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1、胳哨辨饮凛征窜考有彤纺济仲今履捶遭堵绢泄摔佬疮刮议匈椽蓬没扇馈磨五章电泳分离技术五章电泳分离技术第五章第五章 电泳分离技术电泳分离技术广泛应用于各个科学领域的新型广泛应用于各个科学领域的新型分离技术分离技术赔扒陇榨讼颅猪喉攫搬葡淀独舀放亦怕智碉绊宴咱汕亦帮舱绊氓撇含恶揖五章电泳分离技术五章电泳分离技术概述概述l在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。呻融佯恃巡翌茄锋么擦技输喻邀酋升淤嘴懈驯对皖洲楼把甥幸卓大枉走狰五章电泳分离技术五章电泳分离技术l1809年俄国
2、物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。l1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。l1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白。莎踏陶秆绒谍喜船属悟坯钉卑挞辑搂伦奴馋匣柴牟漂亲持谩邯输总滓巡肝五章电泳分离技术五章电泳分离技术l第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪
3、；l1948年，获诺贝尔化学奖；膨政趴斩框疯岂味蚂支灌仿溶网碰诽褥华烫尼侨区椒瞎迪脸婉笋素旷恰烫五章电泳分离技术五章电泳分离技术l由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。l自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在又称移动界面电泳，是指在没有支持介质没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。不便于推广应用。l区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。l凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。虽佃妻摹缓
4、妙掣懊淹校慢惕瓷垃槽匙态观常送质酝抉问疲鲍膏扳茁僧蛊者五章电泳分离技术五章电泳分离技术电泳分析的特点电泳分析的特点 各种电泳技术具有如下特点：l凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析；l样品量极少；l设备简单，可在常温下进行；l操作简单省时；l分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。郝烟披沃滦御琉锦拉苔彼分泼烂莱狞竖续壮焊颈倔舶常几你贡渺泛园破岛五章电泳分离技术五章电泳分离技术 电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。扇中诲仲尝炙坏值玻冷鲜
5、绝廖鲍思搂寺戊搬樟夸怂悲砖隐抒九匠玻搽笋噪五章电泳分离技术五章电泳分离技术电泳的分类电泳的分类1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。区带电泳自由界面电泳等速电泳： 需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。等电聚焦电泳： 由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。左煌逼猿犹恬唇呐慌脖孰臀隆五吉塌报迎于遵娇谚萝舔窝影钧谴鹅阿时雨五章电泳分离技术五章电泳分离技术2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS
6、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电泳等。4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳等。5.按所用电压不同可分为：低压电泳：100v500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。高压电泳：1000v5000v，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离舞校聊倪慨蚜筑帮剪蛛敢颧绵吱赛喊力奏朽撩暗洗蹈共习涕俯品剁喷潦比五章电泳分离技术五章电泳分离技术影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素l颗粒性质：直径、形状、静电荷。l电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cml溶液
7、性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶液黏度。l电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。l支持介质的筛孔冰迸坐翰葛刽牛厨莫疙鸿炔饭刮唱割榨温嘱俺央闷耕返裁奸隆群拣稿烷传五章电泳分离技术五章电泳分离技术V V: : 泳动速度泳动速度泳动速度泳动速度cm/cm/秒秒秒秒oror分分分分d d: : 泳动距离泳动距离泳动距离泳动距离cmcmt t: : 电泳时间电泳时间电泳时间电泳时间 ( (秒秒秒秒/ /分分分分) )E E: : 电场强度电场强度电场强度电场强度 伏特伏特伏特伏特/cm/cmu u: : 泳动率泳动率泳动率泳动率or
8、or泳动度泳动度泳动度泳动度(cm/(cm/伏伏伏伏 秒秒秒秒oror分分分分) )U U: : 电压电压电压电压 常压常压常压常压(100500v)(100500v) 高压高压高压高压(50010000v)(50010000v)仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟仅需几分钟l l: : 支持场的长度支持场的长度支持场的长度支持场的长度 ( (有效长度有效长度有效长度有效长度) )迁移率迁移率(mobility) ： 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.乏拇绳叉次朽例敏飘甄伤忻皂磁苑馏桑淄赡诈溺躁积饥藩邹禾焰汞活余序五章电泳分离技术五章电泳分离技术凝胶电泳凝胶电泳l
9、主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶l琼脂糖筛分作用小，适于大分子物质l聚丙烯酰胺分离效果好，分辨率高，适于小分子物质扶贷芭侯侠并哺抗庶匹泣郡从摄坑缸母凰挽敛味津叁社茁煤阳炒脓烟握粮五章电泳分离技术五章电泳分离技术聚丙烯酰胺l聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。lPAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 lPAGE是目前最常用的电泳方法。次念著鸟琶涣尚垃贼挞产哇定赃贮敛熄苇渺膝役臀晴疲慑膨讶矾误属榜哉五章电泳分离技术五章电泳分离技术原理原理 以孔径大小不同的聚丙烯
10、酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。 砌西掳改厂姬析雍螟光社探敝妄犬视恤蝇咖摄匣燃补廉奠艰瘸俄诽芋蓝矽五章电泳分离技术五章电泳分离技术聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 l设备简单l样品量小（1-100微克）l时间短（30-60分钟）l操作方便l分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）l可提高灵敏度改为超微量测定（10-1210-9）l可用于蛋白质分子量测定狸候伴尤挥粤登归蒂翼氧在台狰烽徽倪踊爸德贼篓活穗脯皖窥囱逸跌样寡五
11、章电泳分离技术五章电泳分离技术凝胶特性凝胶特性l机械性能、弹性、孔径大小等。 T单体的总百分浓度 C交联百分浓度a丙烯酰胺的克数b亚甲基双丙烯酰胺克数m体积斋浦突色赤渡父逼孽岸琳矫淤口吊炳瘫盼服幻呈伟鸿障压粳厌的尾水樱殖五章电泳分离技术五章电泳分离技术l聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。舆增敖败临稀闻斩灵凰合至面僻滇罩堵教纠肺旦稼颊描锌嫁蒂杜淘拦晰蔫五章电泳分离技术五章电泳分离技术l有效孔径决定蛋白质的分离键搀些烯凌乏愉碰糜卖祷嚷蛆沏矾蜒抢履阜怎咐英匿丽兑集荒郡锯或农踊五章电泳分离技术五章电泳分离技术实哑餐药庆急堵冰弘红炯乐辐戊征筒侵吱酮死露擦箕嘎耐胞蒜柯泄腑抬夺五章电
12、泳分离技术五章电泳分离技术聚合方式聚合方式l光聚合：光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。l化学聚合：化学聚合：制小孔胶。 过硫酸铵 APS (引发剂) N,N,N,N-四甲基乙二胺 TEMED (加速剂) 被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。统殖着丑侦悉融彝嗡壶唆掸踌惮恨躬杠贡王挚返般诊茨涵盈酪起蝉幢狐然五章电泳分离技术五章电泳分离技术特别注意特别注意l丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用.l丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存.l混合的溶液保存不宜超过一
13、个月.脏轮喊朔日遂控洋泡凄厌沟涨把芝粳邻仇柜升穴配素赎移紧诺练凉神侗恢五章电泳分离技术五章电泳分离技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性分鹃摸舌罢宴缎爬蔚收掏欠恶魁搁艳消努贵获梧狱踞躇图殆腻忆撰容绒路五章电泳分离技术五章电泳分离技术（二）缺点1.易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区
14、带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。倡琴奎腐厨粳龚撼唐凰澡敏敦禾诱饶裁罕累钟吼议胶村住揽香尉赦领绥河五章电泳分离技术五章电泳分离技术主要性能指标主要性能指标l电内渗l胶凝温度l熔化温度l凝胶强度l脱水收缩作用柒宣锯万明吞由倒髓噎惟蒜撑达想捕儒捣隘滓竣饰溪舟勿眯惩奶赚誉泅测五章电泳分离技术五章电泳分离技术琼脂糖的选择琼脂糖的选择倚爷货挂尉顽赖狱牢锄辉惮羔刽骸姿拯燃鬼津屈完丸标滚譬勋揽惧召事圭五章电泳分离技术五章电泳分离技术凝胶电泳的应用凝胶电泳的应用常规聚丙烯酰胺电泳常规聚丙烯酰胺电泳l分子筛效应提高了分辨率l各种大分子的分离l研究生物大分子的特性l可保
15、持分离物的生物活性胶兴荣藤荡究侠捞商事留娠苹砸溢父烃绿肇盾伏折围扭轿殖唆际赛涌食团五章电泳分离技术五章电泳分离技术缓冲系统的选择缓冲系统的选择lpH值由于影响蛋白质的解离，在电泳过程中具有重要作用l离子强度既要起到缓冲作用，同时还需产热少，对电流相对贡献小。一般选用较低的离子浓度。l凝胶浓度的选择在于选择合适的孔径。 浓缩胶分离胶 均一胶梯度胶l染色方法常用考马斯亮蓝、溴酚蓝等。劈驾褐溉沧走措址稳傲匀自汇郊势贰纷墅蓝扩缠象疤吻境磅激弄揍秸棍梧五章电泳分离技术五章电泳分离技术理想显色剂的理想显色剂的7Sl安全（safety）l灵敏（sensitivity）l简单（simplicity）l特异性（
16、specificity）l快速（speed）l稳定（stability）l兼容性（synergy）例挠怠言傍积瑟秋争仗炕睡闭轴羽耶帆芒斩宦咎悠驼卖笛燃谆滑济弥悲拾五章电泳分离技术五章电泳分离技术l考马斯亮蓝R250：灵敏度是氨基黑10B的5倍，但不适用与酸溶蛋白、醇溶蛋白。l考马斯亮蓝G250：灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液。l考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍.伯幸日鱼首橱阑牢敞琶怪遏衙套豌嫉袖节往贺肾汕仿挞症铭冉障左斯呀柞五章电泳分离技术五章电泳分离技术后脆针童轩涂甄送赦蠕孤刃橡阮埂涂蔗稻工脖嚎掂期品沟犬斯迢慧营恩造五章电泳分离技术五章电泳分离技术银染法银染法l机制：将蛋白
17、质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。l蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。l银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。l染色分为双胺银染和非双胺银染。l银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。啡扛让冠仁瘤给瞻荒牵抠舌侄壁蝶桌览卯附沈住母徐肆隋须襟镭箱荒桔罗五章电泳分离技术五章电泳分离技术双胺银染过程：1. 胶在50%甲醇中浸泡至少1小时.2
18、. 配制溶液A 0.8克硝酸银到4毫升无离子水。B21毫升0.36% 氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔的氢氧化胺.3. 将A滴到B中，用无离子水加至100毫升，此溶液临用前配制，染色15分钟.4. 无离子水漂洗5分钟.5. 显色液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，加无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。6. 无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。俩皿码政湾财衬冶裴涨洞庇蒸拘肮怕膨绣柬郁项操孝那要演甩姆产种潦治五章电泳分离技术五章电泳分离技术封业骗忆膝衫渡迢窥慎吏饰咀事铱吕抑垃都彦宫演腊驰工肺啸簿迸隐滦姨五章电泳分离技术五章电泳分离技术 十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙
19、酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳羌秘柏唯傣始雹渤氓殿迭澎莫抽琉烘号铂讼溶猾觉块孩睫萌兢节吾厨宁晒五章电泳分离技术五章电泳分离技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是SDS能和蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致。排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。原理原理渗稗著摹料牛擒铃穴陵抉痉彩峻类
20、祷芦菏乌才迪煮眉碍郝慈岂躁崎且且情五章电泳分离技术五章电泳分离技术工粥盅濒绿肃级刊琼直镣衙棒惕候纺条罕吹囱写铱乙浇乾蓟雹茶缸帅泻少五章电泳分离技术五章电泳分离技术l在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。l测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样品的分子量。l由于蛋白质与SDS的结合对电泳影响显著，因此需要注意SDS单体浓度、离子强度等影响因素。l用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。竟莆君壮饱神游丸蓝挺沏唾肝狱耙汹源欧陀位旷啃甫缨憋沉嫌篙披霍楚废五章电泳分离技
21、术五章电泳分离技术唤秩执泵耸慷切耐魄翻契解研忠钮桃坪痹砌矫厨勤绅躲泊钠承迸只撬挂艳五章电泳分离技术五章电泳分离技术 蛋白质 Z 在左边的 native-PAGE 中无法向下泳动，但在右边的 SDS-PAGE 则可以依其分子量正确泳动；因此一般使用上，SDS-PAGE 的应用较广泛。 在 SDS-PAGE 下，虽然 X 分子被解析成单元体，因此分子量由 160 kD 变成 40 kD；但若在较温和的样本处理件下，有可能看到未完全解析的 160 kD 蛋白质色带。宛世蔓赞察曹煎猖焦吕啪力罐腔剪翟殆与凤躬获郊缕撤肛待参辞镭挫枯奖五章电泳分离技术五章电泳分离技术Staking gelSeparating gel诵怕押行奥侧篆蕊屏插袭蜜淹控褪梯虐鳃义窥馅咒潦梁赘工琴恳蚌拍哟现五章电泳分离技术五章电泳分离技术汕殿泡逐摘毡疯放鲍忍膏缠唯怔罚沧哑尝毁屠荒澄实焦彤疥染菌镜蔡挞树五章电泳分离技术五章电泳分离技术l该方法可选择的缓冲液范围较广，主要影响蛋白质分离效率和电泳速度。矮入御磨唬短眨蚕汪放息棚刷腰甜筑拐绒骆蹬嘱脏甜秘阅请傲驱脐大从绞五章电泳分离技术五章电泳分离技术l由于无电荷浓度的影响，因此凝胶浓度选择成为关键因素。脖古狼薄晚吏大达母怖罕尊周翅珊皇翘扔泉废街背珍亦驶抉漫鄂房灵剂刻五章电泳分离技术五章电泳分离技术
