸发酵: :谷氨酸棒杆菌的谷氨酸棒杆菌的Hom分支途径分支途径肌苷酸发酵肌苷酸发酵（IMPIMP合成途径的代谢调控）合成途径的代谢调控）调控理论的实践应用调控理论的实践应用抗反馈控制突变株的应用抗反馈控制突变株的应用抗反馈控制突变株抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性终产物结构类似物抗性突变株突变株和和营养缺陷性回复突变株营养缺陷性回复突变株中获得。中获得。获得
6、方法及其原理：获得方法及其原理：目标产物目标产物结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸S-S-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-L-L半胱半胱氨酸氨酸-(AEC)-(AEC)苏氨酸苏氨酸 - -氨基氨基- - - -羟基戊酸羟基戊酸（AHV)AHV)异亮氨酸异亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸D-D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸营养缺陷型回复突变株营养缺陷型回复突变株 调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；一
7、是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。 如果前者发生回复突变，则又有两种可能性如果前者发生回复突变，则又有两种可能性另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。营养缺陷型回复突变营养缺陷型回复突变 选育组成型突变株和超产突变株选育组成型突变株和超产突变株如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或
8、操纵基因突变，从而造成不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。突变株称为超产突变株。组成型突变株组成型突变株 结构基因不受控制地转录，酶的结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被生成将不再需要诱导剂或不再被末端
9、产物或分解代谢物阻遏。末端产物或分解代谢物阻遏。 调节基因发生突变调节基因发生突变产生无效的阻遏物而不产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合能与操纵基因结合操纵基因突变操纵基因突变突变操纵基因不突变操纵基因不能与阻遏物结合能与阻遏物结合组成型突变组成型突变 DA B C E F生物化学方法生物化学方法1. 1. 添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生(-)(-)(-)2. 2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，不是该酶的底物，而是
10、底物的衍生物，3. 3. 发酵与分离过程耦合：发酵与分离过程耦合：4. 4. 控制发酵的培养基成分：控制发酵的培养基成分：控制细胞膜渗透性控制细胞膜渗透性使胞内的代谢产物迅速渗漏出去使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。解除末端产物的反馈抑制。 (1). 用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如如: 在在Glu发发酵酵中中把把生生物物素素浓浓度度控控制制在在亚亚适适量量可可大大量量分分泌泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用适量
11、添加青霉素的方法；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；再再如如：产产氨氨短短杆杆菌菌的的核核苷苷酸酸发发酵酵中中控控制制因因素素是是Mn2+； Mn2+的的作用与生物素相似。作用与生物素相似。(2). 利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用用谷谷氨氨酸酸生生产产菌菌的的油油酸酸缺缺陷陷型型，培培养养过过程程中中，有有限限制制地地添添加加油油酸酸，合合成成有有缺缺损损的的膜膜，使使细细胞胞膜膜发发生生渗渗漏漏而而提提高高谷谷氨氨酸酸产量。产量。甘甘油油缺缺陷陷型型菌菌株株的的细细胞胞膜膜中中磷磷脂脂含含量量比比野野生生型型菌菌株株低
12、低，易易造造成成谷谷氨氨酸酸大大量量渗渗漏漏。应应用用甘甘油油缺缺陷陷型型菌菌株株，就就是是在在生生物物素素或或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的通透性控制细胞膜的通透性生物素是脂肪酸生物合成中乙酰生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoACoA羧化酶的辅羧化酶的辅基，该酶催化乙酰基，该酶催化乙酰CoACoA的羧化生成丙二酸单酰的羧化生成丙二酸单酰CoACoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸 只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到
13、代谢产物的分泌。进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。 甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株 添加适量的青霉素添加适量的青霉素 油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株 5、微生物次级代谢与次级代谢产物5.1、次级代谢与次级代谢产物一类与生物生存有关的、涉及到产能代谢和耗能代谢的代谢类型，普遍存在于一切生物中。初级代谢：微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢。某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存的方式。通过次级代谢合成的
14、产物通常称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。次级代谢：初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢系统、代谢途径和初级代谢产物在各类生物中基本相同。它是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型。(1)(1)存在范围及产物类型不同存在范围及产物类型不同象病毒这类非细胞生物虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们象病毒这类非细胞生物虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的初级代谢过程的能力。初级代谢过
15、程的能力。次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。例如某些青霉、芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成例如某些青霉、芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成青霉素、杆菌肽和柠檬酸等次级代谢产物。青霉素、杆菌肽和柠檬酸等次级代谢产物。不同的微生物可产生不同的初级代谢产物不同的微生物可产生不同的初级代谢产物相同的微生物在不同条件下产生不同的
16、初级代谢产物相同的微生物在不同条件下产生不同的初级代谢产物用于青霉菌的二种培养基：用于青霉菌的二种培养基：RaulinRaulin培养基：培养基：葡萄糖葡萄糖5%5%、酒石酸、酒石酸0.27%0.27%、酒石酸铵、酒石酸铵0.27%0.27%、磷酸氢二铵、磷酸氢二铵0.04%0.04%、硫酸镁、硫酸镁0.027%0.027%硫酸铵硫酸铵0.017%0.017%、硫酸锌、硫酸锌0.005%0.005%、硫酸亚铁、硫酸亚铁0.005%0.005%CzapekDoxCzapekDox培养基：培养基：葡萄糖葡萄糖5%5%、硝酸纳、硝酸纳0.2%0.2%、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾0.1%0.1%、氯化钾、
17、氯化钾0.05%0.05%、硫酸、硫酸镁镁0.05%0.05%、硫酸亚铁、硫酸亚铁0.001%0.001%灰黄青素在灰黄青素在CzapekDoxCzapekDox培养基上培养时可以合成灰黄霉素，培养基上培养时可以合成灰黄霉素，在在RaulinRaulin培养基上培养时则合成褐菌素（培养基上培养时则合成褐菌素（fulvic acidfulvic acid）；）；Penicillium urticaePenicillium urticae在含有在含有0.5100.510-8-8M M的锌离子的的锌离子的CzapekCzapekDoxDox培培养基里培养时合成的主要次级代谢产物是养基里培养时合成的主
18、要次级代谢产物是6-6-氨基水杨酸，但在含氨基水杨酸，但在含0.5100.510-6-6M M的锌离子的的锌离子的CzapekDoxCzapekDox培养基里培养时不合成培养基里培养时不合成6-6-氨氨基水杨酸，但可以合成大量的龙胆醇、甲基醌醇和棒曲霉素。基水杨酸，但可以合成大量的龙胆醇、甲基醌醇和棒曲霉素。产黄青霉在在产黄青霉在在RaulinRaulin中培养时可以合成青霉酸。但在中培养时可以合成青霉酸。但在CzapekCzapekDoxDox中培养则不产青霉酸。中培养则不产青霉酸。次级代谢产物虽然也是从少数几种初级代谢过程中产生的中间体次级代谢产物虽然也是从少数几种初级代谢过程中产生的中间
19、体或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小变化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在产物氧化水平上的变化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在产物氧化水平上的微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物，并且每种类微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物，并且每种类型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混合物。例如，目前已知的新霉素有合物。例如，目前已知的新霉素有4 4种，杆菌肽、多粘菌素分别有种，杆菌肽、多粘菌素分别有有有1010多种，而放线菌素有多
20、种，而放线菌素有2020多种等。多种等。初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢与初级代谢的关系：1 1、存在范围及产物类型不同、存在范围及产物类型不同2 2、对产生者自身的重要性不同、对产生者自身的重要性不同初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖、以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖、脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导合成过程的某个环节
21、上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导致机体发生突变或死亡。致机体发生突变或死亡。次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机体生长与繁殖所必需的物质，也有人把超出生理需求的过量初级体生长与繁殖所必
22、需的物质，也有人把超出生理需求的过量初级代谢产物也看作是次级代谢产物。代谢产物也看作是次级代谢产物。次级代谢产物通常都分泌到胞外，有些与机体的分化有一定的关次级代谢产物通常都分泌到胞外，有些与机体的分化有一定的关系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响。许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响。初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢与初级代谢的关系：(1)(1)、存在范围及产物类型不同、存在范围及产物类型不同(2)(2)、对产生者自身的重要性不同、对产生者自身的重要性不同(3)(3)
23、、同微生物生长过程的关系明显不同、同微生物生长过程的关系明显不同初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。的时期。初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢与初级代谢的关
24、系：(1)(1)、存在范围及产物类型不同、存在范围及产物类型不同(2)(2)、对产生者自身的重要性不同、对产生者自身的重要性不同(3)(3)、同微生物生长过程的关系明显不同、同微生物生长过程的关系明显不同(4)(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。境条件变化而停止。初级代谢与初级代谢的关系：初级代
25、谢与初级代谢的关系：1 1、存在范围及产物类型不同、存在范围及产物类型不同2 2、对产生者自身的重要性不同、对产生者自身的重要性不同3 3、同微生物生长过程的关系明显不同、同微生物生长过程的关系明显不同4 4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同(5)(5)、相关酶的专一性不同、相关酶的专一性不同相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往
26、往可以导致机体合成不同的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物，类型的次级代谢产物，另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，这些酶通常因环境条件变化而不能合成。这些酶通常因环境条件变化而不能合成。初级代谢与初级代谢的关系：初级代谢与初级代谢的关系：(1)(1)、存在范围及产物类型不同
27、、存在范围及产物类型不同(2)(2)、对产生者自身的重要性不同、对产生者自身的重要性不同(3)(3)、同微生物生长过程的关系明显不同、同微生物生长过程的关系明显不同(4)(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同(5)(5)、相关酶的专一性不同、相关酶的专一性不同(6)(6)某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；前体物和所需要的能量；初级代谢产物合成中的关键
28、性中间体也是次级代谢产物合成中初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质。的重要中间体物质。而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。生的毒害作用。二、二、 次级代谢的调节次级代谢的调节 1 1、初级代谢对次级代谢的调节、初级代谢对次级代谢的调节2 2、碳、氮代谢物的调节、碳、氮代谢物的调节3 3、诱导作用及产物的反馈抑制、诱导作用及产物的反馈抑制青霉素合成受赖氨酸抑制，共同前体：青霉素合成受赖氨酸抑制，共同前体：NHNH4 4+ +浓度高降低谷氨酰胺酶活性，对抗生素的生产不利浓度高降低谷氨酰胺酶活性，对抗生素的生产不利硝酸盐促进利福霉素的合成硝酸盐促进利福霉素的合成快速利用碳源快速利用碳源
